晚期非小細(xì)胞肺癌 ctDNA 檢測及其臨床意義的研究

晚期非小細(xì)胞肺癌ctDNA檢測及其臨床意義的研究〔〕:

摘要：目的CtDNA是來自于腫瘤細(xì)胞的血液游離DNA，可以有效反映腫瘤的分子特征，這為我們研究晚期肺癌提供了重要的手段。方法獲得36例非小細(xì)胞肺癌外周血樣本，腺癌28例，鱗癌8例，均為臨床晚期患者。通過對患者外周血ctDNA二代測序獲得NSCLC樣本分子特征同時(shí)與臨床預(yù)后進(jìn)展分析。結(jié)果36例樣本中，EGFR突變13例〔36.11%〕，PIK3CA，BRAF、KRAS、NRAS、MAP2K1和GNAQ均有突變。11例患者存在多驅(qū)動(dòng)基因突變，包括8例患者存在雙基因突變，2例患者存在四基因突變，1例患者存在三基因突變。36例患者中有27例為治療后進(jìn)展患者，通過對27例治療后進(jìn)展患者的無進(jìn)展生存時(shí)間進(jìn)展分析，發(fā)現(xiàn)EGFR突變組顯著優(yōu)于EGFR陰性組〔17.174.52〕mVS〔7.331.58〕m，P=0.047。根據(jù)血液基因檢測結(jié)果進(jìn)展相應(yīng)的臨床用藥，單基因突變或者基因突變陰性患者的6個(gè)月生存率優(yōu)于多基因突變患者。結(jié)論晚期肺癌基因突變更為復(fù)雜，ctDNA檢測在晚期非小細(xì)胞肺癌治療中具有重要的指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：肺癌；ctDNA；二代測序

DetectionofctDNAinAdvancedNon-SmallCellLungCancerandItsClinicalSignificance

LINXiao1,DONGWen-tao2,LAIXiao-jing1,FENGWei1XIAOWen2,ZHENGXiao1*

(1.DepartmentofThoracicRadiotherapy,ZhejiangCancerHospital,Hangzhou,Zhejiang,310000;2.HangzhouHeyiGeneTechnologyCo.,Ltd.,Hangzhou,Zhejiang,310000)

ABSTRACT：ObjectiveCtDNAisbloodfreeDNAderivedfromtumorcellsandcaneffectivelyreflectthemolecularcharacteristicsoftumors.Thisprovidesanimportantmeansforustostudyadvancedlungcancer.Methods36casesofnon-smallcelllungcancerperipheralbloodsamples,28casesofadenocarcinomaand8casesofsquamouscellcarcinomawereobtained.ThemolecularcharacteristicsofNSCLCsampleswereobtainedbysequencingthectDNAoftheperipheralbloodofpatientsandtheclinicalprognosiswasanalyzed.ResultsInthe36samples,13(36.11%)EGFRmutations,PIK3CA,BRAF,KRAS,NRAS,MAP2K1andGNAQwereallmutations.Thereweremultipledrivergenemutationsin11patients,including8patientswithdoublegenemutations,2patientswithfourgenemutations,and1patientwiththreegenemutations.Twenty-sevenofthe36patientswerepost-treatmentpatients.Byanalyzingtheprogression-freesurvivalof27patientswhoprogressedaftertreatment,itwasfoundthattheEGFRmutationgroupwassignificantlybetterthantheEGFR-negativegroup(17.174.52)mVS(7.331.58)m,P=0.047)Accordingtotheresultsofbloodgenetictesting,the6-monthsurvivalrateofpatientswithsinglegenemutationorgenemutationnegativeisbetterthanthatofpatientswithmultiplegenemutations.ConclusionThegenemutationofadvancedlungcancerismoreplicated,andctDNAdetectionhasimportantguidingsignificanceinthetreatmentofadvancednon-smallcelllungcancer.

KEYWORDS：Lungcancer;CTDNA;Secondgenerationsequencing

0引言

肺癌是一類嚴(yán)重威脅人類生命安康的惡性疾病，目前針對肺癌的治療主要集中為手術(shù)、放化療、靶向治療等手段【1】。有研究報(bào)道，利用ctDNA檢測EGFR-TKI治療肺癌患者，發(fā)現(xiàn)EGFRT790M突變和MET擴(kuò)增是導(dǎo)致晚期肺癌EGFR-TKI耐藥的重要原因。本研究利用高通量測序技術(shù)，提取晚期肺癌患者血液DNA，通過生物信息學(xué)方法分析ctDNA突變特征，理解晚期肺癌藥物治療后的分子特征，為后續(xù)治療提供指導(dǎo)，同時(shí)探尋基因突變與疾病預(yù)后之間的關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料。研究對象為2022年1月至2022年10月在浙江省腫瘤醫(yī)院行血液ctDNA檢測的75例惡性腫瘤患者。挑選出36例晚期肺癌患者，經(jīng)組織病理學(xué)確認(rèn)為NSCLC，臨床分期為ⅢB-IVB期〔UICC第8版TNM分期〕，治療信息如附件。36例患者均采集外周血行ctDNA檢測。

1.2二代測序

1.2.1血液樣本及DNA提?。菏褂肧treck采血管采集10mL外周血，輕柔顛倒10次，6℃-35℃保存，備用。DNeasyBloodTissuekit〔Qiagen〕用于血液DNA提取，提取的DNA〔1〕Nanodrop檢測DNA的純度〔OD260/280比值〕。瓊脂糖凝膠電泳分析DNA降解程度以及是否有RNA、蛋白質(zhì)污染。Qubit對DNA濃度進(jìn)展準(zhǔn)確定量。其中OD值在1.8-2.0之間，含量在20ng以上的DNA樣品被用來建庫。

1.2.2文庫構(gòu)建及靶向捕獲：將獲得的ctDNA經(jīng)末端修復(fù)和加A尾后在片段兩端分別連接上接頭制備DNA文庫。采用自主研發(fā)的靶向捕獲芯片，經(jīng)過建庫和文庫捕獲進(jìn)展目的DNA的高效富集，然后在IlluminaNextSeqCN500平臺上進(jìn)展高通量、高深度測序。建庫使用的是KAPAHyperprepkit，測序使用的耗材為CN500配套中通量芯片，備案號：浙杭械備20220249，實(shí)驗(yàn)流程嚴(yán)格按照試劑盒和儀器說明書的最優(yōu)化流程進(jìn)展。

1.2.3測序及生信分析：根據(jù)庫檢合格文庫的有效濃度及數(shù)據(jù)產(chǎn)出需求進(jìn)展IlluminaCN500平臺PE150測序。測序完畢獲得原始測序序列〔RawData〕后，進(jìn)展質(zhì)控分析；變異信息通過BWA工具與人類基因組〔hg19〕進(jìn)展比對，通過GATK對測序片段進(jìn)展連接優(yōu)化，SNP/Indel通過VarScan2獲得，分析的結(jié)果通過千人基因組和dbSNP數(shù)據(jù)庫進(jìn)展過濾，以上分析均在杭州和壹基因科技完成。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)均使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料結(jié)果均以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差〔s〕表示，兩兩比擬采用Fisher準(zhǔn)確檢驗(yàn)，生存分析采用LogRank檢驗(yàn)，以P

2結(jié)果

2.1患者信息。本研究回憶分析36例NSCLC患者，其中男18例，女18例；年齡33-74歲，平均62歲；病理分型按照世界衛(wèi)生組織肺癌的組織學(xué)分類：腺癌28例，鱗癌8例；吸煙患者17例，不吸煙患者19例；首次治療患者9例，治療后進(jìn)展患者27例，臨床分期以IVB期為主。

2.2測序結(jié)果。本研究分析66個(gè)常見靶向用藥基因，36例患者共獲得43個(gè)用藥位點(diǎn)突變，27例〔75%〕患者至少攜帶一個(gè)靶向用藥位點(diǎn)突變，其中腺癌21例，鱗癌6例。28例腺癌患者中檢測出突變率最高的基因?yàn)镋GFR，突變率為42.86%〔12/28〕、其后依次為KRAS17.86%〔5/28〕、MAP2K110.71%〔3/28〕、PTEN10.71%〔3/28〕、PIK3CA7.14%〔2/28〕、BRAF7.14%〔2/28〕、HRAS3.57%〔1/28〕。8例鱗癌患者中檢測出PTEN和GNAQ的突變率為25%〔2/8〕，EGFR、PIK3CA、KIT的突變率為12.5%〔1/8〕。詳細(xì)結(jié)果如表1所示。

2.3多基因突變情況。共11例患者存在多驅(qū)動(dòng)基因突變，包括8例患者存在雙基因突變，2例患者存在四基因突變，1例患者存在三基因突變。多基因突變結(jié)果如表3所示。雙基因突變中，與EGFRp.T790M共同突變的情況最多，占50%〔4/8〕。

2.4EGFR突變與病理分型的關(guān)系。肺腺癌患者中EGFR突變率最高，到達(dá)42.86%，而在肺鱗癌患者中EGFR突變率為12.5%。通過對EGFR突變率與NSCLC病理分型進(jìn)展分析，發(fā)現(xiàn)肺腺癌EGFR突變率,高于肺鱗癌【2】。

2.5血液ctDNA檢測基因分析。對上述21例患者耐藥進(jìn)展后進(jìn)展血液ctDNA檢測，發(fā)現(xiàn)9例組織學(xué)檢測EGFR突變陰性患者中有8例檢測出基因突變〔88.9%，8/9〕，其中EGFR突變3例〔33.3%，3/9〕，KRAS、PIK3CA、MAP2K1突變各1例〔11.1%，1/9〕，BRAF、PTEN雙基因突變1例〔11.1%，1/9〕，KRAS、PTEN雙基因突變1例〔11.1%，1/9〕。12例組織學(xué)檢測EGFR突變患者中有3例在血液ctDNA檢測中發(fā)現(xiàn)突變基因消失〔25%，3/12〕，有4例伴隨有EGFRp.T790M突變〔33.3%，4/12〕，有3例發(fā)生突變基因改變〔25%，3/12〕，只有2例未發(fā)生改變〔16.7%，2/12〕。

對所有27例治療后進(jìn)展患者的血液ctDNA檢測結(jié)果進(jìn)展分析，有8例患者存在雙基因突變〔突變數(shù)=2〕，19例患者存在單基因突變或者突變陰性〔突變數(shù)

3討論

NSCLC是肺癌中最常見的類型，其病理分型主要為腺癌和鱗癌。目前認(rèn)為組織活檢是肺癌分子診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過對36例晚期NSCLC患者血液ctDNA靶向測序分析發(fā)現(xiàn)，27例患者存在至少一個(gè)基因突變，EGFR突變頻率最高，到達(dá)36.11%，其中腺癌為42.86%，鱗癌為12.5%。既往有文獻(xiàn)報(bào)道NSCLC血液ctDNA檢測EGFR突變率為20.4-43.0%，我們的結(jié)果與主流報(bào)道結(jié)果相一致。

EGFR突變是肺癌中突變頻率最高的用藥基因，尤其在東方人群中。研究發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌中EGFR突變高達(dá)47.9%-55.7%，而肺鱗癌突變頻率要低的多。多基因突變在肺癌治療中報(bào)道相對較少，過往研究報(bào)道多基因突變的頻率為3.13%-8.33%。我們的研究發(fā)現(xiàn)36例患者中有11例存在多基因或多位點(diǎn)突變，突變頻率到達(dá)30.56%，高于過往報(bào)道。我們推測可能有以下兩個(gè)原因，首先，36例患者均為晚期患者，且大局部為治療后出現(xiàn)進(jìn)展的患者，因此多基因突變情況存在升高的可能。其次，本研究的樣本組成差異導(dǎo)致檢測結(jié)果與過往報(bào)道存在一定差異[3-4]。對27例治療后進(jìn)展患者的ctDNA檢測結(jié)果進(jìn)展分析，有8例患者存在雙基因突變，19例患者存在單基因突變或突變陰性。根據(jù)血液ctDNA檢測結(jié)果進(jìn)展相應(yīng)的臨床用藥，多基因突變患者的6個(gè)月生存率低于單基因突變和基因突變陰性患者，兩者具有差異優(yōu)勢，但因局限于樣本數(shù)量，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們推測，多基因突變的患者，可能預(yù)示著更差的預(yù)后。

總之，本研究通過ctDNA二代測序提醒了一個(gè)真實(shí)世界晚期NSCLC患者治療進(jìn)展后的分子突變的特征，為液體活檢用于肺癌晚期患者分子診斷提供了一個(gè)可能。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)對耐藥進(jìn)展后的患者行血液ctDNA檢測，大局部患者發(fā)生了基因突變情況改變，因此對于耐藥患者再次進(jìn)展基因檢測是非常必要以及重要的。研究中我們還發(fā)現(xiàn)，多基因突變患者的6個(gè)月生存率低于單基因突變和基因突變陰性患者，可能預(yù)示著更差的預(yù)后。綜上，二次液體活檢對后續(xù)NSCLC患者的治療選擇及預(yù)后提示具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

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