DB37-T 4362-2021 流感病毒與犬瘟熱病毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測方法

ICS11.220CCSB41ICS11.220CCSB41山 東 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB37/T4362—2021RT-PCR測方法Duplexreal-timeRT-PCRdetectionmethodforinfluenzavirusandcanineDuplexreal-timeRT-PCRdetectionmethodforinfluenzavirusandcaninedistempervirus2021031120210411山東省市場監(jiān)督管理局發(fā)布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由山東省畜牧業(yè)專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。流感病毒與犬瘟熱病毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測方法范圍RT-PCR（GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動物檢疫本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。RT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RNA：核糖核酸PBS：磷酸鹽緩沖生理鹽水5試劑或材料GB/T6682使用無RNA酶的容器進(jìn)行分裝。TRIzol，2～80.1DEPC氯仿，445.675A.3，應(yīng)-20TEA.4——陽性對照：帶有流感病毒M基因和犬瘟熱病毒N基因的質(zhì)粒?！幮詫φ眨簽橐阎鞲胁《竞腿翢岵《娟幮缘膭游锝M織懸液。PCR（）13000r/min。6.3冰箱，2～8-205μL、10μL、100μL1000μL。1.5mL樣品121℃，15min——棉拭子；——剪刀、鑷子；1.5mL——研缽或組織研磨儀。有咽喉拭子樣品和肛門拭子樣品：3～51.0mLPBS1.5mL肛門拭子采樣，采樣時將拭子深入肛門轉(zhuǎn)一圈并沾取少量糞便；然后將拭子插入裝有1.0PBS1.5mL用無菌剪刀、鑷子采集不少于2.0g的肺臟等組織臟器，裝入一次性自封袋或其它滅菌容器，編號備用。h302.010mLB4300r/in離心15min1.5mL或者用專用儀器設(shè)備處理待檢組織樣品。2℃824h0凍急性感染且出現(xiàn)病毒血癥的動物可采集全血分離血清或血漿進(jìn)行檢測。熒光RT-PCRGB19489和GB/T274012504RNA樣品病毒核酸RNARNARNA1.5mL200TRIzol110min200μL10min413000r/min15min（10min413000r/min15min1.0mL7548000r/min、10min5min50μLTERNA，-20RNARNART-PCRPCR+1+2μL熒光RT-PCR反應(yīng)液。按B.2配制反應(yīng)液，為避免移液器取樣損失，建議按n+1個反應(yīng)PCR20μL，加樣在樣品處理區(qū)進(jìn)行。分別向上述PCR管中加入樣本核酸提取步驟8.2.7中制備的RNA溶液各5μL，蓋500r/min30RT-PCRPCRPCR/1594℃/3/15℃/10℃/30共40402min60PCRFAMCy5CtCt28。注：Ct陰性雙檢測通道均無Ct值，且無特征性擴(kuò)增曲線，表明樣品中無禽流感、犬瘟熱病毒核酸。陽性犬瘟熱病毒的核酸。9.3.2.2犬瘟熱病毒的核酸。9.3.2.2FAMCt30.0Cy5CtCy5Ct30.0FAMCt9.3.3可疑Ct30.0～38.0附錄A（0.5mol/LTris-HCl(pH8.0)稱取6.055gTris100mL80mL0.1%DEPCHClpH值至8.0100mL，0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液稱取18.61gNa2EDTA·2H2O置于100mL燒杯中，加入80mL0.1%DEPC水，用10NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH8.0100mL75量取75mL25mL0.1DEPCTE將0.5mL10mmolTris-HCl(pH8.0)、0.1mL的0.5mol/LEDTA(pH8.0pH8.0，加0.1%DEPC50mL，4附錄B（資料性）引物探針序列及熒光RT-PCR反應(yīng)液配方引物和探針序列表見表B.1。表B.1引物和探針序列表病毒名稱序列名稱序列流感病毒上游引物ACCAGTCAACAAACTCCACAG下游引物GATTTGTTGCACACAGCATTCC探針FAM-GATTTGTTGCACACAGCATTCC-BHQ犬瘟熱病毒上游引物GCAAGCGAGGATTGAGGGTAT下游引物GGCCTATGGGACACACTCAAA探針Cy5-CACCGACCATCCAGACGTTGCTCCT-BHQRT-PCR熒光RT-PCR反應(yīng)液配方見表B.2。表B.2熒光RT-PCR反應(yīng)液配方組分1個檢測體系的加入量5×RT緩沖液5.0μLM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(200U/μL)0.5μLdNTPs(10mmol/L)1.0μLMgCl2(25mmol/L)3.0μL流感病毒上游引物(10μmol/L)0.5μL流感病毒下游引物(10μmol/L)0.5μL流感病毒探針(10μmol/L)0.5μL犬瘟熱病毒上游引物(10μmol/L)0.5μL犬瘟熱病毒下游引物(10μmol/L)0.5μL犬瘟熱病毒探針(10μmol/L)0.5μLRNA酶抑制劑(40U/μL)0.25μLExTaqHS酶(40U/μL)0.25μLDEPC水7.0