液相色譜在中藥分析中的應(yīng)用

液相色譜在中藥分析中的應(yīng)用摘要液相色譜法的發(fā)展非常迅猛，許許多多的新方法不斷涌現(xiàn)，它具有分離效率高，選擇性好，分析速度快，操作自動(dòng)化和應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn)。本文主要簡單介紹液相色譜的知識(shí)及其在藥物分析中的廣泛應(yīng)用，通過實(shí)例描述了液相色譜法的優(yōu)點(diǎn)。液相色譜(HPLC)是結(jié)合經(jīng)典液相色譜及氣相色譜的分離原理。由于與氣相色譜法相比，液相色譜法具有下列主要優(yōu)點(diǎn)：①不受試樣的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，應(yīng)用范圍廣②可選用不同性質(zhì)的各種溶劑作為流動(dòng)相，而且流動(dòng)相對分離的選擇性有很大作用，因此分離選擇性高；③一般在室溫條件下進(jìn)行分離，不需要高柱溫。因而廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)，生物醫(yī)學(xué)，石油化工，合成化學(xué)，環(huán)境監(jiān)測，食品衛(wèi)生，以及商檢，法檢和質(zhì)檢等許多分析檢驗(yàn)部門。液相色譜不僅僅是一種有力的分析工具，而且越益成為分離制備和純化的手段。液相色譜在國內(nèi)和國外已被廣泛地應(yīng)用于藥物分析，尤其在我國，近十幾年來HPLC方法越來越受到重視。中國藥典1985年版才規(guī)定使用，該版只有8個(gè)品種規(guī)定使用HPLC方法檢測，到了1995版達(dá)到113個(gè)品種，2000版藥典的應(yīng)用達(dá)到了282種，2005版僅藥典一部的應(yīng)用達(dá)到了479種，涉及518項(xiàng)；藥典二部中采用液相色譜法的品種有848種，較2000年版增加了566次，其中復(fù)方制劑、雜質(zhì)或輔料干擾因素多的品種多采用液相色譜法。2010年藥典則更多的用液相色譜法取代了某些藥物含量測定的薄層法，并引入了各式各樣的檢測器。由此可見，我國液相色譜法在藥物分析中的重要性。關(guān)鍵詞：液相色譜；氣相色譜；藥物分析1液相色譜的簡介液相色譜簡稱HPLC，又稱高速或高壓液相色譜。該法吸收了普通液相層析和氣相色譜的優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)過適當(dāng)改進(jìn)發(fā)展起來的，既有普通液相層析的功能，又有氣相色譜的特點(diǎn)(即高壓，高速，高分辨和高靈敏度)。HPLC是近年來迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)新穎的分離技術(shù)，不僅適用于很多不易揮發(fā)，難熱分解物質(zhì)(如蛋白質(zhì)，肽類，氨基酸及其衍生物等)的定性定量分析，而且也適用于上述物質(zhì)的制備和分離。HPLC法由于兼?zhèn)湟合嗪蜌庀鄡煞N色譜分析方法的優(yōu)點(diǎn)，近年來在食品檢測和分析上應(yīng)用并飛速發(fā)展。1.1HPLC與氣相柱色譜法(GC)相比較，主要有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢：GC的分析對象僅限于蒸汽壓低、沸點(diǎn)低的樣品(僅占有機(jī)物總數(shù)的20%)，不適于分析高沸點(diǎn)有機(jī)物、高分子化合物、熱穩(wěn)定性差的有機(jī)物及生物活性物質(zhì)。而HPLC不受此限制，能對80%的有機(jī)物進(jìn)行分離與分析。GC流動(dòng)相為惰性氣體，不能與待測組分發(fā)生作用。HPLC流動(dòng)相選擇余地大，可與待測組分發(fā)生作用，而且通過改變流動(dòng)相的組成，可改善分離的選擇性(相當(dāng)于增加了一個(gè)控制和改進(jìn)分離條件的參數(shù))。GC通常在高溫下進(jìn)行，HPLC可以室溫下進(jìn)行分離與分析。(4)非破壞性檢測器在HPLC中的使用，可使樣品回收(特別是少量珍貴樣品)或樣品的純化制備成為可能。1.2HPLC的特點(diǎn)分離效能高。由于微粒固定相的使用，使理論塔板數(shù)可達(dá)到103?104塊/m，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于GC的103左右(填充柱)。選擇性高。因?yàn)榱鲃?dòng)相可與樣品組分發(fā)生相互作用，所以，通過改變流動(dòng)相的組成，可以達(dá)到控制和改善分離過程選擇性的目的。因此，HPLC不僅可以分析不同類型的有機(jī)物及其同分異構(gòu)體，而且已在合成藥物和生化藥物的生產(chǎn)與控制分析中發(fā)揮了重要作用。檢測靈敏度高。HPLC中應(yīng)用的檢測器大多數(shù)都有較高的靈敏度。高壓輸液泵的使用，使HPLC分析一個(gè)樣品僅需幾分鐘至幾十分鐘。[2]1.3HPLC的局限性在HPLC中，所用流動(dòng)相不止一種(多種)，因此其分析成本高，且易起環(huán)境污染；當(dāng)進(jìn)行“梯度洗脫”操作時(shí)(相當(dāng)于GC中的程序升溫技術(shù))，比GC的程度升溫操作要復(fù)雜的多；HPLC目前還缺少像GC中的通用型檢測器(如TCD、FID)HPLC不能替代GC。當(dāng)要求柱效高達(dá)10萬塊理論塔板數(shù)以上時(shí)，只能用GC中的毛細(xì)管色譜柱;（4）在200kPa?1Mpa柱壓下易分解、變性的生物活性的生化樣品，不易用HPLC分析。1.4液相色譜儀HPLC儀器的工作過程為：高壓泵將貯液器（或槽、罐）中的流動(dòng)相溶劑經(jīng)進(jìn)樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出（通常要回收）。當(dāng)注入待測樣品時(shí)，流經(jīng)進(jìn)樣器的流動(dòng)相將樣品各組分帶入色譜柱中進(jìn)行分離，分離后的各組分依一定的順序進(jìn)入檢測器，檢測器產(chǎn)生的信號由記錄儀記錄下來，最后形成液相色譜圖。1.4.1高壓輸液泵這是HPLC儀器中的著急部件之一。它一般由貯液器、高壓輸液泵、過濾器等組成。高壓輸液泵應(yīng)該具備密封性好、輸出流量恒定、壓力平穩(wěn)、可調(diào)范圍寬、便于更換溶劑及耐腐蝕等條件。常用的輸液泵有恒流泵和恒壓泵兩種，而恒流泵用的較多（因?yàn)樗妮敵隽髁磕苁冀K保持恒定，與色譜柱引起的阻力大小無關(guān)），而恒壓泵用的較少。恒流泵又分為機(jī)械注射泵和機(jī)械往復(fù)泵，后者用的最多。1.4.2進(jìn)樣系統(tǒng)由于HPLC色譜柱比GC色譜柱短的多（約5?30cm），所以，引起色譜峰峰形變寬的因素以柱外因素為主（即：進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在的死體積）。而柱外展寬（色譜柱外因素引起的峰形變寬）又分柱前和柱后展寬，以進(jìn)樣系統(tǒng)所引起的柱前展寬為主要因素1.4.3分離系統(tǒng)色譜柱是其核心部件之一。通常用64?5mm，5?30cm長度的不銹鋼管作高壓色譜柱，內(nèi)裝5?10^m的全多孔型微粒固定相。1.4.4檢測系統(tǒng)用于HPLC儀的檢測器有兩類，一類是溶質(zhì)型檢測器，它僅對被測組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于此類的有：紫外、熒光及電化學(xué)檢測器等。另一類是總體檢測器，它是對試樣及洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于此類的有：示差折光、電導(dǎo)等檢測器。在實(shí)際工作中，應(yīng)根據(jù)具體情況來選擇適宜的檢測器。而在HPLC儀器的常規(guī)分析中，紫外檢測器用的最多。除了這四大部分之外，還有一些附屬的（有的甚至是不可缺少的）部件，如：脫氣、梯度淋洗、自動(dòng)進(jìn)樣、恒溫、餾分收集及數(shù)據(jù)處理等裝置。2.液相色譜在藥物分析中的應(yīng)用液相色譜在藥物分析中的應(yīng)用范圍越來越廣，液相色譜由于具有高選擇性、高靈敏度，并可同時(shí)用于有關(guān)物質(zhì)檢查與含量測定的特點(diǎn)，已成為醫(yī)藥研究的有力工具。如在中草藥有效成分的分離和純度測定、人工合成藥物成分的定性和定量測定、新型手性藥物中手性對映體含量的測定以及藥物代謝物的測定等方面都需要用到HPLC的不同測定方法予以解決。而目前液相色譜的蒸發(fā)光散射檢測器的應(yīng)用更體現(xiàn)了它在藥物分析中的重要地位。2.1天然藥物分析天然藥物的來源有動(dòng)物、植物和礦物之分，其中以植物類為主。由于天然藥物的化學(xué)成分復(fù)雜，其有效成分，可能有一個(gè)，也可以有多個(gè)，這對于控制藥品質(zhì)量，建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來說比較困難，HPLC可通過對天然藥物的有效成分進(jìn)行分離鑒定，再測定有效成分的含量；通過指紋圖譜建立識(shí)別模式，可以判定藥材的質(zhì)量高低。2.2天然藥物及復(fù)方成藥分析復(fù)方制劑、雜質(zhì)或輔料干擾因素多的品種多采用液相色譜法。增免扶正片系由當(dāng)歸、黨參、黃芪等十幾味天然藥物精制而成，具有益氣生津、活血養(yǎng)血、滋補(bǔ)肝腎、健脾開胃之功效，主要用于抗缺氧、抗疲勞、抗衰老，長期服用可扶正祛邪，提高機(jī)體免疫功能，健身強(qiáng)體，益壽延年。該藥對心、肝、脾、腎虛、納差、心腦血管疾病、神經(jīng)衰弱、慢性肝炎、脂肪肝等都有較好的防治作用。由于化學(xué)藥品的開發(fā)費(fèi)用昂貴，而且毒副作用大，近年來人們已把目光轉(zhuǎn)向自然、民族傳統(tǒng)醫(yī)藥、草藥、植物藥等天然藥物，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，當(dāng)前全世界60多億人口中80%的人使用過天然醫(yī)藥。在全世界藥品市場中，天然物質(zhì)制成的藥品已占30%，國際上植物藥市場份額已達(dá)300億美元，且每年以20%以上的速度增長。HPLC分析必定能為我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代化，走向世界提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。2.3抗生素分析抗生素是由微生物或其他方法產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)，在高度稀釋的情況下仍具有抑制或殺滅其他微生物的性能。抗生素的分離、分析和定量測定是藥物分析中較困難的領(lǐng)域。采用較多的方法是微生物法、分光光度法和化學(xué)方法，但所需時(shí)間較長、專一性較差。HPLC分析技術(shù)近年來在抗生素的質(zhì)量控制中已廣泛應(yīng)用。對結(jié)構(gòu)、組分等較清楚的藥物，HPLC分析將逐步取代傳統(tǒng)的生物測定。目前，各國藥典中應(yīng)用HPLC技術(shù)對抗生素進(jìn)行質(zhì)量控制的項(xiàng)目包括鑒別、組分分析、含量測定和相關(guān)物質(zhì)測定等。2.4手性藥物分析在生物體內(nèi)，幾乎所有具有重要生理意義的有機(jī)生物分子都有手性(chirality)，絕大多數(shù)都是旋光性物質(zhì)。兩種化學(xué)組成、分子式完全相同的化合物，但因組成化合物的原子在空間取向不同，而成為鏡像的化合物，稱為手性化合物。由于對映體的物理、化學(xué)性質(zhì)相同，實(shí)現(xiàn)它們的分離就比較困難，如大多數(shù)氨基酸都有右旋體和左旋體，但往往只能獲得右旋體和左旋體的混合物。手性藥物往往呈現(xiàn)一種對映體具有強(qiáng)的生物活性和藥效，而另一種卻無效。近年來，對手性藥物的拆分定量分析進(jìn)行了廣泛深入的研究。其中，對生物體液中藥物對映體的分離分析，有利于了解各種對映體的藥代動(dòng)力學(xué)、體內(nèi)代謝過程和生物利用度。因此對手性藥物對映體的拆分也是HPLC分析的熱點(diǎn)。手性HPLC拆分法是以現(xiàn)代HPLC技術(shù)為基礎(chǔ)引入手性環(huán)境使對映異構(gòu)體間呈現(xiàn)物理特征的差異而進(jìn)行分離。HPLC法拆分手性藥物對映體可分為直接法和間接法。前者是將不對稱中心引入分子間，可分為手性流動(dòng)相添加劑(CMP)法和手性固定相(CSP)法；后者又稱為手性試劑衍生化(CDR)法，它是將不對稱中心引入分子內(nèi)。手性試劑衍生化法是將對映體經(jīng)手性試劑衍生，生成非對映異構(gòu)體后，利用常規(guī)HPLC方法進(jìn)行分離和測定。適用于不宜直接拆分測定的化合物如手性脂肪胺類、醇類等。該法分離效果好，分離條件簡便，但對手性衍生試劑的要求較高，操作比較麻煩，多在其它方法無法實(shí)現(xiàn)時(shí)才采用。對生物樣品中對映體拆分過程中，由于內(nèi)源性物質(zhì)及代謝產(chǎn)物的干擾，單用HPLC分析，易造成譜峰重疊，不能直接分析體內(nèi)手性藥物。目前，使用多柱偶聯(lián)技術(shù)已成功解決了該類問題。目前，HPLC是在手性藥物拆分中應(yīng)用最多的方法之一，可以預(yù)見，該方法因其具有快速、方便、精確的特點(diǎn)，在未來的手性藥物研究中，將得到更廣泛的應(yīng)用。2.5在藥物鑒別中的應(yīng)用在HPLC法中，保留時(shí)間與組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有關(guān),是定性的參數(shù)，可用于藥物的鑒別.如中國藥典收載的藥物頭孢羥氨芐的鑒別項(xiàng)下規(guī)定:在含量測定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品主峰的保留時(shí)間應(yīng)與對照品主峰的保留時(shí)間一致.頭抱拉定,頭孢噻酚鈉等頭孢類藥物以及地西泮注射液,曲安奈德注射液等多種藥物均采用HPLC法進(jìn)行鑒別.2.6在雜質(zhì)檢查中的應(yīng)用HPLC分離效能高，靈敏，在藥物的雜質(zhì)檢查中應(yīng)用廣泛.主要用于藥物中有關(guān)物質(zhì)的檢查.“有關(guān)物質(zhì)”是指藥物中存在的合成原料，中間體,副產(chǎn)物，降解產(chǎn)物等物質(zhì)，這些物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與藥物相似，含量很低,只有采用色譜的方法才能將其分離并檢測.若雜質(zhì)是已知的，又有雜質(zhì)的對照品,可用雜質(zhì)對照品做對照進(jìn)行檢查.若雜質(zhì)是未知的，可以采用主成分自身對照法或峰面積歸一化法進(jìn)行檢查.2.7在含量測定中的應(yīng)用用液相色譜法側(cè)定含量可以消除藥物中的雜質(zhì)，制劑中的附加劑及共存的藥物對測定的干擾.中藥材及其制劑組成復(fù)雜，基中不少有效成分的含量測定也越來越多地采用了液相色譜法.2.8在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用HPLC由于測定迅速準(zhǔn)確，流動(dòng)相選擇范圍廣，靈敏度高（10-12g/mL以上），填充柱種類多，且可供選擇的檢測器也多。所以是實(shí)驗(yàn)室研究中一種很好的體內(nèi)分析方法。在國內(nèi)外都很受重視.大多數(shù)藥物都有紫外吸收，所以最常用的檢測器是紫外檢測器。多數(shù)藥物及內(nèi)源性物質(zhì)極性均較大，利用其極性差，可以采用RP-HPLC色譜柱，可獲得良好分離效果。液相色譜法在體內(nèi)藥物分析中具有樣品處理簡便、快速，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性較好，精密度和靈敏度均能夠符合藥動(dòng)學(xué)研究和治療藥物監(jiān)測的需要的優(yōu)點(diǎn)。而且，HPLC能同時(shí)進(jìn)行分離和定量測定，這在治療藥物監(jiān)測和藥代動(dòng)力學(xué)中應(yīng)用極為廣泛近年來，HPLC在儀器、檢測器、固定相等方面都有很大的發(fā)展，這大大促進(jìn)了在中、西藥的藥物分析應(yīng)用。但每一種分析技術(shù)均有其使用范圍和方法的局限性，因此色譜技術(shù)聯(lián)用變得越來越普遍?，F(xiàn)在主要是色譜一色譜聯(lián)用、色譜一光譜聯(lián)用、液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用，還有柱切換技術(shù)以及液相色譜一傅立葉變換紅外吸收光譜聯(lián)用等。液相色譜與其他技術(shù)的聯(lián)用是液相色譜今后的主要發(fā)展方向。參考文獻(xiàn)：[1]李玲，劉健，周踐，等.從歷版中國藥典分析方法的統(tǒng)計(jì)與研究看我國藥物分析方法的發(fā)展[J].藥物分析雜志，1998,18(50):349.[2]盧慧斌，肖靜華.HPLC在藥物分析中的應(yīng)用[J].內(nèi)蒙古科技與經(jīng)濟(jì)雜志,2003⑷:105.龍朝陽，俞英.高效液相色譜法在我國藥物分析中的應(yīng)用展望[J].廣州醫(yī)藥，2000⑷:14-15.盧義,劉淑芬,甄攀.吳茱萸中氨基酸的HPLC分析[J].河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)，2005,22⑶:18-19.陳維軍，張俐勤，戚向陽，等.反相高效液相色譜法測定羅漢果皂苷的含量 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