REMI介導紅曲霉遺傳轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

一論文發(fā)衷專家一

中國學木期刊網(wǎng)REMI介導紅曲霉遺傳轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化摘要：為了構(gòu)建限制性內(nèi)切酶介導的整合（remi）技術(shù)介導的紅曲霉（monascusanka）遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，以潮霉素b作為抗性篩選標記，pbc—hygro、pcbl003、pan7—l作為轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，采用remi技術(shù)轉(zhuǎn)化紅曲霉。結(jié)果表明，用remi技術(shù)介導紅曲霉轉(zhuǎn)化時，質(zhì)粒pbc—hygro和pcbl003適合于紅曲霉的轉(zhuǎn)化。環(huán)狀質(zhì)粒與線性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率無顯著差別；在用remi技術(shù)介導轉(zhuǎn)化時添加酶切緩沖液不利于轉(zhuǎn)化；原生質(zhì)體濃度為1X107?1X108個/ml時，每微克質(zhì)?？色@得的潮霉素b抗性轉(zhuǎn)化子為2800?3200個；hindm介導轉(zhuǎn)化時的最佳酶用量為105?120u；在質(zhì)粒用量為8pg/100pl時轉(zhuǎn)化率最高。關鍵詞：紅曲霉（monascusanka）；遺傳轉(zhuǎn)化；限制性內(nèi)切酶介導的整合（remi）abstract：toestablishagenetictransformationsystemofmonascusankabyrestrietionenzyme—mediatedintegration（remi），usingthehphgeneasselectablemarkerandpbc—hygro，pcb1003andpan7—1asvector，thefungus

m.ddankawastransformedtobehyomyeinb－resistantbyremi.aitionofrestrietionenzymesm.ddtransformationmixturesresultedininereaseoftransformationratewhenusingpbe—toplastsattheeoneentrationof1X107?1X108mlwerefitfortransformingm.anka，transformationnumberwas2 800?3 200ind./pgveetordna.theoptimumhindiiiandveetordosewas105?120uand8pg/100pl，respeetively.

一論文發(fā)衷專家一中國學木囲刊網(wǎng)www.qik日nw^ng.門電Ikeywords：monascussp.；genetictransformation；restrietionenzyme-mediatedintegration(remi)限制性內(nèi)切酶介導的整合(restrietionenzyme-mediateddnaintegration，remi)技術(shù)是將dna轉(zhuǎn)化進入真核細胞，并產(chǎn)生非同源整合的一種方法°remi的非同源整合機理與非同源末端連接(nonhomologousend-joining,nhej)相關［1—4］,整合的過程［5］可簡單歸結(jié)為三步：首先在轉(zhuǎn)化過程中使線性化dna的酶隨線性化dna進入核內(nèi)；第二，限制性內(nèi)切酶在特定識別位點酶切宿主染色體dna；第三，染色體dna和轉(zhuǎn)化片段在體內(nèi)互補末端連接產(chǎn)生非同源整合事件。1991年schiestl等［6］首次將remi技術(shù)應用于極易同源整合的saccharomycescerevisiaeokuspa等［7］首先將remi技術(shù)應用于dictyosteliumdiscoidium克隆發(fā)育基因，構(gòu)建了remi—rflp(限制性片段長度多態(tài)性)圖譜［8,9］,并克隆了很多發(fā)育基因，使發(fā)育途徑的研究變得更加容易。應用該方法已分離到幾個植物致病真菌的毒力因子［5］。remi技術(shù)還成功應用于子囊菌cochliobolusheterostrophus[l0]和玉米致病真菌ustiIagomaydis[11]、aspergillusnidulans[12]的遺傳互補分析，以及啟動子捕獲等。研究探討了不同限制性內(nèi)切酶介導轉(zhuǎn)化紅曲霉的能力，以及酶切緩沖液和不同質(zhì)粒對轉(zhuǎn)化率的影響，同時優(yōu)化了酶的用量、受體細胞濃度等條件。材料與方法l材料菌株、質(zhì)粒與培養(yǎng)基菌株m7577是野生型紅曲霉monascusanka）,由貴州大學真菌資源研究所分離、保存。曲霉用于遺傳轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒pbc—hygro由法國silar教授惠贈，該質(zhì)粒攜帶潮霉素b抗性基因（hph）[13],是用限制性內(nèi)切酶hindm酶切線性化的。質(zhì)粒pan7—1[14]帶有來自a.nidulans的gpd基因的啟動子和trpc基因[15]的終止子。用hphi酶切質(zhì)粒pan52—1,用t4dna聚合酶補平末端，再用bamhi酶切得到1.1kbhph基因片段（hph基因缺失了不影響酶功能的前3個密碼子）[16],與a.nidulans帶有起始密碼子atg的gpd基因5’端融合；hph基因下游密碼子區(qū)域與a.nidulanstrpc基因末端區(qū)域的hphi—bamhi片段融合，克隆到質(zhì)粒pan52—1(克隆前先用ncoi酶切pan52—1,用t4dna聚合酶補平末端，再用bamhi酶切)上構(gòu)建得到pan7—l。質(zhì)粒pcb1003帶有來自pcsn43[17]的2.4kbsali片段(含有潮霉素b抗性基因hph和來自a.nidulans的trpc啟動子和終止子)，通過單個堿基的改良消除了hph基因中的4個限制性內(nèi)切酶位點：ecori(gagttc)、psti(ctggag)、sstii(ccgcgc)和bamhi(ggttcc),但hph基因編碼的氨基酸序列未變。通過per技術(shù)消除trpc終止子，獲得了1.4kb的片段，并在片段兩端引入ecori、sali和hpai位點，最后通過ecori位點亞克隆到puc19構(gòu)建得到pcb003。菌絲生長的cm培養(yǎng)基和產(chǎn)抱培養(yǎng)基按文獻［18］配制，原生質(zhì)體再生液體和固體培養(yǎng)基是分別于cm液體和瓊脂糖固體培養(yǎng)基中加入蔗糖，終濃度為0.6mol/l；復蘇液體培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中加蔗糖，終濃度為0.6mol/l。1.1.2藥品與試劑各種限制性內(nèi)切酶和pfudna聚合酶為fermentas公司產(chǎn)品，cellulase、lysingenzyme購于sigma公司，snailase購于華美生物工程公司，瓊脂糖購于biowest公司，質(zhì)粒中量制備試劑盒為德國qiagen公司產(chǎn)品，其余試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。電擊轉(zhuǎn)化緩沖液i含有1Ommol/1tris—hcl(ph7.5)、600mmol/l蔗糖、1mmol/lliac，用于不含聚乙二醇4000的原生質(zhì)體電擊轉(zhuǎn)化；電擊轉(zhuǎn)化緩沖液ii含有10mmol/ltris—hcl(ph5)、600mmol/l蔗糖、1mmol/lliac、300g/l聚乙二醇4000,用于含聚乙二醇4000的原生質(zhì)體電擊轉(zhuǎn)化；電擊轉(zhuǎn)化緩沖液iii含有10mmol/ltris—hcl(ph7.5)、270mmol/l蔗糖、1mmol/lliac，用于萌發(fā)抱子的電擊轉(zhuǎn)化。stc溶液含有1mol/l山梨醇、50mmol/ltris—hcl(ph8.0)、50mmol/lcacl2,ptc溶液含有400g/l聚乙二醇4000、50mmol/ltris—hcl(ph8.0)、50mmol/lcacl2。方法1.2.1原生質(zhì)體的制備參考文獻［19］。菌株m7577在產(chǎn)抱培養(yǎng)基上于30t培養(yǎng)7?10d,收集抱子并制備成均一的濃度為1X108?1X109個/ml的抱子懸液。取200“l(fā)抱子懸液涂布于鋪有玻璃紙的pda平板上，于30°C培養(yǎng)30h,收集菌絲體，用1mol/lmgso4溶液洗1次。約300mg菌絲體加30ml裂解酶液，于30t以60r/min酶解2?3h,過濾，濾液于4°C、以3200r/min離心10min。棄上清，用1.2mol/l預冷的山梨醇溶液洗原生質(zhì)體沉淀2次，分為2份。一份重懸于mol/l預冷的山梨醇溶液中，一份用預冷的stc溶液洗1次。兩份樣品均置于冰浴備用。質(zhì)粒的線性化用hindm酶切線性化質(zhì)粒pbc—hygro。酶切反應體系：36|jl10Xenzymebuffer，20jgpbc—hygro，12jl10u/jlhindm，加ddh2o至360jl，置于37C水浴2?4h，于65C水浴反應15min，停止反應，然后分為2份，一份備用，稱為質(zhì)粒8液；另一份用苯酚一氯仿抽提純化，然后溶解于無菌去離子水，稱為質(zhì)粒b液。remi技術(shù)的轉(zhuǎn)化方法參考文獻［20］。用預冷的stc溶液洗原生質(zhì)體并再重懸，濃度調(diào)整至5X107個/ml。取100jl轉(zhuǎn)化用原生質(zhì)體液，加入1jg環(huán)狀質(zhì)粒pbc—hygro，輕輕吹吸混勻；分別加限制性內(nèi)切酶hindm30?190u，冰浴30min，加1mlptc，于室溫靜置40?60min，涂布于含有120jg/ml潮霉素b的再生瓊脂糖固體培養(yǎng)基平板上，每個平板涂布200jl轉(zhuǎn)化

一論文發(fā)衷專家一中國學木囲刊網(wǎng)液。于30t暗培養(yǎng)4?5d,統(tǒng)計轉(zhuǎn)化子數(shù)。最適質(zhì)粒的選擇采用3個啟動子序列來源不同的環(huán)狀質(zhì)粒pbc—hygro>pcb1003>pan7—1,用量為75或105u的限制性內(nèi)切酶hindiii、saci、bamhi，將1pg不同質(zhì)粒和限制性內(nèi)切酶分別加到100M1 5X107個/ml原生質(zhì)體中，對紅曲霉進行轉(zhuǎn)化試驗，以潮霉素b抗性轉(zhuǎn)化子數(shù)為指標評價和篩選適合轉(zhuǎn)化紅曲霉的質(zhì)粒。最適限制性內(nèi)切酶的選擇選擇7種不同的限制性內(nèi)切酶為轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，其中平末端酶有smai和hpai,5‘端突出末端酶有hindiii、sa1i和ecori，3‘端突出末端酶有kpni、saci，向100p1 5X106個/ml原生質(zhì)體液中加入1pg線性或環(huán)狀質(zhì)粒pbc—hygro和75u限制性內(nèi)切酶進行轉(zhuǎn)化試驗，以不加酶處理的作對照，以潮霉素b抗性轉(zhuǎn)化子數(shù)為指標評價和篩選合適的限制性內(nèi)切酶。酶切緩沖液對轉(zhuǎn)化的影響試驗有7種試驗方案，100p1原生質(zhì)體液中，①加質(zhì)粒a液和105uhindiii，②加質(zhì)粒b液、105uhindii和10X酶切緩沖液，③加質(zhì)粒b液和105uhindiii，④加環(huán)狀質(zhì)粒、105uhindiii和10X酶切緩沖液，⑤加環(huán)狀質(zhì)粒和105uhindi，⑥加質(zhì)粒b液，⑦加環(huán)狀質(zhì)粒作為對照。然后輕輕吹吸混勻，

一論文發(fā)衷專家一中國學木囲刊網(wǎng)冰浴30min，加1mlptc溶液，于室溫靜置40?60min。取轉(zhuǎn)化液涂布于含有120|jg/ml潮霉素b的再生瓊脂糖固體培養(yǎng)基平板上，每個平板涂布200jl,于30°C暗培養(yǎng)4?5d,統(tǒng)計潮霉素b抗性轉(zhuǎn)化子數(shù)。1.2.7最適原生質(zhì)體濃度的選擇將8jg質(zhì)粒pbc—hygro和105u限制性內(nèi)切酶hindiii分別加入100jl濃度分別為1.0X106、5.0X106、1.0X105.0X107,1.0X108,1.5X108個/ml原生質(zhì)體中進行轉(zhuǎn)化試驗。以潮霉素b抗性轉(zhuǎn)化子數(shù)為指標確定適合轉(zhuǎn)化的紅曲霉原生質(zhì)體濃度。最適hindi用量的選擇在100jl含有8jg環(huán)狀質(zhì)粒pbc—hygro的5X107個/ml原生質(zhì)體中分別加入0、30、45、60、75、90、105、120、135、150、190uhindiii進行轉(zhuǎn)化試驗。以潮霉素b抗性轉(zhuǎn)化子數(shù)為指標確定最適合轉(zhuǎn)化的hindiii用量。最適質(zhì)粒用量的選擇在100jl含有100uhindi的5X107個/ml原生質(zhì)體中分別加入1、2、4、8、 16jg質(zhì)粒pbc—hygro進行轉(zhuǎn)化試驗。以潮霉素b抗性轉(zhuǎn)化子數(shù)為指標確定最適合紅曲霉轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒用量。結(jié)果與分析2.1最適質(zhì)粒的選擇結(jié)果為了探討不同構(gòu)建方法得到的質(zhì)粒對紅曲霉轉(zhuǎn)化的影響，試驗中用了3個啟動子序列來源不同的質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)化（質(zhì)粒均未線性化）,試驗中環(huán)狀質(zhì)粒用量為1|Jg,原生質(zhì)體濃度為5X107個/ml。由表1可知，質(zhì)粒pbc—hygro對紅曲霉的轉(zhuǎn)化率非常高，轉(zhuǎn)化子達（2 679土8）個/?g；pcb1003次之；pan7—1的轉(zhuǎn)化率最差，僅為15?41個/jg。由此可知，質(zhì)粒pbc—hygro和pcb1003適合于紅曲霉的轉(zhuǎn)化，而pan7—1用于紅曲霉的轉(zhuǎn)化不理想。因此后續(xù)試驗所用質(zhì)粒均為pbc—hygroo2．2最適限制性內(nèi)切酶的選擇結(jié)果應用remi技術(shù)建立遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)時，限制性內(nèi)切酶種類的選擇至關重要。為了選擇合適的限制性內(nèi)切酶，首先選擇7種不同的限制性內(nèi)切酶（包括5/端突出末端酶、3/端突出末端酶及平末端酶），以pbc—hygro為轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化紅曲霉并確定轉(zhuǎn)化能力。向100Jl5X106個/ml原生質(zhì)體液中加入1Jg線性或環(huán)狀質(zhì)粒和75u限制性內(nèi)切酶進行轉(zhuǎn)化試驗。由圖1可知，3種不同末端酶都能較好地介導質(zhì)粒pbc—hygro轉(zhuǎn)化進入紅曲霉，潮霉素b抗性轉(zhuǎn)化子數(shù)都較未加限制性內(nèi)切酶的對照提高了3倍以上，但提高幅度卻因酶種類的不同而存在較大差異。對于環(huán)狀質(zhì)粒，5‘端突出末端酶（hindm和sali）的作用效果優(yōu)于平末端酶(hpai和smai)和3‘端突出末端酶(kpni)。其中，hindiii和sali對轉(zhuǎn)化能力的提高和改善最有效，每微克質(zhì)粒dna的轉(zhuǎn)化子數(shù)約是對照的15倍。并且穩(wěn)定性檢測表明約有70%的轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定。由圖1還可知，具有同種類型末端的限制性內(nèi)切酶介導dna轉(zhuǎn)化紅曲霉的能力也存在很大差異。如平末端酶smai就優(yōu)于hpai，hindiii、sali優(yōu)于ecori。此外，選用的限制性內(nèi)切酶即使在被轉(zhuǎn)化的dna上不存在酶切位點，也仍能較好地介導dna轉(zhuǎn)化紅曲霉，如ecorio因此，限制性內(nèi)切酶hindiii和sali有利于轉(zhuǎn)化。酶切緩沖液對轉(zhuǎn)化紅曲霉的影響限制性內(nèi)切酶在特定的環(huán)境條件和反應體系里才能很好地發(fā)揮功能。為了探討酶切緩沖液是否會影響限制性內(nèi)切酶介導dna的轉(zhuǎn)化，選用了hindiii來進行試驗，原生質(zhì)體濃度為5X106個/ml。由表2可知，無論是線性質(zhì)粒還是環(huán)狀質(zhì)粒，在由限制性內(nèi)切酶hindm介導轉(zhuǎn)化紅曲霉時，添加酶切緩沖液導致轉(zhuǎn)化率降低，以環(huán)狀質(zhì)粒介導轉(zhuǎn)化dna時，轉(zhuǎn)化率下降尤為顯著。在限制性內(nèi)切酶介導轉(zhuǎn)化時添加酶切緩沖液，不僅沒有促進轉(zhuǎn)化率的提高，反而降低了轉(zhuǎn)化能力。其原因可能是加入酶切緩沖液后，離子濃度增大，離子種類也增多，改變了轉(zhuǎn)化反應環(huán)境，從而影響到紅曲霉細胞膜的通透性。從圖1和表2可知，質(zhì)粒是否線性化對紅曲霉的轉(zhuǎn)化效果（包括轉(zhuǎn)化子數(shù)和轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性）影響不顯著（P>0.05）,為了簡便和節(jié)約，后續(xù)試驗用環(huán)狀質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)化更為合適。最適原生質(zhì)體濃度的選擇結(jié)果無論是真核生物還是原核生物，轉(zhuǎn)化時受體細胞（或者感受態(tài)細胞）的濃度是影響轉(zhuǎn)化率的一個重要因素。因此，用質(zhì)粒Pbc-hygro和105u限制性內(nèi)切酶hindiii探討了原生質(zhì)體濃度對于轉(zhuǎn)化紅曲霉的影響。由圖2可知，原生質(zhì)體濃度為1X107?1X108個/ml時，每微克質(zhì)粒dna可獲得的潮霉素b抗性轉(zhuǎn)化子為2800?3300個。當原生質(zhì)體濃度低于1X107個/ml和高于1X108個/ml時，轉(zhuǎn)化子數(shù)開始大幅下降，表明原生質(zhì)體濃度過低和過高都會不利于外源dna進入受體細胞內(nèi)。因此，原生質(zhì)體濃度為1X107?1X108個/ml時最有利于轉(zhuǎn)化。最適hindiii用量的選擇結(jié)果remi介導轉(zhuǎn)化時，限制性內(nèi)切酶的濃度是需要優(yōu)化的重要條件之一，是影響轉(zhuǎn)化效率的關鍵因素。在100“l(fā)含有環(huán)狀質(zhì)粒的5X107個/ml原生質(zhì)體中分別加入不同濃度的hindi，結(jié)果如圖3，當hindiii用量為0?75u時，隨著hindiii用量的增加潮霉素b抗性轉(zhuǎn)化子數(shù)緩慢增多；當hindiii用量超過75u時，轉(zhuǎn)化子數(shù)陡然上升，至105u時達到最大。然后，隨著hindm用量繼續(xù)增大，轉(zhuǎn)化子數(shù)則開始減少,且差異顯著（p<0.05）o因而，hindiii用量為105?120u時最有利于轉(zhuǎn)化。最適質(zhì)粒用量的選擇結(jié)果100p1反應體系中加1、2|jg質(zhì)粒時的轉(zhuǎn)化子數(shù)很少；當增到4jg時轉(zhuǎn)化子數(shù)陡然增加，較1Jg時提高了1倍多；加到8jg時，轉(zhuǎn)化子數(shù)較4jg時顯著增多（p<0.05），有約3200個/jg。再增加至16jg時轉(zhuǎn)化率又大幅下降（圖4）。表明質(zhì)粒用量對轉(zhuǎn)化率有很大影響，最佳質(zhì)粒用量約為8jg/100j1。小結(jié)與討論采用remi技術(shù)介導轉(zhuǎn)化時，質(zhì)粒pbc—hygro和pcb1003適合于紅曲霉的轉(zhuǎn)化。質(zhì)粒是否線性化對轉(zhuǎn)化率影響不大，但添加酶切緩沖液不利于轉(zhuǎn)化；原生質(zhì)體濃度為1X107?1X108個/ml時最有利于轉(zhuǎn)化，hindiii介導紅曲霉轉(zhuǎn)化時的最佳酶用量為105?120u,質(zhì)粒用量為8jg/100j1時轉(zhuǎn)化率最高。remi技術(shù)首次報道的是用于saccharomycescerevisiae的非同源dna轉(zhuǎn)化［6］，aspergillusnidulans是第一個成功應用remi作為遺傳工具的絲狀真菌[12],隨后屢有報道。該技術(shù)不僅用于提高轉(zhuǎn)化率，還應用于其他的遺傳分析如基因和啟動子捕獲，遺傳互補分析等。轉(zhuǎn)化反應體系中，外源dna和受體細胞（原生質(zhì)體）的濃度之所以影響轉(zhuǎn)化子的數(shù)量，很大程度上可能是因為它們影響了外源dna進入細胞的能力，其原因可能是，原生質(zhì)體細胞之間的碰撞頻率以及外源dna與受體細胞之間的碰撞頻率都會因反應體系中細胞和外源dna的濃度而發(fā)生變化，從而影響外源dna與受體細胞膜表面的接觸機率；在小生態(tài)中，細胞個體之間存在信號物質(zhì)的傳遞，以此來調(diào)控細胞內(nèi)外環(huán)境的平衡以及群落個體之間的平衡，由此來維持群落的生命，因此，反應體系中原生質(zhì)體濃度會影響到細胞間的信號傳遞，從而調(diào)整細胞膜對胞外物質(zhì)的識別、結(jié)合與輸送等；此外，外源dna在反應體系中的濃度也會影響到受體細胞信號物質(zhì)的分泌及其在細胞間的傳遞，進而影響到細胞對特定胞外物質(zhì)的攝入量。參考文獻：thodes，schafera，pfeifferp，etal.anovelpathwayofdnaend—to—endjoining[j].cell，1990，60(6)：921—928.shiz，leungh.enhancedtransformationinmagnaporthegriseabyrestrietionenzymemediatedintegrationofplasmiddna[j].phytopathology,1994,85(3)：329—333.manivasakamp,schiestlrh.nonhomologousendjoiningduringrestrietionenzyme—mediateddnaintegrationinsaeeharomyeeseerevisiae[j].molcellbiol,1998,18(3)：1736—1745.yunsh,turgeonbg,yoderoe．remi—indueedmutantsofmyeosphaerellazeae—maydislaekingthepolyketidepm—toxinaredefieientinpathogenesistoeorn[j]．physiolmolplantpathol,1998,52(1)：53—66．rigglepj,kumamotoea．genetieanalysisinfungiusingrestrietion—enzyme—mediatedin

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