分子生物學(xué)重點(diǎn)知識(shí)總結(jié)

分子生物學(xué)一、名詞解釋1.ORF答:ORFopenreadingframeDNA列，叫做一個(gè)開放閱讀框架。結(jié)構(gòu)基因答：結(jié)構(gòu)基因（structuralmRNA肽鏈，構(gòu)成各種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)或催化各種生化反應(yīng)的酶和激素等。斷裂基因RNA的核酸序列，還包括保證轉(zhuǎn)錄所必需的調(diào)控序53splitgen。選擇性剪接答：選擇性剪接（也叫可變剪接）mRNAmRNA表型。5.CDNA倍體基因組DNA的總量成為C值Cvalu。生物大分子糖類。酚抽提法1976年由Stafford以含EDTASDS及無(wú)DNA酶的RNAKpH8.0的Tris飽和酚抽提DNA根據(jù)不同需要進(jìn)行透析或沉淀處理獲得所需的DNA凝膠過濾層析混合物最有效的方法之一。多重PCRPCR泳或毛細(xì)管電泳等技術(shù)加以鑒別。熒光域值答：熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在10退火37-58℃時(shí)，變性的DNA重新形成氫鍵開始復(fù)性?；蛟\斷康狀態(tài)和疾病做出診斷的方法。PCRPCRPCRPCR板進(jìn)行定量分析的方法。二、問答題什么是SNP？試述研究SNPDNADNADNAsinglenucleotidepolymorphism，SNP）和串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性（tandemrepeatspolymorphism）兩類。研究SNPDNADNA1kp就存在一個(gè)SNP300萬(wàn)個(gè)之多，遠(yuǎn)多于其它類型的DNA多態(tài)性，是人群中個(gè)體差異最具代表性的DNA多態(tài)性，相當(dāng)一部分還直接或間接與個(gè)體的表型SNP被認(rèn)為是一種能穩(wěn)定遺傳的早期突變。簡(jiǎn)要介紹質(zhì)粒并舉例說明其在分子生物學(xué)中的用途。答：質(zhì)粒（plasmid）是一類染色體外具有自主復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子，屬染色體外基因組。質(zhì)粒與致病菌的毒力及耐藥性有關(guān)，又是基因工程的常用載體，因而具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值。其在分子生物學(xué)中的用途有：1.質(zhì)粒DNA編碼多種蛋白質(zhì)，有的與質(zhì)粒自身的復(fù)制和穩(wěn)定性有關(guān)，有的控制宿主細(xì)胞的各種性狀，如各種抗性、代謝能力、致病性、接合轉(zhuǎn)移等。根據(jù)宿主的表型可識(shí)別質(zhì)粒的存在，這一性質(zhì)廣泛應(yīng)用于重組菌的篩選和鑒定。2.質(zhì)粒的不相容性常用于質(zhì)粒的分類?；蚬こ讨幸再|(zhì)粒為載體進(jìn)行基因克隆也是利用了質(zhì)粒的不相容性原理。理。工作流程（Gel-basedworkflow）和基于液相色譜的工作流程LC-basedworkflo。在這兩種流程中，基于凝膠的工作流程是目和MALDI—TOFMDLC。簡(jiǎn)述酵母雙雜交技術(shù)的原理及其用途。功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域（domain）構(gòu)成，其中有DNA結(jié)合功能域（DNAbindingdomain，DNA-BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activationdomai，DNA-AD。這兩個(gè)結(jié)合域?qū)⑺鼈兎珠_時(shí)仍分別具有功能，但GAL4activatingsequence，UAS）的下游啟動(dòng)子，使啟動(dòng)子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。2.利用酵3.利用酵母雙雜交4.利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖GenomeProteinLinkageMa4/8分子克隆技術(shù)包括哪些基本步驟？答：分子克隆技術(shù)的基本步驟大致包括：①目的基因的獲??；②載體的選擇；③目的基因與載體連接；④重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞；⑤重組體的篩選等；即分、切、接、轉(zhuǎn)、篩等過程。目的基因和載體連接主要有哪些方法？答：目的基因與載體構(gòu)建成重組體的方法主要有：1).粘性末端DNA分子的連接2).平末端連接法3).通過同聚尾連接。簡(jiǎn)述分子克隆中常用的工具酶及其作用。它是一類能識(shí)別和切割雙鏈DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶；2.DNA35反轉(zhuǎn)錄酶，其功能主要有：1)2)H3)DNADNADNADNA5'DNA片段連接起DNADNARNA或dNTP5'1)在載體或目的基因3'末端加上互補(bǔ)的同質(zhì)多聚尾，形DNA2)DNA3'末端的同位素探針標(biāo)記；7.S1，DNAcDNARNA和DNA-RNA舉例說明載體應(yīng)具備的基本要素。適宜的分子量，一般應(yīng)<10kb；2)帶有遺傳篩選標(biāo)記；3)有適當(dāng)?shù)南拗泼盖形稽c(diǎn)，便于外源基因的插入和篩選。簡(jiǎn)述雙抗生素篩選和藍(lán)白斑篩選的原理。AmprTetr等，當(dāng)帶有完整抗性基因的載體轉(zhuǎn)化無(wú)斑，未轉(zhuǎn)化菌不能存活，但應(yīng)排除未重組的空載體。2lacZ基因，該基因含一段編碼β-半乳糖苷酶氨基末端145個(gè)氨基酸α-肽的DNAIPTG碼的缺陷型β-半乳糖苷酶實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)α-互補(bǔ)，形成完整的β-半乳糖苷酶。該酶能催化指示劑底物X-gal形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源基因lacZMCS，lacα-肽基因閱讀框架被破壞，細(xì)菌內(nèi)將無(wú)β-半乳糖苷酶活性，結(jié)果重組克隆呈白色菌落。有哪些常用的探針標(biāo)記物？答：常用的探針標(biāo)記物有：1.放射性同位素標(biāo)記，常用標(biāo)記探針的同位素有32P、3H、35S、131I、125I等。2.非放射性標(biāo)記，常用的非放射標(biāo)記物有辣根過氧化物酶（HRP)、熒光素、生物素、光敏生物素、地高辛(DIG)等。如何進(jìn)行探針的標(biāo)記？末端標(biāo)記法和反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記法等。2.非放射性標(biāo)記核酸探針的方法分影響核酸分子雜交的因素有那些？如何進(jìn)行雜交條件的優(yōu)化？針的濃度、溫度、雜交液的成分、反應(yīng)時(shí)間等。DNAcDNA酸探針，在檢測(cè)單鏈靶序列時(shí)應(yīng)選用與其互補(bǔ)的DNA單鏈探針或RNA234520h6Tm值5~127DNA雜交的標(biāo)準(zhǔn)雜交液為5SSC,1.0%casein0.1%十二烷基肌氨酸，0.02%DNA1、根據(jù)作用原理生物分子的分離純化有那幾類？答：根據(jù)作用原理生物分子的分離純化可分為1）根據(jù)分子極性大小和溶解度的不同，如溶劑提取技術(shù)、鹽析法、分配層析法、分級(jí)沉（）根據(jù)分子形狀和大小不同，如凝膠過濾層析等3）根據(jù)物質(zhì)吸附性質(zhì)不同，如選擇性吸附與吸附層析法等4）根據(jù)分子（電離性質(zhì)（5）根據(jù)配體特異性，如親和層析。2、什么原因易引起DNA降解，該如何解決？DNA2）3）4）5）反復(fù)凍融。相應(yīng)的解決方法有：1）盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融；液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液2）內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA3）細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔4）所有試劑用無(wú)菌水配制，5）將DNA3、簡(jiǎn)述PCR技術(shù)的基本原理答：PCRDNADNA、引物dNTPDNADNAdNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP、引物1、引物2、TaqDNA聚合酶、緩沖液及Mg2+（MgCl2，DNA三步完成。4、簡(jiǎn)述PCR實(shí)驗(yàn)中常見的問題及其對(duì)策。答：1）（1）PCR前后工序分（2）Eppendorf（4）操作人員必須戴手套進(jìn)行操作（5）體濺出。2）PCRPCR（）引物特異性不高，引物用量過多，應(yīng)調(diào)換引物或降低引（2）TaqDNA聚合酶質(zhì)量不好或用量偏高，應(yīng)降低酶量或使（3）Mg2+濃度過高，可適當(dāng)調(diào)節(jié)Mg2（4）延伸時(shí)間，或者采用二溫循環(huán)PCR（5）熱循環(huán)次數(shù)過多，適當(dāng)增加模板用量，減少循環(huán)次數(shù)。3）假陰性，可考慮以下原因并（1）引物設(shè)計(jì)是否合理，有無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)形成，尤其是引3’端應(yīng)無(wú)發(fā)夾結(jié)構(gòu)（2）標(biāo)本中是否有Taq（3）反應(yīng)體系中有無(wú)蛋白酶或DNADNA95℃10（4）反應(yīng)體系中是否有較難去除的蛋白質(zhì)抑制PCR白酶K（5）循環(huán)溫度，特別是解鏈溫度是否準(zhǔn)確，退火溫度是否過高。有些PCR（6）檢測(cè)PCR靶序列發(fā)生突變、缺失等。4）（1）兩個(gè)相同的或不同的引物分子之3’端（2）（3）退火溫度（4）熱循環(huán)次數(shù)過多。5、簡(jiǎn)述實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的基本原理？答：在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線。基因診斷基因診斷常用到的方法有哪些？2）4）bDNA5）NASBA、6）測(cè)序。TaqMan答：1）.TaqMan技術(shù)引物的設(shè)計(jì)原則：序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)441824（引物需Tm值在5－65℃GC含量在4060TM相2℃；引物的3’端避免使用堿基A，引物的333Taqman探針技術(shù)要求片段長(zhǎng)度在50bp－150bp；引物末端（5）2G和C。2）.TaqMan技術(shù)探針的設(shè)計(jì)原則：先選擇好探針，然后設(shè)計(jì)引物使其盡可能的靠近探針；探針長(zhǎng)度應(yīng)在20-30bp)，以保證結(jié)合特異性；探針的DNATm值在65-7℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃，以確保40%－70%；5’端應(yīng)避免使用G5'GC明顯高于G列在blast如何對(duì)鐮刀形細(xì)胞貧血和地中海貧血進(jìn)行基因診斷？β珠蛋白基因發(fā)生了突變，導(dǎo)致β6（密碼子GAG）酸（密碼子GT。因此，對(duì)鐮刀形細(xì)胞貧血的基因診斷方法可有：1>PCR-RFLPA→TDNA和患者DNASouthernDNAM