DB37-T 4092-2020 魚類腸道微生物分離鑒定通用技術要求

ICS07.100B50

DB37山 東 省 地 方 標 準DB37/T4092—2020魚類腸道微生物分離鑒定通用技術要求20202020082020200920山東省市場監(jiān)督管理局發(fā)布前言本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由山東省海洋局提出并組織實施。本標準由山東省海洋標準化技術委員會歸口。本標準負責起草單位：青島華大基因研究院、青島市標準化研究院。本標準主要起草人：劉姍姍、喬雪松、王裕寬、王萌萌、楊恒加、王琛、陳建威、蘇小珊、翟越、許靜、趙丹。魚類腸道微生物分離鑒定通用技術要求范圍GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T30744深海微生物樣品前處理技術規(guī)范SN/T2632微生物菌種常規(guī)保藏技術規(guī)程下列術語和定義適用于本文件。下列術語和定義適用于本文件。3.1腸道微生物intestinalmicroorganism生長于動物腸道，并幫助宿主完成多種生理生化功能的微生物群落。3.216SrDNA16SrRNA16SrRNARNA3.3聚合酶鏈式反應polymerasechainreaction一種分子生物學技術，用于擴增特定的DNA/RNA片段，這種方法可在生物體外進行，不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。3.4Sanger測序SangersequencingDNADNA19774縮略語下列縮略語適用于本文件。PBS（PhosphateBufferSaline）PCR（PolymeraseChainReaction）OD：（OpticalDensity）實驗室應滿足GB19489中關于一級或以上級別生物安全實驗室的要求。24h2216E（A.3）50mL7575PBS10g1g3mLPBS2℃～8100μLPBS100010-1100μL10-1PBS1000μL10-210-3、10-4281～312h10～2002812h～24B150rpm286000.6～1.0之間。對培養(yǎng)得到的菌液進行基因組提取，參照GB/T30744內(nèi)相關內(nèi)容進行。16SrDNA對所提取菌株基因組的16SrDNA基因進行PCR擴增，擴增引物及反應條件詳見附錄C。PCRPCR對擴增所得PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，步驟參見附錄D。PCR對檢測合格的PCR產(chǎn)物進行Sanger測序，測序結果與EzBioCloud數(shù)據(jù)庫進行序列比對，確定分離微生物的種類并參考附錄E的信息記錄表進行記錄。8魚類腸道微生物的保藏菌種保藏參見SN/T2632規(guī)范內(nèi)容。參照附錄E的信息記錄表，對保藏信息進行記錄。附錄A（）表A.1給出PBS配方。表A.1PBSNaCl8gKCl0.2gNa2HPO41.44gKH2PO40.24g蒸餾水定容至1000mLpH值7.4表A.2給出2216E培養(yǎng)基配方。表A.22216E蛋白胨5g酵母膏1gFePO40.01g陳海水定容至1000mL瓊脂糖（固體培養(yǎng)基添加）15gpH值7.6注：適用海水魚腸道微生物培養(yǎng)表A.3給出LB培養(yǎng)基配方。表A.3給出LB培養(yǎng)基配方。表A.3LB培養(yǎng)基配方蛋白胨10g酵母膏5gNaCl10g蒸餾水定容至1000mL瓊脂糖（固體培養(yǎng)基添加）15gpH值7.6注：適用淡水魚腸道微生物培養(yǎng)附錄B（）表B.1給出菌落形態(tài)特征統(tǒng)計表。表B.1菌落形態(tài)特征統(tǒng)計表菌種編號顏色大小形狀質(zhì)地有無暈圈有無光澤是否濕潤是否凸起是否透明培養(yǎng)時間記錄人附錄C（規(guī)范性附錄）菌液PCR表C.1給出PCR反應引物序列。表C.1PCR引物名稱序列27FAGAGTTTGATCCTGGCTCAG1492RTACGGCTACCTTGTTACGACTT表C.2給出PCR反應體系。表C.2PCR（25μL）組分用量μL無菌水17.210×PCRBuffer2.5dNTP2.027F1.01492R1.0Taq酶0.3模板（菌液）1.0表C.3給出PCR反應時間。表C.3PCR反應時間溫度時間循環(huán)945min1個循環(huán)9430s30個循環(huán)551min721min7210min1個循環(huán)4∞1個循環(huán)附錄D（規(guī)范性附錄）電泳測試LoadingbufferPCR樣品，DL2000Safe配制1.5（30501004μL/100mLSYBRSafeLoadingbufferPCR2μL3μL3μLMarker120V～200進將凝膠電泳放入凝膠成像儀成像觀察。將凝膠電泳放入凝膠成像儀成像觀察。D.4產(chǎn)物驗證觀察電泳條帶是否單一、條帶是否明亮、產(chǎn)物大小是否為1500bp左右，若滿足上述要求，則表明PCR成功。對于沒有成功的樣品可再次進行PCR驗證，或?qū)⒈２氐木哼M行活化，培養(yǎng)后再次進行PCR。附錄E（規(guī)范性附錄）菌株信息記錄表表E.1給出菌株信息記錄表。表E.1菌株信息記錄表魚種信息魚種魚編號采集日期獲取方式采集地點樣品狀態(tài)保藏人備注菌株16SrDNA鑒定及保藏信息菌株編號Top-hittaxonTop-hitstrainSimilarity%保藏時間保藏方式保藏孔位注：魚種編號和菌株編號可根據(jù)自身需要進行編制，如：AK1（1號鮟鱇魚），2018-AK1-G-001（1號鮟鱇魚腸道第一株菌）。參考文獻M].1980.J2016,2016(1):1-8.RoeselersG,MittgeK,StephensWZ,etal.Evidenceforacoregutmicrobiotainthezebrafish[J].IsmeJournal,2011,5(10):1595.LiX,YuY,FengW,etal.Hostspeciesasastrongdeterminantoftheintestinalmicrobiotaoffishlarvae.[J].JournalofMicrobiology,2012,50(1):29-37.張涵,周濤,王巖.綜合養(yǎng)殖池塘中三角帆蚌和魚類腸道細菌的組成[J].水生生物學報,2013(5):824-835.(Scophthalmusmaximus)2014,14(20):3801-3805.王純,倪加加,顏慶云,等.草魚與團頭魴腸道菌群結構比較分析[J].水生生物學報,2014(5):868-875.SanchezLM,WengRW,RienerRM,etal.ExaminingtheFishMicrobiome:Vertebrate-DerivedBacteriaasanEnvironmentalNichefortheDiscoveryofUniqueMarineNaturalProducts[J].PlosOne,2012,7(5):e35398.from