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精選優(yōu)質(zhì)文檔-----傾情為你奉上精選優(yōu)質(zhì)文檔-----傾情為你奉上專心---專注---專業(yè)專心---專注---專業(yè)精選優(yōu)質(zhì)文檔-----傾情為你奉上專心---專注---專業(yè)FlowJo軟件的簡單介紹和基本應(yīng)用FlowJo是九十年代美國斯坦福大學(xué)LeonardHerzenberg(FACS機(jī)器的發(fā)明者)實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的一款流式數(shù)據(jù)分析軟件。這款分析軟件功能強(qiáng)大,操作簡單,易學(xué)易用,可在Windows或者M(jìn)ac系統(tǒng)下安裝使用。它簡單直觀的操作平臺,已被領(lǐng)域內(nèi)的科學(xué)家、實(shí)驗(yàn)室廣泛使用。同時(shí),他也是各期刊雜志引用最多的流式數(shù)據(jù)分析軟件。FlowJo電腦配置及安裝環(huán)境PC:操作系統(tǒng):Vista、Windows7內(nèi)存:512MBRAM及以上MAC:操作系統(tǒng):OSX10.3或更高版本內(nèi)存:512MBRAM及以上安裝環(huán)境:避免陽光直射,水平放置,遠(yuǎn)離水源、熱源FlowJo基本功能介紹1.階梯式設(shè)門:將細(xì)胞群之間的邏輯關(guān)系用簡單、遞進(jìn)的階梯式去呈現(xiàn),一改傳統(tǒng)復(fù)雜的邏輯門設(shè)置。并可以自定義細(xì)胞群名稱,進(jìn)而直觀的顯示細(xì)胞群統(tǒng)計(jì)值,讓分析結(jié)果一目了然。如圖2.多種圖像顯示方法及顯示類型:顯示方法:它可以呈現(xiàn)為一維的直方圖,二維圖及三維立體圖。如圖一維圖二維圖三維圖顯示類型:除了傳統(tǒng)使用的散點(diǎn)圖外,還有密度圖,等高圖,偽色圖,斑馬圖等。如圖3..多種設(shè)門工具:設(shè)門是流式數(shù)據(jù)分析中界定細(xì)胞目標(biāo)群的必要手段,不管檢測的目標(biāo)細(xì)胞群是規(guī)則分布還是不規(guī)則分布的,是小概率事件還是集體事件,都可以很方便的界定各種細(xì)胞群。如圖蜘蛛門四分門矩形門、橢圓門、自動門4.多種分析平臺及工具:特殊的分析平臺:細(xì)胞周期,細(xì)胞增殖,鈣離子流量,反向設(shè)門等。獨(dú)特的分析工具:門的批處理,樣品的熒光補(bǔ)償。5.靈活方便的數(shù)據(jù)導(dǎo)出:無論是圖形數(shù)據(jù)還是表格數(shù)據(jù)都可以用Ofice軟件、Powerpoint或直接打印,輸出的表格數(shù)據(jù)可保存為HTML,SQL等格式。FlowJo的基本應(yīng)用:1.單標(biāo)樣本的分析方法:雙擊桌面Flowjo軟件圖標(biāo),進(jìn)入軟件工作臺。軟件工作臺由菜單欄、工具欄、組空間和樣本空間組成(見圖1)。將要分析的數(shù)據(jù)組拖至組空間中,單擊選中分析組(3colorcomp),此時(shí)在樣本空間里便會顯示分析組里的所有樣本。然后雙擊樣本空間中的樣品(Cy5PE.fcs),出現(xiàn)圖形窗口(以二維點(diǎn)圖的形式,見圖二)。圖一圖二X軸選擇SSC(側(cè)向散射),Y軸選擇FSC(前向散射),然后選擇設(shè)門工具(矩形門、橢圓門、多邊形門、自動門)中任一種。如圖三,用橢圓門選中要分析的細(xì)胞群。在圖形窗口中雙擊選中的細(xì)胞群,生成新的圖形窗口。在X軸選擇CD4,Y軸選擇Histogram,選擇設(shè)門工具(區(qū)域門、雙分門)中任意一個(gè),在單參數(shù)直方圖中設(shè)門。雙分門設(shè)門如圖四,左邊區(qū)域?yàn)镃D4陰性細(xì)胞,右邊為CD4陽性細(xì)胞(見圖五)。圖三圖四圖五2.圖形的輸出和保存:a.在單參數(shù)圖上點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵選擇復(fù)制圖片,可以吧圖片粘貼到Word、Excel、PPT中。b.在圖形分析窗口菜單欄中選擇“文件”并單擊,選擇下拉菜單中的“另存為”,選擇保存位置、命名文件名稱以及文件保存類型。c.在Flowjo工作臺單擊打開布局編輯器,在樣本空間中把CD4細(xì)胞的節(jié)點(diǎn)拖入布局編輯器中,在布局編輯器中點(diǎn)擊保存按鈕,在彈出的對話框中選擇保存的路徑,名稱及圖片格式。如圖六、七所示:圖形布局編輯器圖形布局編輯器圖六圖七3.多色樣本的分析方法:打開分析軟件,將要分析的數(shù)據(jù)拖至工作臺。在樣本空間中雙擊要分析的樣本,出現(xiàn)圖形窗口,顯示為二維點(diǎn)圖。X軸選擇FSC,Y軸選擇SSC。然后選擇多邊形設(shè)門工具,在點(diǎn)圖中選中要分析的細(xì)胞群(如圖八),雙擊門出現(xiàn)圖形窗口,X軸選擇CD3,Y軸選擇FSC。使用矩形門選中CD3陽性細(xì)胞群,并命名為T細(xì)胞。雙擊T細(xì)胞門,出現(xiàn)圖形窗口,在X軸選擇CD4,Y軸選擇CD8,使用十字門設(shè)門(如圖九),其中Q1區(qū)域?yàn)?CD8+,Q2區(qū)域?yàn)?CD8+/CD4+,Q3區(qū)域?yàn)?CD4+,Q4區(qū)域?yàn)椋篊D8-/CD4-,見圖十。圖八圖九圖十4.雙指數(shù)轉(zhuǎn)換:如下圖,圖中所設(shè)的門范圍很小,但卻顯示里面的細(xì)胞比例高達(dá)35.1%,這說明有很多細(xì)胞壓在了坐標(biāo)軸上。這時(shí)可以在X軸和Y軸點(diǎn)擊坐標(biāo)軸邊上的T按鈕,在彈出的下拉列表中選擇“用雙指數(shù)轉(zhuǎn)換”,如圖十一、十二所示:圖十一圖十二注:雙指數(shù)轉(zhuǎn)換只是更改了數(shù)據(jù)呈現(xiàn)的方式,不會對數(shù)據(jù)本身做任何更改。5.批處理功能:a.樣品的批處理:將一組數(shù)據(jù)重的標(biāo)準(zhǔn)品Sample1分析完成后,按住ALT鍵,在工作臺中單擊樣品Sample1下的節(jié)點(diǎn),將其拖到組空間的TitrationData組上,這樣就對該組中的所有樣本都進(jìn)行了與Sample1樣本中一樣的設(shè)門和數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)。如圖十三、十四:圖十三圖十四b.圖片的批處理:打開工作臺常用工具欄中的布局編輯器將工作臺中,將工作臺中Sample1樣本下的分析節(jié)點(diǎn)拖入布局編輯器,點(diǎn)擊布局編輯器右上角的批處理按鈕“Batch”,如下圖,便能得到圖片的批處理結(jié)果。圖十五圖十六注意事項(xiàng):1.二維點(diǎn)圖的設(shè)門原則二維點(diǎn)圖常用四分門來設(shè)門,四分門設(shè)門要根據(jù)陰性對照界定陰性區(qū)。根據(jù)細(xì)胞分群的趨勢,四分門的界定線可設(shè)置陰性、陽性細(xì)胞的分群處。2.多色標(biāo)記分析說明多色樣本分析在實(shí)驗(yàn)室中具有重要的地位,只要把多色的分析簡化為單標(biāo)記和雙標(biāo)記的分析,問題就會迎刃而解。例如:檢測treg需要標(biāo)記CD4/CD25
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