動物、礦物藥分析課件

動物藥分析概述動物藥是中藥的重要組成部分。我國應(yīng)用動物藥歷史悠久。在4000年前甲骨文就記載有40余種藥用動物，如麝、犀牛、蛇等。最早的本草《神農(nóng)本草經(jīng)》也收有僵蠶、犀角、地龍等67種動物藥。《中國藥用動物志》收載1500種。全世界已用的動物藥超過了2000種。目前我國供藥用的動物千余種。

80年代進(jìn)行的全國藥物資源調(diào)查表明：我國現(xiàn)有中藥資源12,809種。

其中藥用植物11,146種，占87.03%；藥用動物1,581種，占12.34%；藥用礦物80種，占0.63%。動物藥中其中有不少為療效顯著的名貴中藥，如牛黃、熊膽、麝香、羚羊角、海馬、海龍、蛤蚧、阿膠、鹿茸等，常用動物藥還有全蝎、蜈蚣、僵蠶、斑蝥、蟾酥、蛤蟆油、龜板、鱉甲、穿山甲、蘄蛇、烏骨雞等。1.動物活性成分的特點(diǎn)（1）療效確實(shí)熊膽中的熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸具有溶解膽石作用。蟾毒配基就具有升壓、強(qiáng)心、興奮呼吸等作用。從人尿中提取的尿激酶（現(xiàn)已能從組織培養(yǎng)人類腎細(xì)胞獲得），可直接激活纖溶酶原使其變?yōu)槔w溶酶。后者具有很強(qiáng)的溶解纖維蛋白的作用。臨床上用于腦血栓形成、腦栓塞及心肌梗塞等。水蛭素是最強(qiáng)的凝血酶抑制劑等。箭毒蛙堿是最強(qiáng)的心臟毒之一。能使各種起電膜有選擇性地增加對鈉離子的通透性。沙?？舅厥且阎顝?qiáng)的冠脈收縮劑，作用與強(qiáng)心苷相似，但活性強(qiáng)100倍以上，具有抗癌、抗白血病的作用，其毒性比氰化鈉高1250倍。（3）應(yīng)用面廣動物活性成分在醫(yī)藥方面具有獨(dú)特的療效外，近年來還發(fā)現(xiàn)他們是研究分子級產(chǎn)品的有力工具，也是有希望的檢驗(yàn)試劑。有的活性成分如昆蟲信息素還可無害地用于誘殺害蟲，這對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義。（4）潛力大

動物藥源豐富。現(xiàn)存動物已命名的有150萬種，而植物僅50萬種，但對動物藥的研究較植物藥則相形見絀。海洋藥物資源也很可觀。地球上的生物80%在海洋。海洋生物與陸地環(huán)境不同，它又具有獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)，活性成分的篩選命中率更高。如美國國家腫瘤研究所年篩選的3萬個抗腫瘤樣品中1500個來自海洋。其中具抗癌活性的占1%。其中發(fā)現(xiàn)某些軟體動物、棘皮動物和海綿動物命中率高。2.動物藥的化學(xué)成分分類（1）蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物（2）生物堿類（3）甾類化合物（4）酮類、酸類成分第二節(jié)常用動物類中藥分析

一、含膽汁酸類中藥（牛黃、熊膽、豬膽粉）分析

（一）膽汁酸的結(jié)構(gòu)特征及其在動物界的分布天然膽汁酸是膽烷酸的衍生物，在動物膽汁中它們通常與甘氨酸或?；撬嵋噪逆I結(jié)合成甘氨膽汁酸或牛磺膽汁酸并以鈉鹽形式存在。膽汁酸的異構(gòu)現(xiàn)象主要是由分子中碳環(huán)和環(huán)上取代基在空間排列不同而引起的，A／B環(huán)有順反兩種稠合方式，B／C環(huán)以反式稠合，C／D環(huán)也幾乎都是以反式稠合（強(qiáng)心苷和蟾毒配基例外）。膽烷酸膽酸糞甾烷酸在高等動物膽汁中，通常發(fā)現(xiàn)的膽汁酸是含有24個碳原子的膽烷酸的衍生物，常見的有膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸、α-豬去氧膽酸及石膽酸等。而在魚類、兩棲類和爬行類動物中發(fā)現(xiàn)的膽汁酸則含有27個碳原子或28個碳原子，這類膽汁酸是糞甾烷酸的羥基衍生物，而且通常是和?；撬嵯嘟Y(jié)合存在于動物膽汁中。主要膽汁酸見表16-1。（二）膽汁酸化學(xué)性質(zhì)及鑒定方法

1．膽汁酸的化學(xué)性質(zhì)一般是指膽汁酸中各功能基的反應(yīng)，主要有以下幾方面。（1）末端羧基反應(yīng)成鹽：游離的膽汁酸類在水中溶解度很小，形成鹽后則易溶于水，如膽酸在20℃水中的溶解度為0.028％，而其鈉鹽為56％。還原反應(yīng)：膽汁酸在乙醚中和氫化鋰鋁作用，或者在乙醇中與金屬鈉作用。羧基被還原，C24酸被還原成相應(yīng)的C24醇。（2）環(huán)上羥基的乙?；磻?yīng)甾環(huán)上的羥基可按常法乙酰化，乙?；锶菀捉Y(jié)晶，有一定的熔點(diǎn)，有利于膽汁酸的純化和精制。（3）甾環(huán)上酮基的還原反應(yīng)除膽酸易于得到外，其它膽汁酸由于資源限度，大量制備用于臨床有困難，目前一般是采用膽酸作原料來加工制備，如除去C7位上的羥基，則變?yōu)槿パ跄懰幔怀12位羧基，則變?yōu)轾Z去氧膽酸；除去C7，C12位上的羥基，則變?yōu)槭懰?。?）化學(xué)法Penkofer反應(yīng)：原理是蔗糖經(jīng)濃硫酸作用生成羥甲基糖醛，后者可與膽汁酸結(jié)合成紫色物質(zhì)。GregoryPascoe反應(yīng)：加45％硫酸、0.3％糠醛；膽汁存在的溶液顯藍(lán)色。此方法也可用于膽酸的定量分析2．膽汁酸的鑒別方法

硅膠薄層色譜廣泛用于動物膽汁中膽汁酸分離和鑒定。①分離游離膽汁酸的展開劑②分離結(jié)合膽汁酸的展開劑③顯色劑：30％硫酸試劑、10％磷鉬酸乙醇試劑、苯甲酸試劑、茴香醛試劑、三氯化鐵試劑、三氯化銻試劑、重鉻酸鉀飽和的80％硫酸試劑等。（2）薄層色譜法18（三）牛黃、熊膽、豬膽粉的來源及主要化學(xué)成分

1．牛黃牛黃為?？苿游锱ostaurusdomesticusGmelin的膽囊結(jié)石、少數(shù)為膽管、肝管結(jié)石。具清心、開竅、鎮(zhèn)驚、豁痰、息風(fēng)、解毒的功效。京牛黃：北京、天津、內(nèi)蒙古東牛黃：東北西牛黃：西北、河南印度牛黃：印度金山牛黃：加拿大、阿根廷、烏拉圭澳洲牛黃：澳大利亞

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許多著名的中成藥，如安宮牛黃丸、牛黃解毒丸、牛黃消炎丸、牛黃清心丸、珠黃散、再造丸等中均含有牛黃。牛黃中含有較多的膽汁酸，其中主要為膽酸（5%~11%）、去氧膽酸（約2％）、鵝去氧膽酸（0.6%~1.7%）及其鹽類，并含7%的SMC（Smoothmusclecontractor，水溶性肽類化合物，具收縮平滑肌及降低血壓作用）、膽紅素（bilirubin）及其鈣鹽、膽甾醇、多種氨基酸及多種無機(jī)元素。20212223

天然牛黃應(yīng)用范圍廣，藥源短缺，價格昂貴，故偽品甚多，多用動、植物組織偽造。如用黃連、黃柏、石松子、海金砂、大黃、姜黃等粉末為主要原料，加蛋清、蛋黃、牛膽汁等制造。由于牛膽結(jié)石發(fā)病率低，約為0.2%，所以天然牛黃藥源緊張，尋找代用品成為必然趨勢。有關(guān)人工牛黃我國衛(wèi)生部頒布人工牛黃標(biāo)準(zhǔn)：膽酸含量限度應(yīng)為標(biāo)示量的90%~110%，總膽酸的含量應(yīng)不得少于25%；膽紅素含量應(yīng)為標(biāo)示量的90%以上。人工牛黃應(yīng)為黃色疏松的粉末，味苦，微甘。24天然牛黃、人工牛黃成分對比1）天然牛黃：2）人工牛黃：膽紅素膽紅素去氧膽酸豬去氧膽酸膽酸膽酸去氧膽酸膽固醇結(jié)合型膽甾酸鹽磷酸三鈣牛黃酸硫酸鎂膽固醇

硫酸亞鐵粘蛋白淀粉氨基酸肽類、脂肪酸卵磷脂鈣鹽、無機(jī)鹽252．熊膽熊膽為熊科動物黑熊SelenarctosthibetanusCuvier或棕熊UrsusarctosL.的干燥膽。有清熱、解痙、平肝、明目的功效。熊膽的化學(xué)成分主要為膽汁酸，其中熊去氧膽酸（ursodeoxycholicacid）占大部分，并含有鵝去氧膽酸（chenodeoxycholicacid）、膽酸及去氧膽酸等。這些膽酸通常與?；撬?、甘氨酸結(jié)合，并形成鈉或鈣鹽而存在。熊膽的解痙作用的主要有效成分就是熊去氧膽酸，它也是熊膽特有的成分.26272829303．豬膽粉豬膽粉為豬科動物豬SusscrofadommesticaBrisson.膽汁的干燥品。有清熱、潤燥、解毒、止咳平喘的功效。豬膽中亦含有多種膽汁酸類成分，主要成分為豬去氧膽酸，亦含有鵝去氧膽酸、膽酸等成分。32（四）牛黃的定性分析

1、化學(xué)法（1）取牛黃粉末少量，加氯仿1ml，搖勻，再加硫酸與30％過氧化氫溶液各2滴，振搖，即顯綠色。（2）取牛黃粉末約0.2g，加鹽酸1ml，再加乙醚20ml振搖提取，放置，分取乙醚液，濾過后置分液漏斗中，加氫氧化鋇飽和溶液20ml，振搖，即發(fā)生黃色沉淀。分離除去水層及沉淀，醚層用氫氧化鋇飽和溶液洗滌。分取醚層，濾過，蒸干，殘渣加氯仿1m1溶解，加醋酐1m1與硫酸2滴，振搖，放置10min，即顯綠色。（3）取牛黃粉末0.1g，加60％醋酸4m1，研磨，濾過，取濾液1m1，加新制的糠醛溶液（1→100）1m1與硫酸（取硫酸50m1，加水65m1，混合）10ml，置70℃水浴中加熱10min，即顯藍(lán)紫色。342．薄層色譜法

取本品粉末10mg，加氯仿20ml，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1ml使溶解，作為供試品液。另取膽酸、去氧膽酸對照品，加乙醇制成每1ml各含2mg的混合溶液，作為對照品液。吸取上述溶液各2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以異辛烷-乙酸乙酯-冰醋酸（15：7：5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365nm）下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的兩個熒光斑點(diǎn)。35游離膽汁酸的鑒別36結(jié)合膽汁酸的鑒別3738人工牛黃的定性鑒別：（1）取人工牛黃粉末適量，分為2份，1份加硫酸呈污綠色，另1份加硝酸顯紅色。（2）人工牛黃在可見光下λCHCl3max453nm處有最大吸收。（3）人工牛黃與天然牛黃的IR吸收光譜有明顯差異。（4）膽紅素化學(xué)反應(yīng)：

VandenBergh反應(yīng)（重氮化反應(yīng)）：膽紅素與重氮化試劑中的對氨基苯磺酸合成偶氮染料。此偶氮染料在強(qiáng)酸中呈藍(lán)紫色；pH2.0~5.0呈紅色；5.0以上則呈綠色（500~560nm）。39（五）牛黃的定量分析

1．薄層掃描法測定膽酸含量2．薄層掃描法測定六應(yīng)丸中牛黃的有效成分3．薄層掃描法測定牛黃中膽汁酸的含量4．氣相色譜法測定牛黃中膽汁酸的含量5．導(dǎo)數(shù)光譜法測定人工牛黃中膽酸的含量406．膽紅素的含量測定

對照品溶液的制備：取膽紅素對照品約10mg，精密稱定，置100ml棕色量瓶中，加氯仿溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml,置50ml棕色量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，即得（每1ml中含膽紅素0.01mg）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取對照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，置具塞試管中，分別加乙醇至9ml，各精密加重氮化溶液（甲液：取對氨基苯磺酸0.1g，加鹽酸1.5ml與水適量使成100ml；乙液：取亞硝酸鈉0.5g，加水使溶解成100ml，置冰箱內(nèi)保存。用時取甲液10ml與乙液0.3ml，混勻）1ml，搖勻，于15~20℃暗處放置1h，以相應(yīng)的試劑為空白，照分光光度法，在533nm的波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。41

測定法：取牛黃細(xì)粉約10mg，精密稱定，置錐形瓶中，加氯仿和乙醇（7：3）的混合溶液60ml、鹽酸1滴，搖勻，置水浴上加熱回流約30min，放冷，移至100ml棕色量瓶中。容器用少量混合溶液洗滌，并入量瓶中，加上述混合溶液至刻度，搖勻。精密量取上清液10ml，置50ml棕色量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻。精密量取3ml，置具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項下的方法，自“加乙醇至9ml”起，依法測定吸收度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中膽紅素的重量（mg），計算，即得。本品含膽紅素（C33H36N4O6）不得少于35.0％。42（六）熊膽的定性分析

1．化學(xué)法取膽仁粉末在紫外光燈下應(yīng)顯黃白色熒光，而不應(yīng)顯棕黃色熒光；另取粉末約0.2g溶于7％冰醋酸溶液20ml中，溶液不應(yīng)顯淺藍(lán)色乳濁熒光（與牛、羊膽區(qū)別）。2．薄層色譜法（1）取膽仁約100mg，加甲醇10m1，溫?zé)崾谷?，放冷濾過，濾液濃縮近干，加20％氫氧化鈉溶液5ml。水浴水解5h，放冷，加鹽酸至pH2~3，以乙酸乙酯萃取，濃縮至約5ml供試；另取膽酸、熊去氧膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸及去氧膽酸為對照品；分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，用異辛烷-乙醚-冰醋酸-正丁醇-水（10：5：5：3：1，上層），取出晾干，噴以30％濃硫酸，105℃干燥10min，供試品應(yīng)有與熊去氧膽酸相同的斑點(diǎn)。43（2）萬應(yīng)錠中熊膽的薄層鑒別供試品溶液制備：取本品6g，研碎，加甲醇20ml，置水浴上溫浸1h，濾過，取濾液10ml，蒸干，殘渣加20%氫氧化鈉溶液5ml，置水浴中加熱水解8h，放冷，加水10ml，用醋酸乙酯提取兩次(去雜)，每次20ml，水液加鹽酸調(diào)節(jié)pH2-3，用乙醚提取2次，每次30ml，合并乙醚液，揮干，殘渣加甲醇溶解，使成1ml，作為供試品溶液。對照品溶液制備：取熊去氧膽酸，鵝去氧膽酸，膽酸，去氧膽酸，豬去氧膽酸對照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的溶液。展開劑：異辛烷-醋酸乙酯-冰醋酸（15：7：5）顯色劑：噴硫酸乙醇，加熱，紫外燈下檢視4445（七）熊膽的定量分析

1．紫外分光光度法2．氣相色譜法3．高效液相色譜法464．薄層掃描法

薄層板為硅膠G，展開劑是異辛烷-正丁醚-冰醋酸（8：5：5），用30％硫酸乙醇液顯色，120℃烘烤10min；反射法鋸齒形掃描，λS380nm，λR800nm。對照品的回歸方程為：熊去氧膽酸（UDCA）Y=1797X+98，r=0.9995；鵝去氧膽酸（CDCA）Y=1920X+8，r=0.9989。取引流熊膽和正品熊膽研細(xì)，干燥，取適量（約70mg）置10m1量瓶中，加適量甲醇，超聲提取10min，定容后過濾，取溶液5ml揮干，于殘渣中加10％氫氧化鈉50m1，120℃水解5h；選用鹽酸調(diào)顯酸性（pH2以下），用乙酸乙酯抽提，合并提取液，蒸干，殘渣加乙醇定容至10m1，點(diǎn)樣分析，計算樣品中UDCA、CDCA含量，正品熊膽中UDCA含量為24.91%~41.10％，CDCAl7.65％~24.68％。47（八）豬膽粉的檢查與定性、定量分析

2．檢查牛、羊膽：取牛、羊膽對照藥材各0.1g，按供試品溶液制備方法，同法制成對照藥材溶液。吸取供試品溶液及上述對照藥材溶液各2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開，顯色。供試品色譜中，不得顯與牛、羊膽對照藥材相同的斑點(diǎn)。還原糖：取本品10mg，加水2ml使溶解，滴加α-萘酚乙醇溶液(1→50)數(shù)滴，搖勻，沿管壁緩緩加入硫酸約0.5ml，兩液接界面不得顯紫紅色環(huán)。異性有機(jī)物：取本品10mg，加水2ml使溶解，離心或?yàn)V過，取不溶物，置顯微鏡下觀察，不得有植物組織、動物組織或淀粉等。水分：取本品約0.3g，精密稱定，照水分測定法測定，不得過10.0％。48二．麝香的質(zhì)量分析

麝香（moschus）是鹿科動物林麝MoschusberezovskiiFlerov、馬麝M.sifanicusPrzewalski、原麝M.moschiferusLinnaeus的雄體香囊中的分泌物。具有抗炎、強(qiáng)心、雄性激素樣等作用。麝香的化學(xué)成分復(fù)雜，目前已知的有：（1）麝香酮（muscone）含量約0.9％~3％，是天然麝香的主要有效成分之一，也是麝香的香味成分，有特異強(qiáng)烈的香氣。對冠心病有如同硝酸甘油同樣的作用。49（2）麝香吡啶和羥基麝香吡啶A、B（3）甾族化合物含有11種雄甾烷（androstane）衍生物。如雄性酮（androsterone）、表雄酮（epiandrosterone）、膽甾醇等。麝香的雄性激素樣作用是與麝香所含的雄甾烷衍生物有密切關(guān)系，質(zhì)量較佳的麝香，甾體雄性激素含量在0.5％左右。（4）多肽

MP（muskpeptidefraction）是麝香中含有的一種分子量為1000的多肽，有很強(qiáng)的抗炎活性，至少是氫化可的松的40倍。另有一種分子量約為5000~6000的多肽，抗炎活性為氫化可的松的20倍（5）脂肪酸、膽甾醇酯人工麝香為人工制成品，其組分類同與天然麝香，已于1993年底批準(zhǔn)使用。50

國家林業(yè)局、國家工商行政管理總局部2005年3號公告，自2005年7月報日起，凡生產(chǎn)、銷售天然麝香、熊膽粉的中成藥全部實(shí)行中國野生動物經(jīng)營利用管理專用標(biāo)識。標(biāo)有天然麝香成分字樣將只限于以下幾種：北京同仁堂集團(tuán)公司的安宮牛黃丸上海雷允上藥業(yè)有限公司的六神丸江蘇蘇州雷允上藥業(yè)有限公司的六神丸福建廈門中藥有限公司的八寶丹福建漳州片仔癀藥業(yè)有限公司的片仔癀51525354（一）定性分析

1．薄層色譜取麝香2g，加入硅藻土5g，研磨均勻，置索氏提取器內(nèi)，用200m1無水乙醚提取8h，提取液回收乙醚，殘渣用少量氯仿溶解，點(diǎn)于硅膠GF254制備薄層上，以苯展開至15cm，取出并揮去溶劑；在紫外燈（254nm）下檢視。刮取Rf值在0.46~0.67的第三熒光區(qū)帶（麝香酮）及接近原點(diǎn)的熒光區(qū)帶（甾體雄性激素）。前者用無水乙醚提取后，再同上層析，噴磷酸香草醛溶液（1g香草醛溶于5m1濃磷酸及15m1乙醇），于105℃烤5min可檢出麝香酮。后者的乙醚提取液在硅膠GF254薄層上用苯-乙醚（1：1）展開，同上法顯色可檢出5α-雄甾烷-3，17-二酮、5β-雄甾烷-3，17-二酮、△4-雄甾烯-3，17-二酮。5556（二）定量分析

1．氣相色譜法（1）藥典方法色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：以苯基（50％）甲基硅酮（OV-17）為固定相，涂布濃度為2％；柱溫200℃±10℃。理論板數(shù)按麝香酮峰計算應(yīng)不低于1500。對照品溶液的制備：取麝香酮對照品適量，精密稱定，加無水乙醇制成每1ml含1.5mg的溶液，即得。供試品溶液的制備：取麝香約1g，精密稱定，置五氧化二磷干燥器中，減壓干燥至恒重。取所得干燥品0.2g，精密稱定，精密加無水乙醇2ml,密塞，振搖，放置1h，濾過，取濾液，即得。測定法：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各2μl，注入氣相色譜儀，計算，即得。本品含麝香酮（C16H30O）不得少于2.0％。57（2）50批麝香中麝香酮的含量

①標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備是精密稱取合成麝香酮約0.1g于50m1量瓶中，以苯溶解并稀釋至刻度。內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)溶液是稱取正十九烷約0.15g于25ml量瓶中，同樣用苯溶解，并稀釋至刻度。分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液1、2、3、4及5ml于10m1量瓶中，并分別加入內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)溶液2ml，以苯稀釋至刻度，進(jìn)樣分析。以麝香酮量／正十九烷量（Wi／Ws）與麝香酮峰面積／正十九烷峰面積作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用積分儀計算積分面積，求出內(nèi)標(biāo)的校正因子為1.07。58

②樣品測定：精密稱取研勻的麝香約0.2g，置三角瓶中，精密加入正十九烷的苯溶液10~20m1（內(nèi)含正十九烷約7mg）冷浸1h，過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液，0.5~1μl進(jìn)行氣相層析。色譜柱為4%OV-17／GasChromZ（80~100目），載氣為氫氣，流速為45m1／min；柱溫180℃；氫焰離子化檢測器。測定結(jié)果表明50批麝香中麝香酮的含量呈正態(tài)分布：概率（％）麝香酮含量范圍

50.01.98~3.0768.31.71~3.3495.00.93~4.1299.70.09~4.96

過去的文獻(xiàn)報道麝香酮的含量為0.5％~2％，通過研究，認(rèn)為文獻(xiàn)報道值偏低?？赡苁怯捎跍y定方法不夠準(zhǔn)確，或測定批次較少的緣故。592．比色法

麝香制劑中麝香酮的測定：原理：

A.利用二硝基苯肼將麝香酮轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的麝香酮苯腙

B.甲醇洗脫后加KOH，顯色，使黃色的麝香酮苯腙變成葡萄酒紅色，在480nm處有最大吸收。

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取人參再造丸45g，在乳缽中加適量的95％乙醇磨成粥狀，抽濾，濾液置于分液漏斗中，加170m1石油醚和10m1蒸餾水提取4次，合并醚液，蒸去溶劑，殘渣用苯2m1溶解，加入2，4-二硝基苯肼試液（2，4-二硝基苯肼1g與15m1無水乙醇、15m1乙酸乙酯及1ml濃鹽酸混勻，加熱溶解，放冷后使用）至4m1，搖勻后在60℃水浴中加熱30min，取出冷卻。點(diǎn)適當(dāng)量在硅膠G薄層（110℃活化2h）上，用甲苯-乙酸乙酯（98：2）展開10cm，將麝香酮苯腙色點(diǎn)用5m1甲醇洗脫，加25％醇制氫氧化鉀溶液（氫氧化鉀25g溶于10m1蒸餾水，加95％甲醇至100m1）2m1，20min后在480nm處測定吸收度，并計算含量。614．高效液相色譜法

（1）麝香酮及激素衍生化后進(jìn)行HPLC分析①衍生物制備：取2，4-二硝基苯肼1g，加無水乙醇15m1，乙酸乙酯15m1和濃鹽酸1m1，加熱至澄清。取麝香酮、△5-雄烯-3β-羥基-17酮及3α-羥基-5α-雄烷-17酮各100mg，分別加2，4-二硝基苯肼鹽酸液5m1，于60℃水浴上加熱30min，抽去溶劑，用乙醇重結(jié)晶，得麝香酮腙及激素的酮腙衍生物。（2）麝香甾體成分的高效液相法分析采用對硝基苯甲酰氯衍生法。正相硅膠柱YWG80，4.0×250mm。針對甾體化合物結(jié)構(gòu)不同，采用了3種不同流動相和不同的檢測波長。62三、蟾酥的質(zhì)量分析

蟾酥為蟾蜍科動物中華大蟾蜍Bufobufo

gargarizansCantor或黑眶蟾蜍B.melanostictusSchneider的耳下腺及皮膚腺的干燥分泌物，具解毒、止痛、開竅醒神之功效，是中成藥六神丸、痧藥丸、牛黃消炎丸等的組成藥物之一。

蟾酥的化學(xué)成分復(fù)雜，主要成分有強(qiáng)心甾體類、吲哚堿類、甾醇類以及腎上腺素、多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、有機(jī)酸等。63

1．強(qiáng)心甾體類

（1）六元內(nèi)酯環(huán)型的強(qiáng)心甾類：基本結(jié)構(gòu)為蟾酥二烯，具有24個碳原子，在C3位上有β-OH、C14位上有β-OH或14β、15β-環(huán)氧，A／B環(huán)為順式，屬糞甾烷型，B／C環(huán)和其它天然甾體化合物相同為反式，C／D環(huán)和強(qiáng)心甾烯相同為順式。蟾酥的強(qiáng)心甾類化合物有游離型和結(jié)合型之分，游離型稱蟾毒配基（bufogenin），已知有近20種，如華蟾毒配基（cinlbufogenin）、脂蟾毒配基（resibufogenin）、蟾毒靈（bufalin）等，大多為干燥加工過程中的分解產(chǎn)物。上述蟾毒配基在新鮮蟾酥漿中不是以苷的形式存在，而是在C3-羥基與辛二酰精氨酸等結(jié)合成酯。（2）五元強(qiáng)心甾烯蟾毒類：如沙門苷元-3-辛二酸精氨酸酯、沙門苷元-3-硫酸脂、沙門苷元-3-半辛二酸酯等。65

2．吲哚類生物堿

3．甾醇類

6667686970（一）定性分析

蟾酥甾體類成分的化學(xué)定性分析可分二類：（1）強(qiáng)心甾烯蟾毒類：普通的強(qiáng)心苷類試劑如Legal、Raymond、Kedde等試劑，可用于強(qiáng)心甾烯蟾毒類的鑒定。（2）蟾蜍甾二烯類：上述試劑對于蟾蜍甾二烯類沒有顯色反應(yīng)，通常用濃硫酸使蟾蜍甾二烯類顯色，也可用三氯化銻、磷鉬酸試劑。蟾酥中蟾毒配基在進(jìn)行硅膠TLC時可用的展開劑有環(huán)己烷-氯仿-丙酮（4：3：3）、環(huán)己烷-丙酮（7：3）、正己烷-乙酸乙酯（1：9）、乙醚-乙酸乙酯（6：4）等。鑒于蟾酥強(qiáng)心甾體類化合物多有紫外吸收，如強(qiáng)心甾烯的λmax為217土3nm，蟾蜍甾二烯的λmax約300nm，可用TLC和UV進(jìn)行定性和定量分析721．化學(xué)法

（1）取蟾酥粉末約0.1g，加甲醇5m1，浸泡1h，濾過，濾液中加對二甲氨基苯甲醛固體少量，滴加硫酸數(shù)滴，即顯藍(lán)紫色.（2）取蟾酥粉末0.1g，加氯仿5m1，浸泡1h，濾過，濾液蒸干，殘渣加醋酐少量使溶解，滴加硫酸，初顯藍(lán)紫色，漸變?yōu)樗{(lán)綠色。（3）取0.5g樣品置磁點(diǎn)滴板上，加3d濃硫酸脂蟾毒配基檸檬黃-綠–黃綠華蟾毒配基黃-桔黃-紫紅-藍(lán)蟾毒靈灰棕-棕-灰-灰綠732．薄層色譜法

（1）藥典法取蟾酥粉末0.2g，加乙醇10ml，加熱回流30min，濾過，濾液置10ml量瓶中，加乙醇至刻度，作為供試品溶液。另取蟾酥對照藥材0.2g，同法制成對照藥材溶液。再取脂蟾毒配基及華蟾酥毒基對照品，加乙醇分別制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述4種溶液各10μl，分別點(diǎn)于同一硅膠Ｇ薄層板上，以環(huán)己烷-氯仿-丙酮（4：3：3）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的一個綠色及一個紅色斑點(diǎn)。74薄層板高效硅膠60F254預(yù)制板；厚度：200μm75（2）麝香保心丸中蟾酥的TLC76（二）定量分析

1．高效液相色譜法（1）藥典法色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；0.5%磷酸二氫鉀溶液-乙腈（50：50）（用磷酸調(diào)節(jié)pH值為3.2）為流動相；檢測波長為296nm；柱溫40℃。理論板數(shù)按華蟾酥毒基峰、脂蟾毒配基峰計算應(yīng)分別不低于4000。對照品溶液的制備：精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24h的華蟾酥毒基、脂蟾毒配基對照品各10mg，分別置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；分別精密量取5ml，各置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得（每1ml中含華蟾酥毒基、脂蟾毒配基各50μg）。77

供試品溶液的制備：取蟾酥細(xì)粉約25mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇20ml，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。測定法：分別精密吸取上述兩種對照品溶液與供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，測定，即得。本品含華蟾酥毒基（C26H34O6）和脂蟾毒配基（C24H32O4）的總量不得少于6.0％。782．紫外分光光度法3．氣相色譜法4．薄層掃描法79四．斑蝥的質(zhì)量分析

斑蝥為芫青科昆蟲南方大斑蝥MylabrisphalerataPallas、黃黑小斑蝥M.cichoriiLinnaeus的干燥蟲體。具破血消癥、攻毒蝕瘡之功效。含斑蝥素（cantharidin）、羥基斑蝥素，另含揮發(fā)油、甲殼質(zhì)、甲酸等80818283（一）定性分析-薄層色譜法

取斑蝥粉末3g，加氯仿20ml，振搖，浸泡2h，濾過，濾液蒸干，殘渣用石油醚（30~60℃）洗3次，每次5ml，小心傾去上清液，殘渣加氯仿1ml使溶解，作為供試品溶液。另取斑蝥素對照品，加氯仿制成每1ml含5mg的溶液，作為對照品溶液。取上述溶液各5μl分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-丙酮（98：2）展開，晾干，噴以0.1%溴甲酚綠乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相對應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。84（二）定量分析1．氣相色譜法色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：以甲基硅橡膠（SE-30）為固定液，涂布濃度為3.5%；柱溫為175℃±10℃。理論塔板數(shù)按斑蝥素峰計算應(yīng)不低于2600。對照品溶液的制備：取斑蝥素對照品適量，精密稱定，加氯仿制成每1ml含1mg的溶液，即得（必要時可稀釋）。供試品溶液的制備：取本品粗品約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氯仿30ml，振搖15min，放置6h，濾過，濾液置50ml量瓶中，用氯仿洗滌殘渣與濾紙，洗滌液入同一量瓶中，加氯仿至刻度，搖勻，即得。測定法：分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各2μl，注入氣相色譜儀，計算，即得。本品含斑蝥素（C10H12O4）不得少于0.35%。86第三節(jié)海洋藥物分析

一．海洋動物藥主要化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展

（一）海洋天然產(chǎn)物主要化學(xué)類型1．多糖

2．大環(huán)內(nèi)酯類

3.萜類

4．非肽含氮類化合物5．甾醇

6.皂甙

87（二）海洋天然產(chǎn)物的主要生理活性

1．抗癌海洋天然產(chǎn)物

2．抗心腦血管疾病海洋活性物質(zhì)

3．海洋抗病毒活性物質(zhì)

4．海洋抗菌抗炎活性物質(zhì)

5．抗衰老海洋藥物

88二．海洋動物藥成分含量測定方法研究

1．分光光度法測定粗吻海龍中總甾體的含量2．毛細(xì)管氣相色譜法測定海龍、海馬類藥材中甾體類成分3．薄層色譜掃描法測定海康膠囊中海參多糖含量4．瓊脂糖凝膠電泳法測定扇貝糖胺聚糖含量5．反相高效液相色譜法-蒸發(fā)光散射檢測器檢測河豚毒素89礦物藥分析

90第一節(jié)概述

現(xiàn)在較常用的礦物藥約有50余種。礦物藥的品種雖比動、植物藥少，但其在醫(yī)療上的價值卻很重要。礦物藥中有毒性的藥材也較多，如《中國藥典》2005年版收載礦物藥22種，約占收載藥材的4％，但屬于毒性中藥的就有7種，約占1/4，而且一類劇毒中藥均為礦物藥。從目前常用的礦物藥中發(fā)現(xiàn)品種混亂現(xiàn)象也較嚴(yán)重，如自然銅、寒水石、陽起石、花蕊石、赭石等。有些礦物藥如芒硝、玄明粉、石膏等也存在一定的質(zhì)量問題。911988年國務(wù)院頒布《醫(yī)療用毒性藥品管理辦法》列出有毒中藥:砒石（紅砒、白砒）、砒霜、水銀、生馬錢子、生川烏、生草烏、生白附子、生半夏、生南星、生巴豆、斑蟊、紅娘子、生甘遂、生狼毒、生藤黃、生千金子、生天仙子、鬧羊花、雪山一枝蒿、蟾酥、洋金花、紅粉、輕粉、雄黃、紅升丹、白降丹92一．礦物藥的特點(diǎn)

礦物藥包括可供藥用的天然礦物、巖石、古化石、礦物加工品及化學(xué)制品等。其中多數(shù)為礦物和巖石。礦物是自然界由于地質(zhì)作用所形成的天然單質(zhì)或化合物，他們具有:（1）相對固定的化學(xué)組成，大多數(shù)為無機(jī)化合物;（2）以固態(tài)為主，具有確定的晶體結(jié)構(gòu);（3）巖石是同種固態(tài)礦物組成的集合體。在一定的物理、化學(xué)條件下相對穩(wěn)定，當(dāng)外界條件變化到一定程度時，它也隨之改變。組成在新的條件下穩(wěn)定的化合物。93二．礦物藥的分類礦物藥一般按礦物藥中的主要某類化合物作為分類依據(jù)，如氧化物類：磁石、赭石、鉛丹硫化物類：雄黃、朱砂硫酸鹽類：石膏、白礬、芒硝另外，還可以按陽離子分類，如鈣化物：石膏汞化物類：朱砂、輕粉、紅粉砷化物類：信石、雄黃9495三．礦物藥的鑒別方法

礦物藥的常用分析鑒定方法有性狀鑒定、顯微鑒定、理化分析三大類。目前常用的法定檢驗(yàn)法中，定性多用離子反應(yīng)、火焰反應(yīng)和沉淀反應(yīng)；含量測定多用容量法和重量法。由于儀器分析的發(fā)展，紅外分光光度法、熱分析法、放射活化法、原子吸收分光光度法、激發(fā)光譜法、電化學(xué)分析等亦已應(yīng)用于礦物藥的分析。顯微鑒定是鑒定礦物藥光學(xué)性質(zhì)的重要方法。中成藥中礦物藥成分的定量分析進(jìn)展較快，特別是含汞、砷化合物的中成藥96第二節(jié)礦物藥的

常用理化分析方法

礦物藥分析的一般程序是：取樣-試樣分解-定性分析-定量分析。其中試樣的分解是將待測組分轉(zhuǎn)入溶液中的重要步驟。一般要求：①試樣分解必須完全；②試樣分解過程中待測組分不應(yīng)有損失；③試樣分解過程中不應(yīng)引入被測組分或干擾組分。97常用的分解方法有：溶解法（濕法）和熔融法（干法）兩種。（1）溶解法：最簡便的分解方法，就是將試樣溶解在水、酸或其他溶劑中的分解方法，通常采用水、稀酸、濃酸、混合酸的順序進(jìn)行處理。當(dāng)溶解法不能將試樣完全溶解時，可采用熔融法。（2）熔融法：將試樣與固體熔劑混合，然后在高溫下加熱至全熔或半熔，使欲測組分轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇芘c水或酸中的化合物。熔劑可分為堿性熔劑（如碳酸鈉、氫氧化鈉）、酸性熔劑（如硫酸氫鉀、焦硫酸鉀）、氧化性熔劑（如過氧化鈉、碳酸鈉加硝酸鉀）和還原性熔劑（碳酸鈉加硫）等?？筛鶕?jù)不同礦物藥的性質(zhì)加以選用。98一．容量法

在礦物藥法定的分析方法中以容量法最為常見。主要是利用容量法中配位滴定、酸堿滴定、氧化還原滴定等。（一）配位滴定法的應(yīng)用1．應(yīng)用原理及注意事項（1）應(yīng)用原理以形成配位化合物反應(yīng)為基礎(chǔ)的滴定法稱為配位滴定法（或稱配合物滴定法）。

99

而現(xiàn)在應(yīng)用最廣的是有機(jī)氨酸配位劑中的乙二胺四乙酸（EDTA），在此重點(diǎn)介紹EDTA法。

EDTA與金屬離子形成的配合物的配位比較簡單，一般情況下為1：1，EDTA分子中含有2個氨基與4個羧基，共6個配位原子，大多數(shù)金屬離子的配位數(shù)都不超過6，所以無論二價、三價、四價均按1：1配位，僅有少數(shù)高價金屬離子與EDTA形成2：1配合物，如Mo5+、Zr4+。配位滴定法多用于測定含鈣、鋁等的礦物藥，有用標(biāo)準(zhǔn)溶液乙二胺四醋酸二鈉液直接滴定，如石膏、鐘乳石、紫石英。也有加過量乙二胺四醋酸二鈉溶液，用鋅液回滴，如白礬。100（2）pH值的控制在EDTA滴定中，pH值非常重要，各種金屬離子有不同的最低pH值要求，低于此pH值的配合物即不穩(wěn)定。在一定pH值范圍內(nèi)各種離子間相互干擾，但我們可以利用控制pH值的方法在同一溶劑中連續(xù)滴定幾種離子

EDTA滴定常用的指示劑，在pH小于7時可用二甲基橙，pH大于7時可用鉻黑T、鉻黑藍(lán)R或紫脲酸胺。101（3）掩蔽劑的使用消除各離子間的干擾，除上述控制pH的方法外，還常用掩蔽劑。掩蔽劑的使用可分為以下兩種形式：①利用配位反應(yīng)降低干擾離子的濃度來消除干擾的方法稱為配位掩蔽法。②利用產(chǎn)生沉淀掩蔽的方法稱為沉淀掩蔽法。102（二）配位滴定法的應(yīng)用實(shí)例

1．石膏中鈣離子的測定石膏用稀鹽酸溶解后，以甲基紅為指示劑，加KOH試劑調(diào)節(jié)到淺黃色，再加5m1KOH試劑，用鈣黃綠為指示劑，用EDTA二鈉滴定鈣。

2．白礬中鋁離子的測定白礬用水溶解后，加pH4.8的醋酸—醋酸銨緩沖液，準(zhǔn)確加入過量的EDTA二鈉溶液，微沸10min（使之與鋁離子配合），冷卻后，加乙醇，用二苯二硫代偕肼腙為指示劑，用鋅標(biāo)準(zhǔn)液滴定過剩的EDTA。103（三）酸堿滴定法的應(yīng)用

一般的酸、堿及能與酸、堿發(fā)生中和反應(yīng)的物質(zhì)均可用酸堿滴定法測定。中和反應(yīng)通常不發(fā)生外觀變化，因此，需用指示劑的變化來顯示終點(diǎn)。不同的指示劑變化的pH值不同，不同程度的酸堿中和需采用不同的指示劑，亦可用電位法指示終點(diǎn)，電位法結(jié)果準(zhǔn)確，尤適用于有色物質(zhì)的測定。礦物藥中的碳酸鹽常采用酸堿滴定法。104（四）氧化還原滴定法的應(yīng)用

以氧化還原反應(yīng)為基礎(chǔ)的滴定反應(yīng)稱為氧化還原滴定法。在氧化還原反應(yīng)中發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，給出電子的物質(zhì)為還原劑，接受電子的物質(zhì)為氧化劑，反應(yīng)物質(zhì)的化學(xué)計量是以反應(yīng)過程中電子的數(shù)目來決定的，即：化學(xué)計量=分子量／電子得失數(shù)氧化還原法多用于含汞、砷、鐵等礦物藥。藥典采用的方法有碘量法（直接、間接）、高錳酸鉀法。105二．重量法

重量法是一種經(jīng)典分析方法，它是用分析天平稱取沉淀的重量，來確定所測組分中被檢離子的含量。要獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，減少誤差，對沉淀有如下要求：（1）被測組分要沉淀完全，而形成的沉淀其溶解度要很小，即沉淀劑要選擇恰當(dāng)，而且要過量，使產(chǎn)生同離子效應(yīng)，促使沉淀完全，一般以超過20％~50％為宜。過多時可能產(chǎn)生配合反應(yīng)，而使沉淀溶解度加大。106（2）沉淀要純凈，主要是避免“共沉淀”。其沉淀的來源是：①表面吸附，沉淀顆粒越小，表面吸附越多；②吸留，是由于沉淀速度過快，雜質(zhì)包入其中；③后沉淀，是指在放置過程中其它物質(zhì)沉淀。

為了提高沉淀的純度，應(yīng)使易吸附物質(zhì)的濃度降低，反復(fù)洗滌沉淀，使沉淀的粒子加大。107（3）要求沉淀的顆粒大，使之易于洗滌與過濾。加大顆粒的辦法有：①減少沉淀物質(zhì)的濃度，即在稀溶液中，慢慢加入沉淀劑，并不斷攪拌，防止局部濃度過大。②增加沉淀過程中沉淀的溶解度，在熱溶液中進(jìn)行沉淀。③陳化，可放一段時間。108三．紅外分光光度法

礦物的紅外吸收主要是由陰離子的晶格振動所引起，其吸收位置與受分子中陽離子的影響較小，一般陽離子質(zhì)量的增加，僅使吸收位置向低波數(shù)方向稍作位移。紅外分光光度法用于礦物藥分析時，一般是先將樣品粉碎，過200目篩，然后用石蠟糊或KBr壓片法測定。在解析圖譜時，應(yīng)注意吸水的干擾，另外由于雜質(zhì)的存在、樣品晶體在光路中方向的不同、多晶異構(gòu)水合類型的不同、離子交換現(xiàn)象，常使測得的光譜與標(biāo)淮圖譜不一致。紅外分光光度法通常用于定性分析，109四．熱分析法

1．熱重法（Thermogravimetry，TG）2．差熱分析（DifferentialThermolAnalysis，DTA）

3．差示掃描量熱法（DifferentialScanningCalorimetry，DSC）110五．其它理化分析方法

現(xiàn)代分析方法如原子吸收分光光度法、放射活化分析法、X射線衍射法、熒光光譜法、電化學(xué)分析法等在礦物藥的未知成分及微量元素分析方面已得到較廣泛的應(yīng)用。發(fā)射光譜半定量分析應(yīng)用最廣，用于微量元素分析（包括植物藥、動物藥均可）。111第三節(jié)常用礦物藥質(zhì)量分析

一.朱砂的質(zhì)量分析朱砂為硫化物類礦物辰砂族辰砂，主含硫化汞（HgS），具清心鎮(zhèn)驚,安神解毒之功效。不少著名的中成藥中都含有朱砂，如六神丸、牛黃清心丸、再造丸、冰硼散、一捻金、安宮牛黃丸等。1．定性分析（1）取朱砂粉末，用鹽酸濕潤后，在光潔的銅片上摩擦，銅片表面顯銀白色光澤，加熱烘烤后，銀白色即消失。（2）取朱砂粉末2g，加鹽酸-硝酸（3：1）的混合溶液2ml使溶解，蒸干，加水2ml使溶解，濾過，濾液顯汞鹽與硫酸鹽的鑒別反應(yīng)。1121132．定量分析

（1）容量法取朱砂粉末約0.3g，精密稱定，置錐形瓶中，加硫酸10ml與硝酸鉀1.5g，加熱使溶