微生物抗菌素敏感試驗

微生物抗菌素敏感試驗微生物抗菌素敏感試驗微生物抗菌素敏感試驗V:1.0精細(xì)整理，僅供參考微生物抗菌素敏感試驗日期：20xx年X月抗菌素敏感試驗一、實驗?zāi)康?、掌握藥敏試驗（K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法）方法、原理及結(jié)果判讀2、掌握抗酸染色方法及結(jié)果判定二、實驗原理1、抗菌藥物分類：（1）β-內(nèi)酰胺類：青霉素類和頭孢菌素類（硫酶素類、單內(nèi)酰環(huán)類、β-內(nèi)酰酶抑制劑、甲氧青霉素類)（2）氨基糖甙類：鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素、小諾霉素、阿奇霉素（3）大環(huán)內(nèi)脂類：紅霉素、白霉素、乙酰螺旋霉素、麥迪霉素、交沙霉素（4）四環(huán)素類：四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素（5）氯霉素類：氯霉素、甲砜霉素（6）作用于G+細(xì)菌的其它抗生素：林可霉素、氯林可霉素、萬古霉素、桿菌肽（7）作用于G-菌的其它抗生素：多粘菌素、磷霉素、、環(huán)絲氨酸、利福平、抗真菌抗生素、灰黃霉素（8）抗腫瘤抗生素：絲裂霉素、放線菌素D、博萊霉素、阿霉素（9）具有免疫抑制作用的抗生素：環(huán)孢霉素2、抗菌藥物敏感試驗(antimicrobialsusceptibilitytestinginvitro)1）抑菌試驗：體外測定抗菌藥物抑制細(xì)菌生長能力的試驗（1）紙片擴(kuò)散法（discdiffusiontest）K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法原理:將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上。紙片中所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后不斷地向紙片周圍區(qū)域擴(kuò)散形成遞減的梯度濃度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測試菌的生長被抑制,從而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度,并與該藥對測試菌的最低抑菌濃度(MIC)呈負(fù)相關(guān)。（2）稀釋法（dilusiontest）a.將被檢菌株接種于一組含有不同稀釋度抗菌藥物的培養(yǎng)基內(nèi)b.37℃18-24小時后，抗菌藥物能抑制被檢菌肉眼可見生長的最低濃度（MIC）即該菌對該抗菌藥物的敏感度c.MIC50MIC90d.根據(jù)MIC和常用劑量時該藥所能達(dá)到的血藥濃度來劃定細(xì)菌對各種藥物的敏感度或耐藥的界限（breakpoint,折點)（3）E試驗法（Etest）2）殺菌實驗3）聯(lián)合藥敏試驗4）檢測細(xì)菌所產(chǎn)生的抗生素滅活酶試驗3、藥物敏感性分級1）敏感（S）表示測試菌能被測定藥物常規(guī)劑量給藥后在體內(nèi)達(dá)到的血藥濃度所抑制或殺滅2）中介度（I）在敏感與耐藥之間建立緩沖帶，以減少因各種實驗條件失控對實驗結(jié)果的影響3）耐藥（R）表示測試菌不能被測定藥物常規(guī)劑量給藥后在體內(nèi)達(dá)到的血藥濃度所抑制4、結(jié)核分枝桿菌：（1）形態(tài)與染色：菌體細(xì)長略彎曲、有的呈分枝，抗酸染色陽性-抗酸桿菌，誘導(dǎo)可變?yōu)長型（Much）（2）培養(yǎng)特性——饞、懶、丑：專性需氧(obligateaerobes)、營養(yǎng)要求高——羅氏培養(yǎng)基、生長緩慢、固體培基—粗糙、菜花狀、液體培基—表面生長成菌膜。（3）抵抗力三抗：抗干燥、抗酸堿、抗堿性染料三敏感：濕熱、紫外線、70-75%酒精（4）結(jié)核桿菌最常發(fā)生毒力和耐藥性變異長期用藥易發(fā)生耐藥（5）M.Tb的致病性：疏水性阿拉伯-半乳聚糖-分枝菌酸索狀因子（海藻糖分枝菌酸酯）抑制線粒體呼吸蠟質(zhì)D(分枝菌酸與糖肽脂的復(fù)合物)：具有免疫佐劑作用磷脂-與結(jié)核結(jié)節(jié)的形成有關(guān)硫酸腦苷酯抑制吞噬體與溶酶體融合5、Acid-fast原理1）分枝桿菌的細(xì)胞壁內(nèi)含有大量的脂質(zhì)，主要是分枝菌酸，它包圍在肽聚糖的外面，所以分枝桿菌一般不易著色，要經(jīng)過加熱和延長染色時間來促使其著色。但分枝桿菌中的分枝菌酸與染料結(jié)合后，就很難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色。2）齊-尼氏抗酸染色法是在加熱條件下使分枝菌酸與石炭酸復(fù)紅牢固結(jié)合成復(fù)合物，用鹽酸酒精處理也不脫色。當(dāng)再加堿性美蘭復(fù)染后，分枝桿菌仍然為紅色，而其他細(xì)菌及背景中的物質(zhì)為蘭色。三、實驗材料金葡培養(yǎng)液：3套/桌；接種用棉棒兒：1支/人；MH瓊脂平板：1塊/人；各種抗菌紙片：3套/桌；鑷子：1把/人；Acid-fast初染劑：1瓶/2人；結(jié)核桿菌涂片：1張/人；濾紙：1張/人四、實驗內(nèi)容1、抗菌素敏感試驗1）用無菌棉棒兒蘸取菌液（金葡）2）將多余菌液在液面上方管壁內(nèi)輕輕旋轉(zhuǎn)擠出，涂布在MH瓊脂平板整個平面三次，每次旋轉(zhuǎn)60度，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周，以取得均勻接種3）平板加蓋室溫干燥3分鐘4）無菌操作，用鑷子將藥敏紙片貼在涂好菌的平板上，各紙片中心相距至少24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm紙片序號對應(yīng)的藥品：1.getamycin2.erythromycin3.vancomycin4.penicillin5）輕壓紙片使之緊貼瓊脂表面6）37℃18-24小時后測量抑菌圈直徑2、抗酸實驗1）初染：用玻片夾夾持涂片標(biāo)本，滴加石炭酸復(fù)紅2-3滴，在火焰高處徐徐加熱，切勿沸騰，出現(xiàn)蒸汽即暫時離開，若染液蒸發(fā)減少，應(yīng)再加染液，以免干涸，加熱5分鐘，待標(biāo)本冷卻后用水沖洗。2）脫色：3%鹽酸酒精脫色30s~1min；用水沖洗。3）復(fù)染：用堿性美蘭溶液復(fù)染1min，用水沖洗后用吸水紙吸干。4）用油鏡觀察五、實驗結(jié)果1．抗菌素敏感試驗結(jié)果，如下表1.不同抗生素抑菌環(huán)寬度測量抗生素種類測量直徑/mm紙片直徑/mm抑菌環(huán)寬度/mm123平均Vancomycin22.023.022.022.35.017.3Erythromycin17.016.017.016.75.011.7Gentamycin10.010.010.010.05.05.0Penicillin5.05.05.05.05.00.0金葡對于抗生素的敏感性排序：Vancomycin>Erythromycin>Gentamycin>PenicillinPenicillin的抑菌環(huán)幾乎沒有，說明實驗室的金葡對于青霉素耐藥。2．抗酸染色結(jié)果抗酸染色后，可見分支桿菌被染成紅色。六、思考與討論影響藥敏試驗結(jié)果的主要因素1、藥物因素

1）藥物理化性質(zhì)（1）藥物溶解性：藥品的溶解性決定了其能否在培養(yǎng)基上均勻擴(kuò)散，難溶的藥物無法完全擴(kuò)散，所得實驗結(jié)果會小于真實值。藥物穩(wěn)定性：臨床中常用的藥物試紙片一般是事先加工好的，極少是現(xiàn)用現(xiàn)做的，所以藥品試紙片中藥物含量必然受到其穩(wěn)定性的影響。針對本次實驗使用的抗菌藥物：青霉素類在自然條件下是非常不穩(wěn)定的，如青霉素鈉或鉀無論在酸性還是在堿性溶液中都會迅速分解，所以在加工藥敏試紙片過程中以及將試紙片放置到培養(yǎng)基上時，溶劑和培養(yǎng)基的PH值都會造成藥物效價的降低和藥敏結(jié)果的降低。紅霉素也是一種很不穩(wěn)定的藥物，它在弱堿情況下較為穩(wěn)定，但是當(dāng)PH小于6時紅霉素會很快分解，導(dǎo)致藥敏試驗結(jié)果的降低。2）藥物作用特點

（1）藥物抗菌作用機(jī)理：臨床中的抗菌藥物可以簡單的分成抑菌藥物和殺菌藥物兩種。殺菌藥物產(chǎn)生的抑菌環(huán)邊沿一般是非常明晰清楚，而抑菌藥物產(chǎn)生的抑菌環(huán)邊沿是模糊的。所以在藥敏試驗結(jié)果判斷上，抑菌藥物和殺菌藥物抑菌環(huán)（帶）大小很難確定，并且隨著培養(yǎng)時間的延長和藥物的失效，抑菌藥物抑菌環(huán)（帶）邊沿未被殺死的細(xì)菌有可能又恢復(fù)生長，從而導(dǎo)致抑菌環(huán)（帶）的進(jìn)一步縮小。針對本次實驗使用的抗菌藥物：抑菌藥物有：青霉素、紅霉素、萬古霉素殺菌藥物有：慶大霉素（2）作用適宜PH值：藥物的作用強(qiáng)弱存在最適宜的PH值

（3）藥物有效部位：有些藥物的抗菌作用是不能通過體外藥敏試驗來判斷的，它們只有在體內(nèi)進(jìn)一步分解（或轉(zhuǎn)化）后才能表現(xiàn)出抗菌作用

（4）離子的影響：常用的許多藥物可以受到各種離子的影響而導(dǎo)致抗菌作用降低甚至喪失。如許多重金屬離子（銅、鋅、汞）等可以破壞青霉素鈉(或鉀)的活性，使其抗菌作用降低。所以在進(jìn)行藥物敏感性試驗時應(yīng)該選用無離子水和高質(zhì)量的營養(yǎng)瓊脂。

（5）其他因素：藥物自身性質(zhì)影響因素還包括藥物蛋白結(jié)合率、作用溫度等多方面因素。

2、培養(yǎng)基

1）培養(yǎng)基厚度：影響藥物擴(kuò)散，培養(yǎng)基厚度越大藥物的抑菌環(huán)越小。抑菌試驗常用的培養(yǎng)基厚度一般為5mm左右。

2）用水的質(zhì)量：主要是礦物質(zhì)離子的影響，如Ca2+、Mg2+、Al3+等離子，它們可能使某些藥物失活。

3）PH值：影響藥物穩(wěn)定性和活性。。

4）培養(yǎng)基成分：培養(yǎng)基配制濃度較高或融化不良以及厚薄不均等均可能影響藥物擴(kuò)散；培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)可能和部分蛋白質(zhì)結(jié)合率高的藥物結(jié)合而影響藥敏試驗結(jié)果。藥物蛋白質(zhì)結(jié)合率如：青霉素≧50%、紅霉素≧70%；而氨基糖苷類藥物結(jié)合率卻很低（20%左右）。培養(yǎng)基中的雜質(zhì)的種類也可能在某些方面影響藥敏試驗的結(jié)果。

3、細(xì)菌因素

細(xì)菌的菌層厚?。ɑ蛲烤亩嗌伲┖图?xì)菌生長的特性是影響藥敏結(jié)果的主要因素。藥物殺滅細(xì)菌存在一定的量比，藥敏試驗培養(yǎng)基上細(xì)菌層越厚抑菌環(huán)就越小，反之抑菌環(huán)就越大。有些細(xì)菌在培養(yǎng)基上生長時會發(fā)生移動（鞭毛運動），當(dāng)藥物失效或培養(yǎng)時間太長，這類細(xì)菌有可能向已經(jīng)形成的抑菌環(huán)移動，這也導(dǎo)致抑菌結(jié)果判斷的失誤。

4、試紙片因素

1）藥物含量的多少：試紙片上藥物含量的多少應(yīng)該是影響藥敏結(jié)果的最主要因素。由于紙片法藥敏試驗本身就是一種定性藥物敏感性試驗，試紙片含藥量沒有統(tǒng)一規(guī)定，各個生產(chǎn)單位都是根據(jù)各自的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行加工，所以試紙片藥物種類和含量不同判斷標(biāo)準(zhǔn)也不同，藥物之間沒有明確的可比性。目前許多獸藥企業(yè)自己生產(chǎn)藥敏試紙片和產(chǎn)品的藥敏試紙片，有的企業(yè)為了提高產(chǎn)品的藥敏結(jié)果而加大產(chǎn)品藥敏紙片中藥物含量也在所難免，所以通過藥敏試驗中抑菌環(huán)大小來判斷細(xì)菌對不同藥物的敏感性是不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)摹?）試紙片材質(zhì)：試紙材質(zhì)對藥敏試紙片中藥物穩(wěn)定性以及活性有很大影響。加工藥敏試紙片的試紙一般是使用加厚型的定性或定量濾紙，這種濾紙含有雜質(zhì)少，對藥物保存沒有太大影響。但是，臨床中許多企業(yè)加工的是紙片是選用普通紙，這些普通紙用水浸潤后一般為堿性或含有大量無機(jī)離子，使用普通紙加工的試紙片藥物受到很大影響。也有些企業(yè)使用薄型的濾紙片，加工過程中