生殖激素的測定-雌節(jié)育-68-160310課件

第六節(jié)

生殖激素的測定1主要內(nèi)容（六）一、生物測定法（bioassay）

二、免疫測定法（immunoassay）三、受體測定法四、理化測定方法2一、常規(guī)生物測定法生物活性：

某生殖激素按一定比例稀釋后

注射到大鼠、小鼠、公雞等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)

觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物靶器官對激素的反應(yīng)一個(gè)生物學(xué)單位：

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的最低激素用量如：大白鼠單位、雞冠單位3生物測定法種類

1．子宮增重反應(yīng)2．陰道涂片檢查3．雞冠發(fā)育反應(yīng)4．卵巢增重反應(yīng)5．排卵試驗(yàn)6．抗壞血酸排空反應(yīng)41．子宮增重反應(yīng)雌激素生物學(xué)活性測定未成熟、或摘除卵巢2周后的大鼠或小鼠

每組5~7只，每日皮下注射1ng~20ng標(biāo)準(zhǔn)激素

連續(xù)注射7d

第8d取出子宮、剝離其附著組織，稱重標(biāo)準(zhǔn)曲線：子宮重-縱座標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)激素用量-橫座標(biāo)待測樣本的生物學(xué)活性：

待測樣子宮重與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較52．陰道涂片檢查ES測定的另一方法觀察ES對陰道上皮的角質(zhì)化程度ES處理：每隔12h皮下注射1.5~15ng

連續(xù)注射三次

最后一次注射激素第24h開始

隔12h作陰道涂片

檢查有無角質(zhì)化的上皮陽性反應(yīng)的百分比與標(biāo)準(zhǔn)劑量反應(yīng)曲線比較7HCG的生物活性：

25日齡大鼠間隔8h于皮下注射6次

然后按上述方法可檢測

83．雞冠發(fā)育反應(yīng)

雄激素測定：靈敏度可達(dá)0.01mg將待測樣本溶解于乙醚

每天在雞冠上涂搽0.2ml

在第7d后取雞冠稱重冠重直接與雄激素的劑量成正比94．卵巢增重反應(yīng)

25日齡大鼠，每天于腹腔內(nèi)注射一次

連續(xù)3d，第4d（72h）取出卵巢稱重PMSG測定：靈敏度可達(dá)2國際單位FSH的測定:

LH或HCG作為協(xié)同劑、增強(qiáng)反應(yīng)105．排卵試驗(yàn)未成熟的倉鼠于出現(xiàn)GTH前12h

靜脈注射待測樣本

18h后取出卵巢和相連的輸卵管

計(jì)算洗出的卵子數(shù)其數(shù)目與GTH的劑量相關(guān)測定FSH、HCG和PMSG：

靈敏度0.25mg、0.1和2IU116．抗壞血酸排空反應(yīng)

假孕（孕酮處理）、或出生后5~9d的大鼠

LH可排除假孕動(dòng)物黃體中抗壞血酸的原理

測定LH的活性，靈敏度可達(dá)0.125g靜脈注射待測樣本前除去一側(cè)卵巢

3h后除去另側(cè)卵巢

比較兩側(cè)卵巢的抗壞血酸含量兩者間差與劑量成比例催產(chǎn)素、促腎上腺皮質(zhì)激素的測定：適用127、微量生物測定法細(xì)胞培養(yǎng)生物測定法：

（bioassaybyinvitrocellculture）體外培養(yǎng)待測激素的靶細(xì)胞

測定激素作用后靶細(xì)胞的分泌物含量間接計(jì)算激素的生物活性13可用細(xì)胞測定法滿足條件：

1．靶細(xì)胞分泌可測定的物質(zhì)

如卵泡抑制素、GnRH2．測定分泌物的方法：

靈敏度高、操作簡便

快速（ELISA、RIA）3．激素作用的靶細(xì)胞：易分離

分離培養(yǎng)后具有分泌功能14二、免疫測定法（immunoassay）

免疫測定法：先標(biāo)記

同位素（放射性、非放射性、生物酶、熒光素）

標(biāo)記抗原（半抗原）或抗體檢測活性：免疫反應(yīng)產(chǎn)物中

結(jié)合的（抗原或半抗原-抗體結(jié)合物）

或游離的標(biāo)記物的活性間接計(jì)算待測激素含量15（一）種類放射免疫測定（radio-immunoassay，RIA）酶免疫測定（enzymeimmunoassay，EIA）熒光免疫測定

（fluorescenceimmunoassay，F(xiàn)IA）化學(xué)發(fā)光測定（chemiluminesceneimmunoassay，CLIA）16（二）基本原理與工作條件免疫反應(yīng)系統(tǒng)tAg+Ag*+Ab

tAg-Ab

+tAg

+Ag*-Ab

+Ag*

17分離系統(tǒng)方法：離心、洗滌材料：二抗、活性炭、固相載體等檢測系統(tǒng)：

酶、熒光、同位素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等18表2-14幾種免疫測定方法的工作原理與優(yōu)缺點(diǎn)比較

RIAEIAFIACL標(biāo)記物制備放射性同位素酶酶酶結(jié)合物與游離物分離炭或二抗固相化或二抗同左同左標(biāo)記物識讀射線計(jì)數(shù)測吸光值測熒光值化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度靈敏度(g/ml)10-9~10-1210-9~10-1310-9~10-1510-10~10-17重復(fù)性好較好較好一般準(zhǔn)確性高高較高較高測定所需時(shí)間/h24~1441.5~241.5~241.5~24操作自動(dòng)化程度半自動(dòng)化完全自動(dòng)化完全自動(dòng)化完全自動(dòng)化試劑保存時(shí)間2個(gè)月~數(shù)年數(shù)年數(shù)年數(shù)年操作防護(hù)放射防護(hù)不需要不需要不需要操作與應(yīng)用特殊實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)場地常規(guī)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)實(shí)驗(yàn)室對儀器設(shè)備要求高低較低較高環(huán)境潛在污染放射性同位素?zé)o無無方法種類少多較少較少19三、受體測定法原理：

激素與靶細(xì)胞上受體特異性結(jié)合親和力高

用激素的受體代替免疫測定中的抗體從而對激素進(jìn)行測定20優(yōu)點(diǎn)：

與免疫測定法相比

用受體測定法的結(jié)果更接近于生物測定

因?yàn)榧に刂挥信c其受體結(jié)合后

才能表現(xiàn)其生物學(xué)活性21方法種類

受體測定法：用激素的受體代替抗體放射受體分析法

（radioreceptor-assay，RRA）

酶標(biāo)受體測定法

（enzyme-labeledreceptor-assay，ERA）

熒光標(biāo)記受體測定法

（fluorescence-labeledreceptorassay，F(xiàn)RA）22四、理化測定方法分光光度法測定激素含量：20世紀(jì)50年代前

靈敏度較低、只能檢出mg/ml水平色譜法（chromatogram）、

電泳法（electrophoresis）所取代23（一）色譜法，又稱層析法色譜法分類：根據(jù)分離原理：

吸附、分配、離子交換、排阻色譜法等根據(jù)分離方法：

紙色、薄層、柱色、氣相、高效液相色譜法這些方法用于激素定量測定也可提取與純化24高效液相色譜

highpresionliquidchromatogram，HPLC

高壓縮液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱經(jīng)進(jìn)樣閥注入待測物，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，在柱內(nèi)各成分被分離后依次進(jìn)入檢測器，記錄儀或積分儀記錄色譜信號25氣相色譜

氣體為流動(dòng)相（稱載氣）色譜柱：填充柱、毛細(xì)管柱兩種填充柱內(nèi)裝吸附劑、高分子多孔小球或涂漬固定液的載體注入進(jìn)樣口的待測物被加熱氣化，并被載氣帶入色譜柱，各成分被分離后先后進(jìn)入檢測器，色譜信號用記錄儀或數(shù)據(jù)處理器記錄26吸附色譜法被分離物質(zhì)在吸附劑上被吸附能力的差異，用溶劑或氣體洗脫使組分得到分離的方法常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠、聚酰胺等有吸附活性的物質(zhì)27分配色譜被分離物質(zhì)在兩相中分配系數(shù)的不同使組分得到分離固相通常涂布或鍵合在固定載體上，液相為氣體或液體，稱為流動(dòng)相常用的固相載體有硅膠、硅藻土、硅鎂型吸附劑和纖維素粉等28離子交換色譜被分離物在離子交換樹脂上交換能力不同，可使組分得到分離常用的離子交換樹脂有不同強(qiáng)度的陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂，流動(dòng)相為水或含有機(jī)溶劑的緩沖液29分子排阻色譜凝膠色譜，被分離物質(zhì)分子大小的差異導(dǎo)致填料上滲透程度不同常用填料：分子篩、葡聚糖凝膠、微孔硅膠或玻璃珠等根據(jù)固定相和待測物的性質(zhì)選用水或有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相30紙色譜法

以紙為載體，以紙上所含水分或其他物質(zhì)為固定相，用展開劑進(jìn)行展開待測物經(jīng)展開后，可用比移值（Rf）表示各組成成分的位置影響Rf值的因素很多，因而一般采用在相同實(shí)驗(yàn)條件下與對照物質(zhì)對比以確定其異同31薄層色譜將適宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或鋁基片上，成一均勻挨薄層待點(diǎn)樣、展開后，與適宜對照物按同法所得的色譜圖作對比，用以進(jìn)行激素制品的鑒別、雜質(zhì)檢查或含量測定的方法32柱色譜用內(nèi)徑均勻、下端縮口的硬質(zhì)玻璃管作為色譜管，下端用棉花或玻璃纖維塞住，管內(nèi)裝入吸附劑吸附劑的顆粒應(yīng)盡可能保持大小均勻，以保證良好的分離效果33（二）電泳法在電場作用下，將激素（蛋白、肽類等）在電泳介質(zhì)中分離開測定電泳區(qū)帶圖譜或計(jì)算其含量34思考題（六）

1、簡要說明生物測定的種類、基本原理、注意事項(xiàng)。2、激素免疫測定的方法有哪些？簡要說明其基本原理和操作注意事項(xiàng)。3、受體測定有何意義？4、生物學(xué)測定、免疫學(xué)測定、受體測定和其他理化學(xué)測定各有何差異？35避孕節(jié)育

Contraception

激素利用36激素避孕宮內(nèi)節(jié)育器自然避孕法免疫避孕促黃體素釋放激素類似物避孕緊急避孕37一、激素避孕藥一）激素避孕機(jī)制激素避孕藥的作用：多環(huán)節(jié)、多方面藥物種類、劑量、劑型、途徑、方法38

1．抑制排卵干擾下丘腦-垂體-卵巢軸的功能避孕藥物－－抑制下丘腦釋放LHRH－－垂體分泌FSH、LH減少－－同時(shí)直接影響垂體對LHRH的反應(yīng)－－不出現(xiàn)排卵前LH高峰－－不發(fā)生排卵392．生殖器官的作用（1）改變宮頸粘液性狀

避孕藥中的孕激素－－使宮頸粘液量變少、高度粘稠－－不利于精子穿透40（2）改變子宮內(nèi)膜的形態(tài)、功能

著床關(guān)鍵：胚胎發(fā)育、子宮內(nèi)膜生理同步1）避孕藥的孕激素－－干擾雌激素效應(yīng)－－子宮內(nèi)膜增殖變化受抑制－－內(nèi)膜腺體停留在發(fā)育不完全階段－－不適于受精卵著床41

2）人工合成雌激素：大劑量：內(nèi)膜生長過快，與受精卵不同步小劑量：抑制內(nèi)源ES，而自身不足抑制內(nèi)膜生長42（3）改變輸卵管的功能

持續(xù)的雌、孕激素－－改變輸卵管正常的分泌活動(dòng)、蠕動(dòng)－－改變受精卵在其中正常運(yùn)行速度－－從而干擾受精的著床43二）激素避孕藥種類激素避孕藥分為四類口服避孕藥注射避孕針緩釋系統(tǒng)避孕藥透皮貼劑避孕藥44（一）口服避孕藥

oralcontraceptive,OC長效、短效口服避孕藥、探親避孕藥含雌、孕激素的復(fù)方制劑生育年齡健康婦女均可服用45（二）長效避孕針長期避孕方法之一主要含有經(jīng)酯化的孕激素經(jīng)肌內(nèi)注射后局部沉積儲存緩慢釋放發(fā)揮長效作用，有效率達(dá)98%單純孕激素類雌、孕激素復(fù)合制劑類46（三）緩釋系統(tǒng)避孕藥1．皮下埋植劑一種緩釋系統(tǒng)的避孕劑第一代產(chǎn)品稱NorplantI：6個(gè)硅膠囊每個(gè)含左炔諾孕酮（LNG）36mg，總量216mg第二代稱NorplantⅡ：2根硅膠棒每根含LNG70mg，總量140mg472．緩釋陰道避孕環(huán)

contraceptivevaginalring,CVR原理與皮下埋植相同將避孕甾體激素裝在載體上制成環(huán)狀放入陰道利用陰道粘膜上皮直接吸收藥物進(jìn)入血循環(huán)產(chǎn)生避孕效果48孕激素功能：1）干擾雌激素效應(yīng)－－子宮內(nèi)膜增殖變化受抑制－－內(nèi)膜腺體停留在發(fā)育不完全階段－－子宮內(nèi)膜變化不利于受精卵著床2）促使子宮肌安靜，脫落率降低3）副反應(yīng)小：腹痛、月經(jīng)不會過多

49三、自然避孕法推遲、提前排卵：生活、情緒、性活動(dòng)、健康、外界環(huán)境等因素影響安全期避孕法：不十分可靠失敗率可達(dá)20%50自然避孕法（naturalfamilyplanning,NFP）又稱安全期避孕法不用任何藥物、工具或手術(shù)方法順應(yīng)自然的生理規(guī)律利用月經(jīng)周期中產(chǎn)生的自然信號識別“易受孕期”、“不易受孕期”達(dá)到避孕的目的51日歷表法哺乳期閉經(jīng)避孕法基礎(chǔ)體溫測量法宮頸粘液檢查法52卵子自卵巢排出后可存活1~2日受精能力最強(qiáng)時(shí)間：排卵后24小時(shí)內(nèi)精子進(jìn)入女性生殖道：存活3~5日易孕期：排卵前后4~5日內(nèi)安全期：其余的時(shí)間不易受孕53確定排卵日期：下次月經(jīng)前14日基礎(chǔ)體溫、宮頸粘液檢查多數(shù)婦女月經(jīng)周期為28~30日54（1）正常月經(jīng)周期1－14：卵泡期15－28：黃體期1－7 8－14 15－21 22－281月經(jīng) 15排卵 26黃體退化1月經(jīng)（2）受精－－妊娠1－7 8－14 15－21 22－281月經(jīng)受精持續(xù)黃體1無月經(jīng)約12天妊娠診斷－HCG

55四、免疫避孕免疫避孕：機(jī)體自身的免疫防御機(jī)制來阻抑妊娠尚處在研究階段尚未用于臨床、前途廣泛56五、促黃體素釋放激素類似物避孕正處在研究之中大劑量外源LHRH類似物抑制垂體分泌阻礙了卵泡發(fā)育、排卵57六、輸卵管結(jié)扎手術(shù)

隔絕卵子運(yùn)輸阻止精子、卵子結(jié)合輸卵管融合可恢復(fù)生育58七、緊急避孕緊急避孕（postcoitalcontraception）：無保護(hù)性生活或避孕失敗或特殊情況性效（被強(qiáng)奸