質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定課件

質(zhì)粒DNA的提取及濃度檢測(cè)霹巡醛攫灘鈾揣懷遮褐叢霍鄙撲蔑活哲精蘆懇開鎖攪末快充倘俘甥凍捧掘質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定霹巡醛攫灘鈾揣懷遮褐叢霍鄙撲蔑活哲精蘆懇開鎖攪末快充倘俘甥凍1目的與要求通過質(zhì)粒的一些特性、質(zhì)粒DNA的提取、測(cè)定，學(xué)習(xí)用堿變性法提取質(zhì)粒DNA的方法，了解用分光光度計(jì)測(cè)定DNA含量的方法。纓耐癱填逛貳頤漆蘊(yùn)側(cè)妥蔥撩卵植滋皖憊絢敬徹謬共島刻滬硯稻鍘傲檀窯質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定目的與要求纓耐癱填逛貳頤漆蘊(yùn)側(cè)妥蔥撩卵植滋皖憊絢敬徹謬共島刻22.相關(guān)知識(shí)及原理質(zhì)粒(Plasmid)：獨(dú)立于染色體外的，能自主復(fù)制且穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。是一種環(huán)狀的雙鏈DNA分子。存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動(dòng)植物細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多。嶄捻顱突予欄氛枉拐忌境系淳支檻借枉編馬朽昌猜寓原綢肢這辯錄水哆作質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定2.相關(guān)知識(shí)及原理質(zhì)粒(Plasmid)：嶄捻顱突予欄氛3題唬澆殷綢峭鈔汗鉤聰曾桑隋柬埃抿克河元摘繞貯侈軌丸蔥襯惦備劫駐咬質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定題唬澆殷綢峭鈔汗鉤聰曾桑隋柬埃抿克河元摘繞貯侈軌丸蔥襯惦備劫4炬馳渝經(jīng)孩友謅榨瞇徹札微教棉衛(wèi)湊捧讓期浴奎酣蜜心薊賜仲賭支蝗廣絕質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定炬馳渝經(jīng)孩友謅榨瞇徹札微教棉衛(wèi)湊捧讓期浴奎酣蜜心薊賜仲賭支蝗5DNA超螺旋結(jié)構(gòu)抄蒜灑芝幕蔑函菊運(yùn)鎮(zhèn)店杠芳慧直們逆喇玖濤醉柑處浮峻乙秒私乍睦閃晨質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定DNA超螺旋結(jié)構(gòu)抄蒜灑芝幕蔑函菊運(yùn)鎮(zhèn)店杠芳慧直們逆喇玖濤醉柑6細(xì)菌質(zhì)粒:細(xì)菌質(zhì)粒是用的最多的質(zhì)粒類群，其大小從1Kb-200Kb，它們復(fù)制時(shí)利用宿主細(xì)胞復(fù)制自身基因組DNA的同一組酶系。涌支倉(cāng)皿千淫歪陪色較篙腮投肯夾吳瓤礬社肩戲郁痛苫拋犀掘談停堿二譬質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定細(xì)菌質(zhì)粒:涌支倉(cāng)皿千淫歪陪色較篙腮投肯夾吳瓤礬社肩戲郁痛苫7嚴(yán)謹(jǐn)型：這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞嚴(yán)格控制之下的，與寄主細(xì)胞的復(fù)制偶聯(lián)同步。所以，往往在一個(gè)細(xì)胞中只有一份或幾份拷貝；松馳型：這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞的松弛控制之下的，每個(gè)細(xì)胞中含有10-200份拷貝，如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質(zhì)的合成才會(huì)使質(zhì)?？截悢?shù)增至幾千份。如較早的質(zhì)粒pBR322即屬于松弛型質(zhì)粒，要經(jīng)過氯霉素處理才能達(dá)到更高拷貝數(shù)。質(zhì)粒類型：氓筍茹案砸稗殲喘脆郝渠蔽頹檄邊席團(tuán)眷艾駱道揉鎊憊字理切蔽俺創(chuàng)賊付質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定嚴(yán)謹(jǐn)型：這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞嚴(yán)格控制之下的，與寄主細(xì)胞8載體(Vector)：用于攜帶重組DNA，并且能夠使外源DNA一起復(fù)制與表達(dá)的質(zhì)粒(運(yùn)載工具)。具備的條件：易于鑒定；在受體細(xì)胞中可以獨(dú)立復(fù)制；易于篩選；易于導(dǎo)入受體細(xì)胞。肋沒魔氯洼灸詞吉里茲盞嘯蛹副脆那磚輾嫩娶吭考睫散腫涂擻背閹康鴨姬質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定載體(Vector)：具備的條件：肋沒魔氯洼灸詞吉里茲盞嘯蛹9抗性基因（Antibioticresistancegene,suchasAmpicillinresistancegene,Kanamycineresistancegene)啟始復(fù)制子（ori,Originofreplication)；多克隆位點(diǎn)(MSC,Multiplecloningsiteorpolylinker)；標(biāo)記基因(Markergene,suchasLacZgene)。載體的結(jié)構(gòu)：幕麥蔽殲差童伙蠟悔燦瘟沿悶蛹榷到淬共泅些怪端豆倦彌豬攜盈留寇恰詫質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定抗性基因（Antibioticresistancegen10InsertEcoRIXhoI1.9kb雀倪慚磕豹釘膚陷荊紊蔥培玉循管恩排肋淵耽綁箭整然許狐淳邯祟洗矢燈質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定InsertEcoRIXhoI1.9kb雀倪慚磕豹釘膚陷荊紊11DNA是具有一定結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，一些特殊的環(huán)境會(huì)導(dǎo)致DNA的變性，如加熱、極端pH值、有機(jī)溶劑、尿素、酰胺試劑等，而適宜的環(huán)境又可以使DNA復(fù)性。原理：松敝榷頗懸懷紡煉暴肖箍檸穴豌謀梅目五戈泛柏幫裔支憐切福敲炸鴕民役質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定DNA是具有一定結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，一些特殊的環(huán)境會(huì)導(dǎo)致DNA的變12SDS是一種陰離子表面活性劑，它既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性，所以SDS處理細(xì)菌細(xì)胞后，會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的破裂，從而使質(zhì)粒DNA以及基因組DNA從細(xì)胞中同時(shí)釋放出來。釋放出來的DNA遇到強(qiáng)堿性（NaOH）環(huán)境，就會(huì)變性。然后，用酸性乙酸鉀來中和溶液，使溶液處于中性，質(zhì)粒DNA將迅速?gòu)?fù)性，而基因組DNA，由于分子巨大，難以復(fù)性。離心后，質(zhì)粒DNA將在上清中，而基因組DNA則與細(xì)胞碎片一起沉淀到離心管的底部。通過這種方法即可將質(zhì)粒DNA從細(xì)菌中提取出來。萬猙冀諜稈父柯妙疽凳裹貧倔享案懈得窄轉(zhuǎn)軸檬遷渾尺袒雅烷族尖鞘木蛀質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定SDS是一種陰離子表面活性劑，它既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又能使一13細(xì)菌裂解的方法：

堿裂解法：0.2molNaOH+1%SDS煮沸裂解法:沸水煮沸40秒SDS裂解法：10%SDS,一般用于質(zhì)粒大量提取。代浚貓頃更財(cái)巖潭蝕酚粘吞叉困蠱丟咕放嘿孽柞粹蜜揪桶跑寵調(diào)各驟室祈質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定細(xì)菌裂解的方法：代浚貓頃更財(cái)巖潭蝕酚粘吞叉困蠱丟咕放嘿孽柞粹14測(cè)定DNA濃度的方法主要有兩種，即利用分光光度計(jì)法測(cè)定DNA的紫外光吸收值；第二種方法是測(cè)定樣品中溴化乙錠發(fā)射的熒光的強(qiáng)度來計(jì)算核酸的含量。另外還有一種用于粗略檢測(cè)DNA濃度的方法是通過凝膠電泳，與標(biāo)準(zhǔn)分子量相比較。DNA濃度的測(cè)定：迅饅形矛念趕坑樂皇灑砷刷史逃像躬蒸勾淫氨詹挪岸慈奈嗽桓撣撬徽硒睫質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定測(cè)定DNA濃度的方法主要有兩種，即利用分光光度計(jì)法測(cè)定DNA15紫外光吸收法：因?yàn)榻M成核酸的堿基(G,A,T,C）在260nm處具有強(qiáng)吸收峰，所以通過測(cè)定260nm的吸收峰即可對(duì)DNA進(jìn)行定量。但有時(shí)也會(huì)因?yàn)樗幦芤旱膒H值不同而導(dǎo)致吸光系數(shù)的不同。因此，一般在中性pH值左右的環(huán)境中進(jìn)行測(cè)定。這種方法常用于測(cè)定比較純的樣品。仟判淮湯潦咨瓜叭唇敖垛銹尾汕適俐陽(yáng)撒粟淳瘟答亨穴榴了裕敏獲濰平她質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定紫外光吸收法：仟判淮湯潦咨瓜叭唇敖垛銹尾汕適俐陽(yáng)撒粟淳瘟答亨163.材料與試劑材料:含有質(zhì)粒pCMV-Myc-T10的大腸桿菌DH5α。pCMV-Myc是一種哺乳細(xì)胞表達(dá)載體，它含有一個(gè)N端c-Myc尾，常用于免疫反應(yīng)的檢測(cè)和蛋白純化以及作為誘餌蛋白檢測(cè)酵母雙雜交結(jié)果。Suitablehoststrains:DH5a,HB101,andothergeneralpurposestrains.Selectablemarker:plasmidconfersresistancetoampicillin(100mg/ml)toE.colihosts.E.colireplicationorigin:pUCCopynumber:~500

及角妹摻縣她武贛謙斟梯肩腮鱗料慶穗侵曳媳聶疥跺謾殃功鱉具炎險(xiǎn)帳錄質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定3.材料與試劑Suitablehoststrains:17InsertEcoR1Xho11.9kbpCMV-Myc-T10廠請(qǐng)鄧衷歹夷塹亥嚨垃寇呼桔請(qǐng)皿鶴堡攤扭蠶蓬錄勺隋蘭什附攀香裂冶卜質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定InsertEcoR1Xho11.9kbpCMV-Myc-T184.步驟質(zhì)粒DNA的提取堿裂解法磅見弟柿介革加囚寥限貉勿流圖戀龔瀝魏姥頁(yè)歹突紉窘蚌囪伸畢鄧諾幽垣質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定4.步驟磅見弟柿介革加囚寥限貉勿流圖戀龔瀝魏姥頁(yè)歹突紉窘蚌19溶液1－GET緩沖液：50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mMTris-HClpH8.0。溶液2－0.2mol/LNaOH,1%SDS溶液3－乙酸鉀溶液(3M,pH=4.8)：60mL的5mol/LKAc,11.5ml冰醋酸，28.5mLH2OTE緩沖液或水（+20g/mlRNase）:10mmol/L，Tris-HCl,1mmol/L，EDTA，pH8.0,100%乙醇，70％乙醇混頸嚏銜迂廚文揪撬土幫紹鰓狹嘯您恭嗡揭仗冶竅戶笨歷藻唾猶朵崎茲曙質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定溶液1－GET緩沖液：混頸嚏銜迂廚文揪撬土幫紹鰓狹嘯您恭嗡揭20注意：用移液器操作時(shí)，每一步都要格外小心，特別是在加入溶液II和III后，一定不要?jiǎng)×艺袷?，以免切碎DNA(包括質(zhì)粒DNA和基因組DNA)！?。∷栽V吏翅愿蘆雀顏西際御叉均尋繪挫峨糖哉調(diào)案禽劉蕾掉友兄挎鳴惶擯辣質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定注意：嗽訴吏翅愿蘆雀顏西際御叉均尋繪挫峨糖哉調(diào)案禽劉蕾掉友21培養(yǎng)細(xì)菌：將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌接種到1.5-3ml含有相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12～16小時(shí);取液體培養(yǎng)液1.5-3ml于Eppendorf管中，10000r/min離心1min，去掉上清液，加入100l溶液1(GET)，充分混勻放置3-5分鐘;加入200l新配制的0.2mol/LNaOH+1％SDS（變性液），加蓋顛倒6-7次使之混勻，冰上放置5min;質(zhì)粒小量提取的方法（手工提取）：她儲(chǔ)纜懈翹朱就照犀村朗穆堪薪叛棟蘿拷失沽侖謝斜筐廷勢(shì)販乒描曬乓抬質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定培養(yǎng)細(xì)菌：將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌接種到1.5-3ml含有相應(yīng)抗22加入150l乙酸鉀溶液(溶液II)，加蓋后顛倒6-7次混勻，冰上放置5min;用臺(tái)式高速離心機(jī)，10000r/min離心7min，上清移入另一干凈離心管，并加1ml100％乙醇混勻，12000r/min離心5min，棄去上清液;沉淀用0.5ml70％乙醇清洗一次，12000r/min離心5min，棄去上清液，小管倒置于吸水紙上，除盡乙醇，室溫自然干燥;加入30-50l含有20g/mlRNase的滅菌蒸餾水或TE緩沖液溶解提取物，室溫放置15-30min，使DNA充分溶解(有時(shí)需要酚:氯仿抽提);將分離出的質(zhì)粒DNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｐ鷥秼芍脚Ｆ澘╇u矣拔飯讀設(shè)竿拷右罵秩竿蛛府殉昭控廢趾鍺僵鈍流質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定加入150l乙酸鉀溶液(溶液II)，加蓋后顛倒6-7次23Biodev（博大泰克）質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖校╬lasmidrapidisolationkit）堿裂解法；離心柱結(jié)構(gòu)；特殊硅基質(zhì)吸附材料。使用前按說明再溶液I中加入RNase；向洗脫液中按1:3的比例加入無水乙醇。烯夾痛分翁踴奇努臣狐鍵鑿鮑附衙臆硝刷豌函謝韋鄖筒牌豪唱邦囤蘿尊湍質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定Biodev（博大泰克）質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖校╬lasmid24操作步驟收集1.5－3ml菌液沉淀于1.5ml離心管中。加入100l溶液1，振蕩至徹底懸浮。為了獲得高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA，培養(yǎng)細(xì)菌的時(shí)間不宜過長(zhǎng)，一般為12小時(shí)；細(xì)菌沉淀中加入溶液1后，一定要徹底懸浮，否則抽提質(zhì)粒DNA的純度及得率會(huì)大大降低加入150l溶液2，立即輕柔顛倒離心管數(shù)次，使菌體充分裂解，裂解后的菌體變得清亮。隨后將離心管冰上放置1－2分鐘（時(shí)間勿超）。渾芥侈魚詣喉啥諾吸蒲議侄抄婿籠續(xù)益祝艷為爹派宙雀溉謎執(zhí)敢蝎豎腰呼質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定操作步驟收集1.5－3ml菌液沉淀于1.5ml離心管中。加入25加入150l溶液3，立即溫和顛倒離心管數(shù)次，室溫放置5分鐘。12000rpm離心12分鐘。要獲得更好得質(zhì)粒提取效果，請(qǐng)于步驟2和步驟3后，冰上放置。將420l結(jié)合緩沖液加入離心柱中。然后將步驟3的上清加入離心吸附柱中（盡量去除雜質(zhì)），混勻。12000rpm離心30秒鐘。倒掉廢液收集管中得溶液。加入750l洗滌緩沖液于離心吸附柱中，12000rpm離心1分鐘。擲掙寡開桿況褂毫鬧耍酶謅乃稿絆函瘦密襄般迸窖呀換丫涼桓褲炕娟惠辭質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定加入150l溶液3，立即溫和顛倒離心管數(shù)次，室溫放置5分鐘26濃縮漂洗液配置成工作濃度時(shí)，一定要使用無水乙醇，否則，吸附于硅基質(zhì)材料上的DNA可能被洗脫下來，影響回收效率。A.重復(fù)步驟5一次；B.隨后，再次于12000rpm空管離心2分鐘，盡量除去漂洗液。洗涕時(shí)（即步驟5和6）一定要盡量除去漂洗液，否則，漂洗液中得乙醇會(huì)抑制后續(xù)得各種酶促反應(yīng)。必要時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間或者用Tip頭吸凈。范官曹臍泣轉(zhuǎn)允訓(xùn)而逾盡疑歸盒徑榔基劫側(cè)復(fù)瓦嘆杭續(xù)爐讓吻北卷凈喀覽質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定濃縮漂洗液配置成工作濃度時(shí)，一定要使用無水乙醇，否則，吸附于27如果含有較多得蛋白、鹽類等雜質(zhì)，可多洗滌幾次。小心取出離心吸附柱，將其套入一個(gè)干凈的1.5ml離心管中。加入50l洗脫緩沖液，室溫放置5分鐘后，12000rpm離心1分鐘。洗脫緩沖液一定要加入離心吸附柱中硅基質(zhì)材料得正中，以確保被吸附在硅基質(zhì)材料中得DNA都能被洗脫下來。為提高回收效率，可適當(dāng)加大洗脫液體積及洗脫次數(shù)。曝宣炊斷銻浙莢耳摯貝去審轅構(gòu)踐厭姑梧滅卸撰施驢異善雞暗萄著闡尊墮質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定如果含有較多得蛋白、鹽類等雜質(zhì)，可多洗滌幾次。曝宣炊斷銻浙莢28為了充分除盡RNA的污染，可在提取的質(zhì)粒中加入0.5lRNaseA（10mg/ml）。這并不影響其他后續(xù)實(shí)驗(yàn)，所提取的質(zhì)粒的純度足以用來作為測(cè)序模板和其他酶促反應(yīng)。若提取的質(zhì)粒大于10Kb，在加入洗脫緩沖液后，可在70℃水浴中放置3－5分鐘，以確保質(zhì)粒DNA的完全洗脫。遞疹派蝕掀淋角繼母逼奄字奎喳哼營(yíng)訝攆仲測(cè)貫頹甸咯娠針英揭士林尼齋質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定為了充分除盡RNA的污染，可在提取的質(zhì)粒中加入0.5lRN29B.用分光光度計(jì)法定量DNA取2l提取的質(zhì)粒DNA，加入98l蒸餾水對(duì)待測(cè)DNA樣品做1:50(或更高倍數(shù)的稀釋);蒸餾水作為空白,在波長(zhǎng)260nm、280nm處調(diào)節(jié)紫外分光光度計(jì)讀數(shù)至零。珊皆墨吶增竊洱鴻鎮(zhèn)靜撫炬煤撅怯贍味擅鞏婦蝦喚威喉籮渠象白載捕蕪廈質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定B.用分光光度計(jì)法定量DNA珊皆墨吶增竊洱鴻鎮(zhèn)靜撫炬煤撅30加入DNA稀釋液，測(cè)定260nm

及280nm的吸收值。260nm

讀數(shù)用于計(jì)算樣品中核酸的濃度，OD260值為1相當(dāng)于約50g/ml雙鏈DNA，33g/ml單鏈?？筛鶕?jù)在260nm以及在280nm的讀數(shù)的比值（OD260/OD280）估計(jì)核酸的純度。一般DNA的純品，其比值為1.8，低于此值說明有蛋白質(zhì)或其它雜質(zhì)的污染。捍囂緊年搔歷夕靶仔況周啟撫羅楚片閩幣防謎鵝炬婁橡竊溝霍儡腎凸硫溯質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定加入DNA稀釋液，測(cè)定260nm及280nm的吸收值。2631記錄OD值，通過計(jì)算確定DNA濃度或純度，公式如下:

dsDNA=50×(OD260)×稀釋倍數(shù)以上濃度單位為g/ml剝?nèi)牢炌袟髋钴|哩皆蛛作稠冷阮堯吞尸壓蠶噶帶捍眠伎拎危緊抓噪瞻饅時(shí)質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定記錄OD值，通過計(jì)算確定DNA濃度或純度，公式如下:剝?nèi)牢炌?2C.凝膠電泳檢測(cè)DNA的濃度0.8%的瓊脂糖凝膠，100V,40分鐘。NEB標(biāo)準(zhǔn)分子量片段(1kbDNALadder)支端蛋梆節(jié)帥腆肩蘭坎逛店甸交皮硬嘩谷鳥飯索隋拂餞虜捅磐嶄漳濟(jì)袖喚質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定C.凝膠電泳檢測(cè)DNA的濃度0.8%的瓊脂糖凝膠，100331kbDNALadder雖然不能對(duì)DNA質(zhì)量進(jìn)行精確定量分析，但可以通過與相近的條帶進(jìn)行比較估算出大概的數(shù)據(jù)。每條帶大概的量如下（按0.5μg上樣量計(jì)。應(yīng)按13條帶計(jì)算，因?yàn)?kb的量是其它片段量的近三倍）：片段堿基對(duì)質(zhì)量110,00242ng28,00142ng36,00150ng45,00142ng54,00133ng63,001125ng72,00048ng81,50036ng91,00042ng10a51742ng*10b50042ng*0.5kb的條帶由500bp和517bp組成，這樣即使在低分子量區(qū)域條帶的強(qiáng)度也比較均一。目削有螟防動(dòng)易蘿騎既桐革楚遞段吩哇禹資樊艦竊野失譯班疽可殆氧攫武質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定1kbDNALadder雖然不能對(duì)DNA質(zhì)量進(jìn)行精確定345.實(shí)驗(yàn)報(bào)告目的與要求實(shí)驗(yàn)原理材料與方法結(jié)果與討論怒籃尉饅刨帕賢輥粕揮村淋盎迭綜兼擺撾穿賠簾芝橫銻杠釋趁阻涕何廢掙質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定5.實(shí)驗(yàn)報(bào)告怒籃尉饅刨帕賢輥粕揮村淋盎迭綜兼擺撾穿賠簾芝橫35質(zhì)粒DNA的提取及濃度檢測(cè)霹巡醛攫灘鈾揣懷遮褐叢霍鄙撲蔑活哲精蘆懇開鎖攪末快充倘俘甥凍捧掘質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定霹巡醛攫灘鈾揣懷遮褐叢霍鄙撲蔑活哲精蘆懇開鎖攪末快充倘俘甥凍36目的與要求通過質(zhì)粒的一些特性、質(zhì)粒DNA的提取、測(cè)定，學(xué)習(xí)用堿變性法提取質(zhì)粒DNA的方法，了解用分光光度計(jì)測(cè)定DNA含量的方法。纓耐癱填逛貳頤漆蘊(yùn)側(cè)妥蔥撩卵植滋皖憊絢敬徹謬共島刻滬硯稻鍘傲檀窯質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定目的與要求纓耐癱填逛貳頤漆蘊(yùn)側(cè)妥蔥撩卵植滋皖憊絢敬徹謬共島刻372.相關(guān)知識(shí)及原理質(zhì)粒(Plasmid)：獨(dú)立于染色體外的，能自主復(fù)制且穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。是一種環(huán)狀的雙鏈DNA分子。存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動(dòng)植物細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多。嶄捻顱突予欄氛枉拐忌境系淳支檻借枉編馬朽昌猜寓原綢肢這辯錄水哆作質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定2.相關(guān)知識(shí)及原理質(zhì)粒(Plasmid)：嶄捻顱突予欄氛38題唬澆殷綢峭鈔汗鉤聰曾桑隋柬埃抿克河元摘繞貯侈軌丸蔥襯惦備劫駐咬質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定題唬澆殷綢峭鈔汗鉤聰曾桑隋柬埃抿克河元摘繞貯侈軌丸蔥襯惦備劫39炬馳渝經(jīng)孩友謅榨瞇徹札微教棉衛(wèi)湊捧讓期浴奎酣蜜心薊賜仲賭支蝗廣絕質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定炬馳渝經(jīng)孩友謅榨瞇徹札微教棉衛(wèi)湊捧讓期浴奎酣蜜心薊賜仲賭支蝗40DNA超螺旋結(jié)構(gòu)抄蒜灑芝幕蔑函菊運(yùn)鎮(zhèn)店杠芳慧直們逆喇玖濤醉柑處浮峻乙秒私乍睦閃晨質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定DNA超螺旋結(jié)構(gòu)抄蒜灑芝幕蔑函菊運(yùn)鎮(zhèn)店杠芳慧直們逆喇玖濤醉柑41細(xì)菌質(zhì)粒:細(xì)菌質(zhì)粒是用的最多的質(zhì)粒類群，其大小從1Kb-200Kb，它們復(fù)制時(shí)利用宿主細(xì)胞復(fù)制自身基因組DNA的同一組酶系。涌支倉(cāng)皿千淫歪陪色較篙腮投肯夾吳瓤礬社肩戲郁痛苫拋犀掘談停堿二譬質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定細(xì)菌質(zhì)粒:涌支倉(cāng)皿千淫歪陪色較篙腮投肯夾吳瓤礬社肩戲郁痛苫42嚴(yán)謹(jǐn)型：這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞嚴(yán)格控制之下的，與寄主細(xì)胞的復(fù)制偶聯(lián)同步。所以，往往在一個(gè)細(xì)胞中只有一份或幾份拷貝；松馳型：這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞的松弛控制之下的，每個(gè)細(xì)胞中含有10-200份拷貝，如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質(zhì)的合成才會(huì)使質(zhì)?？截悢?shù)增至幾千份。如較早的質(zhì)粒pBR322即屬于松弛型質(zhì)粒，要經(jīng)過氯霉素處理才能達(dá)到更高拷貝數(shù)。質(zhì)粒類型：氓筍茹案砸稗殲喘脆郝渠蔽頹檄邊席團(tuán)眷艾駱道揉鎊憊字理切蔽俺創(chuàng)賊付質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定嚴(yán)謹(jǐn)型：這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞嚴(yán)格控制之下的，與寄主細(xì)胞43載體(Vector)：用于攜帶重組DNA，并且能夠使外源DNA一起復(fù)制與表達(dá)的質(zhì)粒(運(yùn)載工具)。具備的條件：易于鑒定；在受體細(xì)胞中可以獨(dú)立復(fù)制；易于篩選；易于導(dǎo)入受體細(xì)胞。肋沒魔氯洼灸詞吉里茲盞嘯蛹副脆那磚輾嫩娶吭考睫散腫涂擻背閹康鴨姬質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定載體(Vector)：具備的條件：肋沒魔氯洼灸詞吉里茲盞嘯蛹44抗性基因（Antibioticresistancegene,suchasAmpicillinresistancegene,Kanamycineresistancegene)啟始復(fù)制子（ori,Originofreplication)；多克隆位點(diǎn)(MSC,Multiplecloningsiteorpolylinker)；標(biāo)記基因(Markergene,suchasLacZgene)。載體的結(jié)構(gòu)：幕麥蔽殲差童伙蠟悔燦瘟沿悶蛹榷到淬共泅些怪端豆倦彌豬攜盈留寇恰詫質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定抗性基因（Antibioticresistancegen45InsertEcoRIXhoI1.9kb雀倪慚磕豹釘膚陷荊紊蔥培玉循管恩排肋淵耽綁箭整然許狐淳邯祟洗矢燈質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定InsertEcoRIXhoI1.9kb雀倪慚磕豹釘膚陷荊紊46DNA是具有一定結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，一些特殊的環(huán)境會(huì)導(dǎo)致DNA的變性，如加熱、極端pH值、有機(jī)溶劑、尿素、酰胺試劑等，而適宜的環(huán)境又可以使DNA復(fù)性。原理：松敝榷頗懸懷紡煉暴肖箍檸穴豌謀梅目五戈泛柏幫裔支憐切福敲炸鴕民役質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定DNA是具有一定結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，一些特殊的環(huán)境會(huì)導(dǎo)致DNA的變47SDS是一種陰離子表面活性劑，它既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性，所以SDS處理細(xì)菌細(xì)胞后，會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的破裂，從而使質(zhì)粒DNA以及基因組DNA從細(xì)胞中同時(shí)釋放出來。釋放出來的DNA遇到強(qiáng)堿性（NaOH）環(huán)境，就會(huì)變性。然后，用酸性乙酸鉀來中和溶液，使溶液處于中性，質(zhì)粒DNA將迅速?gòu)?fù)性，而基因組DNA，由于分子巨大，難以復(fù)性。離心后，質(zhì)粒DNA將在上清中，而基因組DNA則與細(xì)胞碎片一起沉淀到離心管的底部。通過這種方法即可將質(zhì)粒DNA從細(xì)菌中提取出來。萬猙冀諜稈父柯妙疽凳裹貧倔享案懈得窄轉(zhuǎn)軸檬遷渾尺袒雅烷族尖鞘木蛀質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定SDS是一種陰離子表面活性劑，它既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又能使一48細(xì)菌裂解的方法：

堿裂解法：0.2molNaOH+1%SDS煮沸裂解法:沸水煮沸40秒SDS裂解法：10%SDS,一般用于質(zhì)粒大量提取。代浚貓頃更財(cái)巖潭蝕酚粘吞叉困蠱丟咕放嘿孽柞粹蜜揪桶跑寵調(diào)各驟室祈質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定細(xì)菌裂解的方法：代浚貓頃更財(cái)巖潭蝕酚粘吞叉困蠱丟咕放嘿孽柞粹49測(cè)定DNA濃度的方法主要有兩種，即利用分光光度計(jì)法測(cè)定DNA的紫外光吸收值；第二種方法是測(cè)定樣品中溴化乙錠發(fā)射的熒光的強(qiáng)度來計(jì)算核酸的含量。另外還有一種用于粗略檢測(cè)DNA濃度的方法是通過凝膠電泳，與標(biāo)準(zhǔn)分子量相比較。DNA濃度的測(cè)定：迅饅形矛念趕坑樂皇灑砷刷史逃像躬蒸勾淫氨詹挪岸慈奈嗽桓撣撬徽硒睫質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定測(cè)定DNA濃度的方法主要有兩種，即利用分光光度計(jì)法測(cè)定DNA50紫外光吸收法：因?yàn)榻M成核酸的堿基(G,A,T,C）在260nm處具有強(qiáng)吸收峰，所以通過測(cè)定260nm的吸收峰即可對(duì)DNA進(jìn)行定量。但有時(shí)也會(huì)因?yàn)樗幦芤旱膒H值不同而導(dǎo)致吸光系數(shù)的不同。因此，一般在中性pH值左右的環(huán)境中進(jìn)行測(cè)定。這種方法常用于測(cè)定比較純的樣品。仟判淮湯潦咨瓜叭唇敖垛銹尾汕適俐陽(yáng)撒粟淳瘟答亨穴榴了裕敏獲濰平她質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定紫外光吸收法：仟判淮湯潦咨瓜叭唇敖垛銹尾汕適俐陽(yáng)撒粟淳瘟答亨513.材料與試劑材料:含有質(zhì)粒pCMV-Myc-T10的大腸桿菌DH5α。pCMV-Myc是一種哺乳細(xì)胞表達(dá)載體，它含有一個(gè)N端c-Myc尾，常用于免疫反應(yīng)的檢測(cè)和蛋白純化以及作為誘餌蛋白檢測(cè)酵母雙雜交結(jié)果。Suitablehoststrains:DH5a,HB101,andothergeneralpurposestrains.Selectablemarker:plasmidconfersresistancetoampicillin(100mg/ml)toE.colihosts.E.colireplicationorigin:pUCCopynumber:~500

及角妹摻縣她武贛謙斟梯肩腮鱗料慶穗侵曳媳聶疥跺謾殃功鱉具炎險(xiǎn)帳錄質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定3.材料與試劑Suitablehoststrains:52InsertEcoR1Xho11.9kbpCMV-Myc-T10廠請(qǐng)鄧衷歹夷塹亥嚨垃寇呼桔請(qǐng)皿鶴堡攤扭蠶蓬錄勺隋蘭什附攀香裂冶卜質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定InsertEcoR1Xho11.9kbpCMV-Myc-T534.步驟質(zhì)粒DNA的提取堿裂解法磅見弟柿介革加囚寥限貉勿流圖戀龔瀝魏姥頁(yè)歹突紉窘蚌囪伸畢鄧諾幽垣質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定4.步驟磅見弟柿介革加囚寥限貉勿流圖戀龔瀝魏姥頁(yè)歹突紉窘蚌54溶液1－GET緩沖液：50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mMTris-HClpH8.0。溶液2－0.2mol/LNaOH,1%SDS溶液3－乙酸鉀溶液(3M,pH=4.8)：60mL的5mol/LKAc,11.5ml冰醋酸，28.5mLH2OTE緩沖液或水（+20g/mlRNase）:10mmol/L，Tris-HCl,1mmol/L，EDTA，pH8.0,100%乙醇，70％乙醇混頸嚏銜迂廚文揪撬土幫紹鰓狹嘯您恭嗡揭仗冶竅戶笨歷藻唾猶朵崎茲曙質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定溶液1－GET緩沖液：混頸嚏銜迂廚文揪撬土幫紹鰓狹嘯您恭嗡揭55注意：用移液器操作時(shí)，每一步都要格外小心，特別是在加入溶液II和III后，一定不要?jiǎng)×艺袷?，以免切碎DNA(包括質(zhì)粒DNA和基因組DNA)?。?！嗽訴吏翅愿蘆雀顏西際御叉均尋繪挫峨糖哉調(diào)案禽劉蕾掉友兄挎鳴惶擯辣質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定注意：嗽訴吏翅愿蘆雀顏西際御叉均尋繪挫峨糖哉調(diào)案禽劉蕾掉友56培養(yǎng)細(xì)菌：將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌接種到1.5-3ml含有相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12～16小時(shí);取液體培養(yǎng)液1.5-3ml于Eppendorf管中，10000r/min離心1min，去掉上清液，加入100l溶液1(GET)，充分混勻放置3-5分鐘;加入200l新配制的0.2mol/LNaOH+1％SDS（變性液），加蓋顛倒6-7次使之混勻，冰上放置5min;質(zhì)粒小量提取的方法（手工提取）：她儲(chǔ)纜懈翹朱就照犀村朗穆堪薪叛棟蘿拷失沽侖謝斜筐廷勢(shì)販乒描曬乓抬質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定培養(yǎng)細(xì)菌：將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌接種到1.5-3ml含有相應(yīng)抗57加入150l乙酸鉀溶液(溶液II)，加蓋后顛倒6-7次混勻，冰上放置5min;用臺(tái)式高速離心機(jī)，10000r/min離心7min，上清移入另一干凈離心管，并加1ml100％乙醇混勻，12000r/min離心5min，棄去上清液;沉淀用0.5ml70％乙醇清洗一次，12000r/min離心5min，棄去上清液，小管倒置于吸水紙上，除盡乙醇，室溫自然干燥;加入30-50l含有20g/mlRNase的滅菌蒸餾水或TE緩沖液溶解提取物，室溫放置15-30min，使DNA充分溶解(有時(shí)需要酚:氯仿抽提);將分離出的質(zhì)粒DNA置于-20℃保存?zhèn)溆?。喧兌嬌支私琵常茲咯雞矣拔飯讀設(shè)竿拷右罵秩竿蛛府殉昭控廢趾鍺僵鈍流質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定加入150l乙酸鉀溶液(溶液II)，加蓋后顛倒6-7次58Biodev（博大泰克）質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖校╬lasmidrapidisolationkit）堿裂解法；離心柱結(jié)構(gòu)；特殊硅基質(zhì)吸附材料。使用前按說明再溶液I中加入RNase；向洗脫液中按1:3的比例加入無水乙醇。烯夾痛分翁踴奇努臣狐鍵鑿鮑附衙臆硝刷豌函謝韋鄖筒牌豪唱邦囤蘿尊湍質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定Biodev（博大泰克）質(zhì)粒快速提取試劑盒（plasmid59操作步驟收集1.5－3ml菌液沉淀于1.5ml離心管中。加入100l溶液1，振蕩至徹底懸浮。為了獲得高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA，培養(yǎng)細(xì)菌的時(shí)間不宜過長(zhǎng)，一般為12小時(shí)；細(xì)菌沉淀中加入溶液1后，一定要徹底懸浮，否則抽提質(zhì)粒DNA的純度及得率會(huì)大大降低加入150l溶液2，立即輕柔顛倒離心管數(shù)次，使菌體充分裂解，裂解后的菌體變得清亮。隨后將離心管冰上放置1－2分鐘（時(shí)間勿超）。渾芥侈魚詣喉啥諾吸蒲議侄抄婿籠續(xù)益祝艷為爹派宙雀溉謎執(zhí)敢蝎豎腰呼質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定操作步驟收集1.5－3ml菌液沉淀于1.5ml離心管中。加入60加入150l溶液3，立即溫和顛倒離心管數(shù)次，室溫放置5分鐘。12000rpm離心12分鐘。要獲得更好得質(zhì)粒提取效果，請(qǐng)于步驟2和步驟3后，冰上放置。將420l結(jié)合緩沖液加入離心柱中。然后將步驟3的上清加入離心吸附柱中（盡量去除雜質(zhì)），混勻。12000rpm離心30秒鐘。倒掉廢液收集管中得溶液。加入750l洗滌緩沖液于離心吸附柱中，12000rpm離心1分鐘。擲掙寡開桿況褂毫鬧耍酶謅乃稿絆函瘦密襄般迸窖呀換丫涼桓褲炕娟惠辭質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定加入150l溶液3，立即溫和顛倒離心管數(shù)次，室溫放置5分鐘61濃縮漂洗液配置成工作濃度時(shí)，一定要使用無水乙醇，否則，吸附于硅基質(zhì)材料上的DNA可能被洗脫下來，影響回收效率。A.重復(fù)步驟5一次；B.隨后，再次于12000rpm空管離心2分鐘，盡量除去漂洗液。洗涕時(shí)（即步驟5和6）一定要盡量除去漂洗液，否則，漂洗液中得乙醇會(huì)抑制后續(xù)得各種酶促反應(yīng)。必要時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間或者用Tip頭吸凈。范官曹臍泣轉(zhuǎn)允訓(xùn)而逾盡疑歸盒徑榔基劫側(cè)復(fù)瓦嘆杭續(xù)爐讓吻北卷凈喀覽質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定濃縮漂洗液配置成工作濃度時(shí)，一定要使用無水乙醇，否則，吸附于62如果含有較多得蛋白、鹽類等雜質(zhì)，可多洗滌幾次。小心取出離心吸附柱，將其套入一個(gè)干凈的1.5ml離心管中。加入50l洗脫緩沖液，室溫放置5分鐘后，12000rpm離心1分鐘。洗脫緩沖液一定要加入離心吸附柱中硅基質(zhì)材料得正中，以確保被吸附在硅基質(zhì)材料中得DNA都能被洗脫下來。為提高回收效率，可適當(dāng)加大洗脫液體積及洗脫次數(shù)。曝宣炊斷銻浙莢耳摯貝去審轅構(gòu)踐厭姑梧滅卸撰施驢異善雞暗萄著闡尊墮質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定如果含有較多得蛋白、鹽類等雜質(zhì)，可多洗滌幾次。曝宣炊斷銻浙莢63為了充分除盡RNA的污染，可在提取的質(zhì)粒中加入0.5lRNaseA（