男科學(xué)實驗室診斷進展

關(guān)于男科學(xué)實驗室診斷進展第1頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五

精液分析是評價男性生育能力的最基本檢驗手段。理論上，精液分析是一個很簡單的操作過程，只要將一滴精液置于玻片上，進而確定其相關(guān)參數(shù)即可。然而，實際上，精液分析所得的每一個參數(shù)都需要大量的專業(yè)知識、細致認真的操作及必要的質(zhì)量控制措施。第2頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五

Keel等報告了美國紐約、哥倫比亞、洛山磯、明尼蘇達幾百家男科實驗室對精子密度、形態(tài)學(xué)、活率及抗精子抗體的室間質(zhì)量控制結(jié)果，精子密度的結(jié)果顯示，一份精液標(biāo)本的精子密度差異范圍達3~492×106/ml，手工檢測的變異系數(shù)（CV）為30%~138%，計算機輔助的精液分析（CASA）的CV為24%~99%。不同實驗室精子密度的較大差異提示，精子計數(shù)方法的不同、計數(shù)池種類的不同以及操作的標(biāo)準化對精子計數(shù)結(jié)果有著直接的影響。第3頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五一、精液常規(guī)檢查

1、精液檢測工具不斷更新（1）血細胞計數(shù)板沿用50余年

（2）Makler精子計數(shù)板1978年以色列Makler發(fā)明（3）Macro精子計數(shù)板（4）Microcell計數(shù)池1990年Ginabury和Armand發(fā)明一次性使用（5）2004年，美國MillenniumSciences公司Cell-VU精子記數(shù)池和Cell-VU預(yù)染色形態(tài)載波片。

第4頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五計算機輔助的精液分析

80年代發(fā)展的新技術(shù)，除可分析精子密度、活動百分率等指標(biāo)外，在分析精子運動能力方面顯示了其獨特的優(yōu)越性。第5頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五第6頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五第7頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五第8頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五第9頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五第10頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五第11頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五第12頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五全自動精子分析儀（以色列）MedicalElectronicSystems第13頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五

用已知濃度的乳膠珠溶液對目前國際上常用的３種精子計數(shù)池進行了評價。

３種精子計數(shù)池的質(zhì)量評估第14頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五1材料與方法1.1實驗材料

Cell-VU計數(shù)池（MillenniumSciencesInc，NewYork，USA）Makler計數(shù)池（Sefi-MedicalInstrument，Haifa，Israel）血球計數(shù)池（上海求精生化試劑儀器有限公司）標(biāo)準乳膠珠溶液（HamiltonThorneBiosciences，USA）2份，濃度分別為：（35±5）×106/ml，（18±2.5）×106/ml。第15頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五1.２方法1.2.1Cell-VU計數(shù)法1.2.2Makler計數(shù)法1.2.3血球計數(shù)池法1.３統(tǒng)計學(xué)分析

不同計數(shù)池的計數(shù)結(jié)果以x±s表示，樣本均數(shù)的比較采用t檢驗

第16頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五2結(jié)果ChambernConcentrationforstandardsolution1Concentrationforstandardsolution2Cell-VU3037.63±4.8918.22±1.77Hemacytometer3042.74±4.98*20.48±1.56*Makler1553.52±6.67*△24.97±4.75*△表1不同精子計數(shù)池的乳膠珠濃度與Cell-VU計數(shù)池相比，*：P<0.001；與血球計數(shù)池相比，△：P<0.001第17頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五Cell-VU計數(shù)池的濃度最接近標(biāo)準乳膠珠的濃度，平均變異系數(shù)（CV）分別為7.51%和1.22%，而血球計數(shù)池的CV分別為22.11%和13.78%，Makler計數(shù)池的CV分別為52.91%和38.72%。提示，Cell-VU計數(shù)池計數(shù)結(jié)果最準確，而血球計數(shù)池和Makler計數(shù)池計數(shù)結(jié)果明顯偏高，尤以Makler計數(shù)池與標(biāo)準乳膠珠濃度相差最大，差異達52.91%。

第18頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)控是保證不同實驗室結(jié)果準確和可靠的重要措施之一。精子計數(shù)是男科實驗室目前考慮較多的質(zhì)控項目之一，目前最大的挑戰(zhàn)來自精子計數(shù)方法學(xué)的標(biāo)準化和監(jiān)測。本研究顯示，Cell-VU計數(shù)池的準確性和精確性均優(yōu)于血球計數(shù)池和Makler計數(shù)池，與文獻報道一致。而且，Cell-VU可一次性或反復(fù)多次使用，這在計數(shù)傳染性較強的樣本時將顯示出獨特的優(yōu)勢。因此，我們建議要建立一個標(biāo)準的計數(shù)池操作系統(tǒng)用于所有實驗室，從而為不同實驗室的質(zhì)量控制評價提供基礎(chǔ)，最終提高所有實驗室結(jié)果的準確性和可靠性。Cell-VU應(yīng)是此標(biāo)準計數(shù)池的最佳選擇。

第19頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五2.精子功能測定

（1）傳統(tǒng)經(jīng)典的“倉鼠卵穿刺實驗”（2）精子-宮頸粘液穿透試驗（3）毛細管穿透試驗（4）低滲腫脹試驗（5）吖啶橙染色(熒光顯微鏡)

（6）精子DNA完整性檢測（流式細胞儀）

第20頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五

精子DNA完整性檢測亦稱精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，SCSA），是應(yīng)用流式細胞儀檢測精子功能的方法之一。精子發(fā)生過程中，魚精蛋白逐步取代組蛋白與DNA結(jié)合。精子進入附睪后，魚精蛋白的組成不再改變。但附睪中精子在逐步成熟的過程中，魚精蛋白中大量的巰基(SH)不斷被氧化成二硫鍵(S=S)，與DNA結(jié)合更加緊密，使DNA更具抗酸能力，維持了雙鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。精子DNA完整性檢測（流式細胞儀）第21頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五

而染色質(zhì)異常的精子，魚精蛋白中多數(shù)巰基未被氧化，在酸的作用下易變性為單鏈DNA。根據(jù)這一原理，用酸處理精液樣品，再行吖啶橙(AO)染色，AO可與雙鏈DNA結(jié)合呈單體形式發(fā)出綠色熒光，與單鏈DNA結(jié)合呈聚合物形式發(fā)出紅或黃色熒光。然后通過配有專用軟件的流式細胞儀可進行數(shù)據(jù)處理得出SCSA參數(shù)。精子DNA完整性檢測（流式細胞儀）第22頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五二、生精細胞檢查與睪丸活檢1、生精細胞檢查精液中除成熟的精子外，亦可見未成熟的生精細胞，包括精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、早期和晚期精子細胞等

生精細胞檢查方法：

染色法熒光原位雜交單克隆抗體免疫組化法流式細胞術(shù)第23頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五2、睪丸活檢

開放活檢、細針穿刺、活檢槍、高能多譜勒超聲為基礎(chǔ)的睪丸活檢

70年代FSH可用放免方法測定，F(xiàn)SH水平可以反映生精功能受損程度，睪丸活檢范圍逐漸縮小，其適應(yīng)證僅限于睪丸體積正常、FSH水平正?；蜉p度增高的無精子癥病人。

80年代，精漿生化指標(biāo)的測定可排除阻塞性無精子癥，睪丸活檢范圍更小。近年來，隨著顯微外科的發(fā)展和顯微受精技術(shù)的應(yīng)用，從精液中分離一條精子即可使卵子受精達到生育目的。因此，需行睪丸活檢的病例更是寥寥無幾。第24頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五三、白細胞精子癥的檢測

精液白細胞數(shù)>1×106/ml，可診斷為白細胞精子癥白細胞可通過吞噬作用、產(chǎn)生活性氧（ROS）、分泌一些細胞因子等途徑使精子損傷。精液中粒細胞為產(chǎn)生ROS的主要細胞。

第25頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五精液中白細胞的檢測方法；1、對ROS的檢測：依賴魯米諾的化學(xué)發(fā)光分析法2、直接鏡檢法3、瑞-姬染色或巴氏染色法染色4、過氧化物酶染色法（正甲苯胺蘭、聯(lián)苯胺及鄰甲苯胺過氧化物酶染色）5、熒光原位雜交法6、免疫細胞化學(xué)法CD45，CD4，CD87、彈性蛋白酶、IL-8及溶菌酶測定

第26頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五四、免疫性不育的檢測

檢測方法很多，3種類別的抗精子抗體均可測，檢測的抗精子抗體為總的或各種類別的抗精子膜抗原的抗體，而精子膜與人體其他器官組織的細胞膜有許多共同抗原，因而這種抗原抗體反應(yīng)的特異性不高。如果用針對精子或睪丸特異性抗原，或針對與透明帶識別和結(jié)合有關(guān)的抗原作為包被抗原來檢測AsAb，其臨床意義就會很大。

Naz等用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)確定，受精抗原FA-1和YLP（12）具有此特性，并且它們的抗體存在于不育男性的精漿和血清中建立這種特異性診斷方法是今后取代總AsAb檢測的唯一途徑。第27頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五五、生殖道感染的檢測

大腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、綠膿桿菌、淋球菌、肺炎克雷伯氏菌、結(jié)核桿菌、衣原體、支原體、單純皰疹病毒、人乳頭瘤病毒、腺相關(guān)病毒、陰道毛滴蟲等皆可感染生殖道，而且可致不育。各種細菌感染，往往通過菌體本身及其釋放出的毒素、酶類等影響精子質(zhì)量病毒的感染更為隱蔽臨床實驗室多用ELISA法檢測各種病毒的抗體，通過抗體的分型可粗略判斷病毒的感染時期第28頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五衣原體和支原體感染被認為是最常見的性傳播疾病（STD）病原與男性不育密切相關(guān)的衣原體為沙眼衣原體（CT），其可引起急性附睪炎和慢性前列腺炎等。目前，檢測沙眼衣原體感染的方法主要有金標(biāo)法、ELISA法及培養(yǎng)法，尤以ELISA法最為常用與男性不育密切相關(guān)的支原體為解脲支原體臨床實驗室多采用培養(yǎng)法檢測。第29頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五六、精漿生化的檢測

精漿中的一些生化標(biāo)志可反映男性附屬性腺、附睪及睪丸生精功能等，有利于綜合評價不育的發(fā)病原因和機制。例如，檸檬酸、鋅、鎂、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶和酸性磷酸酶可反映前列腺功能，其中的酸性磷酸酶檢測已成為男科實驗室的常規(guī)檢查，常用磷酸苯二鈉法；

果糖與前列腺素可反映精囊腺功能，常用間苯二酚法檢測果糖；

游離左旋肉毒堿、甘油磷酸膽堿和α-葡糖苷酶可反映附睪功能。第30頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五精漿總α-葡糖苷酶檢測中應(yīng)注意3點離心速度不同，精漿總α-葡糖苷酶活性有所差異精漿總α-葡糖苷酶活性與禁欲時間的長短密切相關(guān)精漿總α-葡糖苷酶活性的檢測應(yīng)進行質(zhì)量控制

第31頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五不同速度離心后的精漿中α葡糖苷酶水平第32頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五禁欲時間對精漿α葡糖苷酶的影響Abstinencetime(day)nAlpha-glucosidase(U/ml)Seminalplasma(1000gfor10min)Seminalplasma(3000gfor15min)2~31236.47±12.2434.04±11.224~51649.62±16.86*47.73±17.37*6~71451.14±19.76*46.76±17.70*>8968.70±14.10*#△63.86±13.63*#△第33頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五精漿果糖檢測中應(yīng)注意4點：①果糖標(biāo)準液配制后應(yīng)放置2周后使用，而使用2周后出現(xiàn)吸光度降低時應(yīng)立即更換新的果糖標(biāo)準液②離心速度不同精漿果糖濃度稍有差異③精液液化后應(yīng)立即離心將精子和精漿分離，否則會影響精漿果糖檢測結(jié)果④精漿果糖測定中應(yīng)引入質(zhì)量控制體系第34頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五果糖標(biāo)準液吸光度的監(jiān)測第35頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五精液放置時間對果糖濃度的影響GroupnFructose(mmol/L)0h4815.73±6.562h4815.07±6.56a4h4814.73±6.51b,c第36頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五精漿稀釋后放置時間對酸性磷酸酶活性的影響

隨機選取10例精漿，1∶10000稀釋后立即檢測ACP活性或稀釋后放置30min再次檢測ACP活性，兩者比較有極顯著性差異（t

＝3.770，P

＝0.001）。第37頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五

抑制素B被認為是男性精子發(fā)生的血清標(biāo)志物。成年男性血清中維持可檢測的抑制素B水平需要生精細胞的存在，唯支持細胞綜合征（SCO）男性血清抑制素B水平極低。

Brugo-Olmedo等認為血清抑制素B在預(yù)言非阻塞性無精子癥病人的睪丸精子存在時比血清FSH更準確。除此之外，抑制素B還可用于兒童隱睪、性早熟的診斷，監(jiān)測放、化療對男性生精功能的損傷等。目前，抑制素B的檢測通常使用雙抗體夾心ELISA法。第38頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五七、精漿細胞因子的檢測

精漿細胞因子由男性泌尿生殖道內(nèi)的各種細胞分泌，包括轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）、表皮生長因子（EGF）、腫瘤壞死因子（TNF）、各種白細胞介素（IL）及某些可溶性受體等。目前認為，與男性不育有關(guān)的細胞因子主要有IL-6和IL-8，不育病人精漿中IL-6和IL-8水平明顯高于生育力正常的男性。測定IL-6和IL-8的方法有：生物學(xué)方法、分子生物學(xué)方法和免疫學(xué)方法，以免疫學(xué)方法多用，尤以ELISA和RIA常用。

第39頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五

八、精子發(fā)生相關(guān)基因的檢測

與精子發(fā)生相關(guān)的基因很多，無精子病人的基因缺失均發(fā)生于Y染色體的長臂,主要位于Yq11.23中，而且并非是單一基因，可能含有整個基因大家族。

1996年，Vogt等人在更大范圍對無精子、少精子病人進行了研究，認為在3個區(qū)域均存在AZF，分別為AZFa，AZFb，AZFc，對這些病人睪丸活檢發(fā)現(xiàn)，睪丸的病理改變與AZF的缺失部位有顯著相關(guān)性。

AZFa：Sy84,Sy86AZFb：Sy124，Sy127，Sy132,Sy134AZFc：Sy152，Sy157，Sy239，Sy242，Sy254，Sy255

第40頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五AZF檢測：SRY存在于基因組中，Yq上的AZFa,b,c區(qū)域的位點全部丟失↓

病人正常男性正常女性空白對照第41頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五九、遺傳學(xué)檢測

男性不育的遺傳學(xué)檢測主要是檢測精子染色體的異常。常規(guī)使用染色體顯帶技術(shù)，如G帶、Q帶等技術(shù)，然而其敏感度不及FISH技術(shù)

FISH技術(shù)可用于研究復(fù)雜染色體突變?nèi)缧匀旧w異常、未知的小標(biāo)志物、環(huán)狀染色體、嵌合體及易位等

Y染色體長臂特異區(qū)的微缺失與不育相關(guān)第42頁，共52頁，2022年，5月20日，12點18分，星期五病例：46，XX/46,XY異源嵌合體導(dǎo)致真兩性畸形腹腔鏡檢查發(fā)現(xiàn)：子宮正常大小，發(fā)育良好左右性腺均約4×