細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)-劉亮課件

細(xì)胞培養(yǎng)簡(jiǎn)介什么是細(xì)胞培養(yǎng)？細(xì)胞培養(yǎng)是指從動(dòng)物或植物中取出細(xì)胞，然后使其在合適的人工環(huán)境中生長(zhǎng)。這些細(xì)胞可于培養(yǎng)前直接從組織中取出并采用酶或機(jī)械方法進(jìn)行解離，或者也可來(lái)自已經(jīng)建立的細(xì)胞系或細(xì)胞株。原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)是指將細(xì)胞從組織中分離后，使其在合適的條件下增殖直到占據(jù)所有可用基質(zhì)(即：達(dá)到匯合狀態(tài))的培養(yǎng)階段。在此階段，必須將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的容器中并更換新鮮培養(yǎng)基，從而對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，為其提供更多繼續(xù)生長(zhǎng)的空間。細(xì)胞系首次傳代培養(yǎng)后，原代培養(yǎng)物即被稱為細(xì)胞系或者亞克隆。來(lái)自于原代培養(yǎng)的細(xì)胞系壽命有限(即：有限細(xì)胞系)，隨著細(xì)胞的傳代，生長(zhǎng)能力最強(qiáng)的細(xì)胞會(huì)占據(jù)優(yōu)勢(shì)，最終導(dǎo)致細(xì)胞群體在基因型和表型上達(dá)到一定程度的均一性。細(xì)胞株如果將細(xì)胞系的一個(gè)亞群通過(guò)克隆或者其他方法從培養(yǎng)物中明確地選擇出來(lái)，則此細(xì)胞系就成為一個(gè)細(xì)胞株。與親代細(xì)胞系起始時(shí)相比，細(xì)胞株往往會(huì)獲得其他一些遺傳學(xué)改變。細(xì)胞培養(yǎng)簡(jiǎn)介有限細(xì)胞系與連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)條件凍存

正常細(xì)胞通常只能分裂有限的次數(shù)，隨后就會(huì)喪失增殖的能力，這是一個(gè)由遺傳決定的事件，被稱為衰老；這種細(xì)胞系被稱為有限細(xì)胞系。但是，一些細(xì)胞系會(huì)通過(guò)被稱為轉(zhuǎn)化的過(guò)程變?yōu)橛郎约?xì)胞系，這一過(guò)程可自然發(fā)生，也可經(jīng)化學(xué)或病毒誘導(dǎo)發(fā)生。有限細(xì)胞系發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得無(wú)限分裂能力后，就成為連續(xù)細(xì)胞系。各種細(xì)胞的培養(yǎng)條件相差很大，但是細(xì)胞培養(yǎng)的人工環(huán)境必須包括合適的容器，容器中含有一定的基質(zhì)或介質(zhì)，為細(xì)胞提供必需的營(yíng)養(yǎng)素(氨基酸、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì))、生長(zhǎng)因子、激素和氣體(O2、CO2)，并可調(diào)節(jié)其物理化學(xué)環(huán)境(pH、滲透壓、溫度)。大多數(shù)細(xì)胞均具有貼壁依賴性，必須貼附在固體或半固體基質(zhì)上培養(yǎng)(貼壁或者單層培養(yǎng))，而另一些細(xì)胞則可在培養(yǎng)基中漂浮生長(zhǎng)(懸浮培養(yǎng))。如果傳代時(shí)有多余的細(xì)胞，可通過(guò)適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑(例如：DMSO或甘油)處理細(xì)胞，儲(chǔ)存在–130°C以下的溫度下(凍存)，直到需要使用之時(shí)。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室

安全除了大多數(shù)日常工作場(chǎng)所共有的一些安全風(fēng)險(xiǎn)例如電擊和火災(zāi)之外，細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室由于要操作和處理人或動(dòng)物細(xì)胞和組織以及一些有毒、有腐蝕性或者有致突變性的溶劑和試劑，因而還具有一些特殊的危險(xiǎn)。其中，最常見(jiàn)的一些危險(xiǎn)包括：注射器針頭或者其他污染銳器刺傷、液體潑濺到皮膚和粘膜上、經(jīng)口吞入毒物以及吸入感染性氣體揮發(fā)。任何生物安全程序的基本目的都是為了減少或避免實(shí)驗(yàn)室工作人員和外部環(huán)境與潛在危害性生物物質(zhì)的接觸。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中最重要的安全要素是嚴(yán)格遵守標(biāo)準(zhǔn)微生物學(xué)準(zhǔn)則和技術(shù)。美國(guó)生物安全性法規(guī)和建議包含在由美國(guó)疾病預(yù)防控制中心(CDC)和國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)制定、美國(guó)衛(wèi)生和福利部頒布的《微生物和生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全》文件中。該文件規(guī)定了四個(gè)逐級(jí)升高的控制等級(jí)，依次稱為生物安全1級(jí)至4級(jí)，介紹了按照操作某一制劑時(shí)對(duì)應(yīng)的危險(xiǎn)等級(jí)應(yīng)遵守的微生物學(xué)準(zhǔn)則、應(yīng)使用的安全設(shè)備以及應(yīng)采取的設(shè)施安全措施。生物安全1級(jí)(BSL-1)BSL-1為適合大多數(shù)研究和臨床實(shí)驗(yàn)室的基礎(chǔ)防護(hù)等級(jí)，適用于不會(huì)導(dǎo)致健康正常人發(fā)生疾病的物質(zhì)。生物安全2級(jí)(BSL-2)BSL-2適用于經(jīng)口吞入或者經(jīng)皮膚、粘膜接觸會(huì)導(dǎo)致人發(fā)生不同嚴(yán)重程度疾病的中度危險(xiǎn)性物質(zhì)。大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室至少應(yīng)達(dá)到BSL-2等級(jí)，但是確切要求取決于所用細(xì)胞系以及開(kāi)展的工作類型。生物安全3級(jí)(BSL-3)BSL-3適用于已知可能會(huì)通過(guò)氣體揮發(fā)傳播的本地或外來(lái)性物質(zhì)以及可導(dǎo)致嚴(yán)重、甚至致命感染的物質(zhì)。生物安全4級(jí)(BSL-4)BSL-4適用于具有高度個(gè)體風(fēng)險(xiǎn)、可通過(guò)感染性氣體揮發(fā)導(dǎo)致威脅生命的不治之癥的外來(lái)性物質(zhì)。應(yīng)將此類物質(zhì)控制在高防范等級(jí)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。生物安全性等級(jí)安全數(shù)據(jù)表(SDS)，又被稱為材料安全數(shù)據(jù)表(MSDS)，是一種包含某物質(zhì)各種屬性信息的表格。SDS中包括諸如熔點(diǎn)、沸點(diǎn)和閃點(diǎn)等物理數(shù)據(jù)、有關(guān)該物質(zhì)毒性、反應(yīng)性、健康影響、儲(chǔ)存和處置的信息，以及應(yīng)對(duì)潑濺的推薦防護(hù)設(shè)備和措施。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的安全設(shè)備包括初級(jí)屏障，例如：生物安全柜、密閉容器及其他用于消除或盡量減少危險(xiǎn)品接觸的工程控制設(shè)備，以及常與初級(jí)屏障配合使用的個(gè)人防護(hù)設(shè)備(PPE)。生物安全柜(即：細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥)是最重要的安全設(shè)備，可以限制多種微生物學(xué)操作產(chǎn)生的感染性潑濺或氣體揮發(fā)，并可防止您培養(yǎng)的細(xì)胞受到污染。個(gè)人防護(hù)設(shè)備(PPE)在人員與危險(xiǎn)品之間形成一道直接的屏障，包括用于個(gè)人防護(hù)的物品，例如：手套、實(shí)驗(yàn)室工作服和隔離衣、鞋套、靴子、呼吸器、面罩、防護(hù)鏡或護(hù)目鏡。個(gè)人防護(hù)設(shè)備常與生物安全柜及其他可限制所操作物質(zhì)或材料的裝置配合使用。安全數(shù)據(jù)表(SDS)安全設(shè)備個(gè)人防護(hù)設(shè)備(PPE)下列建議僅為實(shí)驗(yàn)室安全規(guī)范的指導(dǎo)原則，不應(yīng)將其視為完整的工作準(zhǔn)則。?必須始終穿戴適當(dāng)?shù)膫€(gè)人防護(hù)設(shè)備。手套污染時(shí)應(yīng)更換，將用過(guò)的手套與其他污染的實(shí)驗(yàn)室廢物一起處置。?操作可能具有危害的物質(zhì)后以及離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室前應(yīng)洗手。?在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不得進(jìn)食、飲水、吸煙、處理隱形眼鏡、涂抹化妝品或者存放供人食用的食物。?遵守所在機(jī)構(gòu)關(guān)于銳器(即：針頭、手術(shù)刀、吸管和破裂的玻璃器皿)安全操作的準(zhǔn)則。?小心操作，盡量避免形成氣體揮發(fā)和/或潑濺。?實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前、結(jié)束后以及可能具有傳染性的物質(zhì)發(fā)生潑濺時(shí)，應(yīng)立即使用適當(dāng)?shù)娜ノ蹌?duì)所有工作臺(tái)面進(jìn)行去污。無(wú)論實(shí)驗(yàn)室設(shè)備是否被污染，均應(yīng)定期進(jìn)行清潔。?在對(duì)可能具有傳染性的物質(zhì)進(jìn)行處置前應(yīng)先去除污染。?發(fā)生事故可能導(dǎo)致感染性物質(zhì)暴露時(shí)，應(yīng)向相應(yīng)人員(例如：實(shí)驗(yàn)室主管、安全員)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)室安全規(guī)范?細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥(即：層流通風(fēng)櫥或生物安全柜)?培養(yǎng)箱(推薦使用濕式二氧化碳培養(yǎng)箱)?水浴鍋?離心機(jī)?冰箱和冰柜(–20°C)?細(xì)胞計(jì)數(shù)器(例如：CountessR自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器或血球計(jì)數(shù)器)?倒置顯微鏡?液氮(N2)冷凍柜或凍存容器?滅菌器(即：高壓滅菌器)?抽吸泵(蠕動(dòng)泵或真空泵)?pH計(jì)?共聚焦顯微鏡?流式細(xì)胞儀?細(xì)胞培養(yǎng)容器(例如：培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、滾瓶、多孔板)?吸管和移液器?注射器和針頭?廢物容器?培養(yǎng)基、血清和試劑?細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備基本設(shè)備擴(kuò)增設(shè)備其他用品細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥大小應(yīng)足夠一人使用，內(nèi)部和外部均易于清潔，具有充足的照明，使用舒適，不會(huì)導(dǎo)致體位不便。保持細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥內(nèi)工作空間整潔有序，將所有物品置于直視范圍內(nèi)。向放入細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥內(nèi)的所有物品噴灑70%乙醇，擦拭清潔，進(jìn)行消毒。細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥內(nèi)物品的擺放一般遵循以下右手使用習(xí)慣，并可根據(jù)特殊實(shí)驗(yàn)中增加的物品進(jìn)行相應(yīng)的改動(dòng)。?在通風(fēng)櫥中部開(kāi)闊區(qū)域放置細(xì)胞培養(yǎng)容器?移液器置于右前方易于取用的地方?試劑和培養(yǎng)基置于右后方，便于吸取?試管架置于中后部，用于固定其他試劑?小型容器置于左后部，用于盛放廢液細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥布局培養(yǎng)箱的作用是為細(xì)胞生長(zhǎng)提供合適的環(huán)境。培養(yǎng)箱大小應(yīng)足夠滿足實(shí)驗(yàn)室需要，具有強(qiáng)制空氣循環(huán)，并且具有溫度控制系統(tǒng)，可將溫度波動(dòng)控制在±0.2°C范圍內(nèi)。不銹鋼培養(yǎng)箱易于清潔，耐腐蝕，尤其適合使用濕化空氣進(jìn)行培養(yǎng)的情況。雖然細(xì)胞培養(yǎng)箱的無(wú)菌性要求不如細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥嚴(yán)格，但是必須經(jīng)常對(duì)其進(jìn)行清潔，以免培養(yǎng)的細(xì)胞受到污染。培養(yǎng)箱種類目前培養(yǎng)箱有兩種基本類型，即：干式培養(yǎng)箱和濕式二氧化碳培養(yǎng)箱。干式培養(yǎng)箱較為經(jīng)濟(jì)，但是需要將細(xì)胞在密封的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，以防止培養(yǎng)基蒸發(fā)。在干式培養(yǎng)箱中放置一只水盤(pán)可以增加一定的濕度，但是無(wú)法精確控制培養(yǎng)箱內(nèi)的空氣條件。濕式二氧化碳培養(yǎng)箱較為昂貴，但是能夠準(zhǔn)確控制培養(yǎng)條件。這種培養(yǎng)箱可用于培養(yǎng)皿或多孔板中細(xì)胞的培養(yǎng)，這種培養(yǎng)方式需要將空氣控制在高濕度、高二氧化碳?jí)毫Φ臓顟B(tài)。培養(yǎng)箱一定濃度的CO2對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)，尤其是原代培養(yǎng)和單細(xì)胞培養(yǎng)有促進(jìn)作用（5%）。一定濃度的CO2可提供培養(yǎng)液恒定的pH。適用于開(kāi)放培養(yǎng)，培養(yǎng)箱封口后，可在一般恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，但是采用培養(yǎng)皿或多孔板培養(yǎng)時(shí)，則需高濕度和高CO2含量的空氣。它增加了濕度，箱體內(nèi)裝有水浴，可以保證培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度。培養(yǎng)箱內(nèi)裝有紫外燈。能過(guò)氣體流量計(jì)可以調(diào)節(jié)CO2和空氣的比例。在水中可加入防腐劑（二氧乙酸）?？煞乐挂駽O2培養(yǎng)箱中濕度較高，易長(zhǎng)霉菌。培養(yǎng)箱細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)設(shè)置多個(gè)儲(chǔ)存區(qū)，分別用于存放液體(如培養(yǎng)基和試劑)、化學(xué)品(如藥物和抗生素)、耗材(如一次性吸管、培養(yǎng)瓶和手套)、玻璃器皿(如培養(yǎng)基瓶和玻璃吸管)、特殊設(shè)備以及組織和細(xì)胞。玻璃器皿、塑料制品和特殊設(shè)備可置于架子上或抽屜中于室溫下存放；但是，所有培養(yǎng)基、試劑和化學(xué)品均應(yīng)按照標(biāo)簽說(shuō)明存放。一些培養(yǎng)基、試劑和化學(xué)品對(duì)光線敏感，盡管其可耐受光照狀態(tài)下正常的實(shí)驗(yàn)室使用，但是不使用時(shí)必須將其存放在暗處或者用鋁箔包裹起來(lái)。對(duì)于小型細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，家用冰箱(最好是不含自動(dòng)除霜冷凍室的冰箱)即可供試劑和培養(yǎng)基于2–8°C下存放之用，而且價(jià)格低廉。大型實(shí)驗(yàn)室，采用專供細(xì)胞培養(yǎng)的冷藏室較為合適。應(yīng)確保定期打掃冰箱或冷藏室，以防污染。大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)試劑可于–5°C至–20°C下儲(chǔ)存；因此，可以采用超低溫冰柜(即：–80°C冰柜)存放多數(shù)試劑。與實(shí)驗(yàn)室冰柜相比，家用冰柜是一種較為便宜的選擇。盡管大多數(shù)試劑可耐受自動(dòng)除霜(即：自動(dòng)解凍)冰柜內(nèi)的溫度波動(dòng)，但是有些試劑(例如抗生素和酶)則應(yīng)儲(chǔ)存在無(wú)自動(dòng)除霜功能的冰柜中。儲(chǔ)存冰箱冰柜隨著傳代次數(shù)的增加，連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞系可能發(fā)生遺傳不穩(wěn)定；因此，必須準(zhǔn)備工作細(xì)胞儲(chǔ)備并將其存放于低溫狀態(tài)下。不得將細(xì)胞存放于–20°C或–80°C冰柜中，因?yàn)榧?xì)胞存放于上述溫度條件下活力會(huì)迅速降低。目前主要有兩種液氮儲(chǔ)存系統(tǒng)，即：蒸汽相和液相儲(chǔ)存系統(tǒng)，分別采用廣口和細(xì)口儲(chǔ)存容器。蒸汽相系統(tǒng)可降低凍存管爆炸危險(xiǎn)，儲(chǔ)存生物危害性物質(zhì)時(shí)應(yīng)使用該系統(tǒng)，液相系統(tǒng)通常具有更長(zhǎng)的靜態(tài)保溫時(shí)間，因而更為經(jīng)濟(jì)。細(xì)口容器中液氮蒸發(fā)速度較慢，更為經(jīng)濟(jì)，而廣口容器存取方便，儲(chǔ)存容量較大。細(xì)胞計(jì)數(shù)器是定量監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)的必備工具，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)同時(shí)培養(yǎng)2-3種以上細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞計(jì)數(shù)器能夠提供巨大的便利。低溫儲(chǔ)存細(xì)胞計(jì)數(shù)器無(wú)菌技術(shù)簡(jiǎn)介良好的個(gè)人衛(wèi)生

細(xì)胞培養(yǎng)的成功很大程度上取決于保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)菌、真菌和病毒等微生物的污染。非無(wú)菌物品、培養(yǎng)基和試劑、帶有微生物的空氣顆粒、不干凈的培養(yǎng)箱和污染的工作臺(tái)面均是導(dǎo)致微生物污染的來(lái)源。無(wú)菌技術(shù)的作用是在環(huán)境微生物與無(wú)菌的細(xì)胞培養(yǎng)物之間形成一道屏障，它通過(guò)一套操作流程來(lái)降低培養(yǎng)物被上述污染源污染的可能。無(wú)菌技術(shù)的組成要素包括：無(wú)菌工作區(qū)域、良好的個(gè)人衛(wèi)生、無(wú)菌試劑和培養(yǎng)基以及無(wú)菌操作。無(wú)菌技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物污染往往是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室最常遇到的問(wèn)題，有時(shí)會(huì)帶來(lái)十分嚴(yán)重的后果。凡混入細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物都應(yīng)視為污染。盡管無(wú)法徹底消除污染，但是可以通過(guò)充分了解污染源以及采用良好的無(wú)菌技術(shù)，降低污染發(fā)生的頻率和嚴(yán)重程度。。

物理污染

化學(xué)污染

生物污染掌握良好的無(wú)菌操作技術(shù)

建立細(xì)胞庫(kù)

合理應(yīng)用抗生素

保持工作區(qū)清潔

建立良好的規(guī)章制度

檢測(cè)細(xì)胞污染細(xì)胞培養(yǎng)污染簡(jiǎn)介分類控制污染新購(gòu)買的血清用之前要試

應(yīng)選用同一批次的血清

選用純度最高的試劑

經(jīng)過(guò)權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)定

正確的儲(chǔ)存方法

用來(lái)配液和清洗容器

傳統(tǒng)用雙蒸和三蒸水

超純水放置過(guò)久導(dǎo)致純度下降

生產(chǎn)過(guò)程中有毒物質(zhì)殘留，如內(nèi)毒素

消毒劑和清洗劑的殘留

鋁箔和包裹紙殘留CO2混有有毒氣體

消毒劑和清洗劑的殘留化學(xué)污染血清培養(yǎng)液及試劑水培養(yǎng)用器皿孵箱容易發(fā)現(xiàn)的生物污染包括細(xì)菌、霉菌、酵母不容易被發(fā)現(xiàn)的生物污染包括病毒、支原體、原蟲(chóng)以及其他細(xì)胞系的交叉污染。

無(wú)抗生素污染易被發(fā)現(xiàn)

抗生素存在易造成隱性污染

隱性污染引起嚴(yán)重后果最難發(fā)現(xiàn)和清除

嚴(yán)格的宿主性

自限性

對(duì)實(shí)驗(yàn)人員是一個(gè)潛在的危險(xiǎn)因素生物污染細(xì)菌、霉菌和酵母病毒霉菌是真菌界的一種真核微生物，以被稱為菌絲的多細(xì)胞絲狀體形式生長(zhǎng)。這些多細(xì)胞絲狀體構(gòu)成的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)含有遺傳性相同的細(xì)胞核，被稱為集落或者菌絲體。與酵母污染類似，霉菌污染初期培養(yǎng)物pH值會(huì)維持穩(wěn)定，污染加重后pH值會(huì)迅速升高，導(dǎo)致培養(yǎng)物渾濁。在顯微鏡下，菌絲體通常呈細(xì)束狀纖維，有時(shí)呈較為密集的孢子團(tuán)塊。許多種霉菌的孢子在休眠期均可耐受極端嚴(yán)峻、不利的環(huán)境，當(dāng)其遇到合適的生長(zhǎng)條件時(shí)才會(huì)被活化。病毒是一種微觀感染性物質(zhì)，利用宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行復(fù)制。病毒體積極小，因而要檢測(cè)培養(yǎng)物中有無(wú)病毒以及將其從細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室所用試劑中去除都十分困難。由于大多數(shù)病毒對(duì)宿主有非常嚴(yán)格的要求，因此一般不會(huì)對(duì)與其宿主物種不同的細(xì)胞培養(yǎng)物造成不良影響。但是，使用病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)卻會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員造成嚴(yán)重的健康威脅，特別是當(dāng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的是人或靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞時(shí)。通過(guò)電子顯微鏡檢查、一組抗體的免疫染色、ELISA實(shí)驗(yàn)或者采用適當(dāng)病毒引物的PCR技術(shù)可以檢測(cè)出細(xì)胞培養(yǎng)物的病毒污染。生物污染霉菌病毒細(xì)菌是一大類廣泛存在的單細(xì)胞微生物。細(xì)菌直徑一般為幾個(gè)微米，外形多樣，例如：球狀、桿狀和螺旋狀。細(xì)菌由于分布廣泛、生長(zhǎng)迅速以及體積大小的特點(diǎn)，與酵母和霉菌一起構(gòu)成了細(xì)胞培養(yǎng)中最常遇到的生污染物。培養(yǎng)物被細(xì)菌污染后，幾天內(nèi)即可通過(guò)簡(jiǎn)單的肉眼觀察發(fā)現(xiàn)；被感染的培養(yǎng)物通常呈云霧狀(即：渾濁狀)，有時(shí)表面會(huì)覆蓋一層薄膜。另外，經(jīng)常還會(huì)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的pH值突然降低。在低倍顯微鏡下可見(jiàn)，細(xì)菌為細(xì)胞之間移動(dòng)的微小顆粒，在高倍顯微鏡下觀察可以分辨出各個(gè)細(xì)菌的形狀。生物污染細(xì)菌貼壁生長(zhǎng)的293細(xì)胞被大腸桿菌污染酵母是真菌界的一種單細(xì)胞真核微生物，大小從數(shù)微米(多見(jiàn))到40微米(罕見(jiàn))不等。與細(xì)菌污染類似，培養(yǎng)物被酵母污染后也會(huì)變得渾濁，特別是進(jìn)入污染后期時(shí)。培養(yǎng)物被酵母污染后pH值變化極小，污染嚴(yán)重時(shí)pH值才會(huì)升高。在顯微鏡下，酵母呈單個(gè)卵圓形或球形顆粒，有些會(huì)芽生出較小的顆粒。生物污染酵母貼壁生長(zhǎng)的293細(xì)胞接種24小時(shí)后被酵母感染。

影響細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及形態(tài)

影響細(xì)胞的代謝和功能（1）培液中的精氨酸被支原體大量消耗，引起細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA、rRNA、mRNA的合成障礙；（2）支原體活動(dòng)使培液成分發(fā)生改變（如發(fā)酵型支原體降解糖類產(chǎn)生酸性物質(zhì)），影響細(xì)胞代謝。（3）支原體吸附在細(xì)胞表面，破壞細(xì)胞膜的完整性，影響細(xì)胞信號(hào)傳遞；（4）支原體消耗細(xì)胞的核苷庫(kù)—染色體異常其他此外，支原體污染還會(huì)影響一些病毒在細(xì)胞中的產(chǎn)量、使惡性細(xì)胞致癌能力下降、影響淋巴細(xì)胞分化等。支原體支原體檢測(cè)方法方法敏感性優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)直接DNA染色（如Hoechst33258）低快速，便宜需要熒光顯微鏡，結(jié)果不易解釋指示細(xì)胞間接DNA染色（如Vero）中放大污染，結(jié)果易解釋費(fèi)時(shí)免疫熒光單克隆抗體高易操作靈敏需要熒光顯微鏡肉湯和瓊脂培養(yǎng)高靈敏慢且需要專業(yè)解釋ELISA中快速檢查種類有限PCR中-高特異性強(qiáng)，快速需要PCR設(shè)備相差顯微鏡檢測(cè)能直接觀察到需要相差油鏡低張?zhí)幚淼匾录t染色法3-H胸腺嘧啶摻入法樹(shù)立“預(yù)防為主”的思想保證細(xì)胞來(lái)源干凈確保基質(zhì)和器材無(wú)菌嚴(yán)格無(wú)菌操作細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)避免交談操作結(jié)束時(shí)消毒臺(tái)面每傳15代細(xì)胞應(yīng)更換所有細(xì)胞培養(yǎng)材料丟棄前應(yīng)高壓消毒生物污染支原體細(xì)胞一旦發(fā)生了支原體污染，應(yīng)當(dāng)棄之。雖然已有了針對(duì)支原體的抗生素及最近出現(xiàn)的所謂支原體清除劑，這些方法只能殺滅細(xì)胞外的支原體，除非是不可替代或無(wú)法重新獲得的細(xì)胞，一般沒(méi)有必要進(jìn)行支原體清除工作。四種支原體污染救治方案療效比較支原體污染方法時(shí)間細(xì)胞損傷價(jià)格是否復(fù)發(fā)加溫法短，約24h時(shí)間不易掌握，易對(duì)細(xì)胞造成損傷非常便宜可能多西環(huán)素、環(huán)丙沙星聯(lián)合治療較短，約48h藥物劑量不易控制，量大易對(duì)細(xì)胞造成損傷便宜可能BM-Cyclin-1,2排除法較長(zhǎng)，約10天對(duì)細(xì)胞幾乎無(wú)損傷較昂貴一般不會(huì)裸鼠過(guò)繼法長(zhǎng)，約1月對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷昂貴不會(huì)不同公司支原體去除劑比較名稱MRAPlasmocintreatmentBM-CyclinBIOMYC-1BIOMYC-2BIOMYC-3產(chǎn)品貨號(hào)3050044ant-mpt1079905000103-036-103-037-103-038-1生產(chǎn)商MPBiochemicalsInvivoGenRocheBioindBioind有效成分喹諾酮類衍生物大環(huán)內(nèi)脂類、喹諾酮類泰妙菌素二甲胺四環(huán)素泰妙菌素二甲胺四環(huán)素弗諾喹酮類有效濃度(ug/ml)0.512.5-37.5BC1:10，BC2:51ml/100ml1ml/100ml作用時(shí)間1周，短2周，長(zhǎng)BC1三天，BC2四天，2次循環(huán)BM1四天，BM2三天，2-3次循環(huán)2周，每2-3天換藥產(chǎn)品總量5ml(50ug/ml)2*1ml(25mg/ml)BC1:25mgBC2:12.5mg100*10ml100*10ml細(xì)胞毒性+/-幾乎無(wú)+/-++/-+/-預(yù)防支原體污染可以，0.1ug/ml不可以不確定不確定不確定雖然不如微生物污染普遍，但是許多細(xì)胞系與HeLa細(xì)胞及其他生長(zhǎng)迅速的細(xì)胞系間廣泛的交叉污染是一個(gè)明確的問(wèn)題，會(huì)造成嚴(yán)重的后果。從聲譽(yù)好的細(xì)胞庫(kù)獲取細(xì)胞系、定期檢查細(xì)胞系的性質(zhì)以及采用良好的無(wú)菌技術(shù)是有助于避免交叉污染的慣例方法。通過(guò)DNA指紋圖譜、核型分析和同位素分析可以確認(rèn)細(xì)胞培養(yǎng)物有無(wú)交叉污染。細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)不應(yīng)常規(guī)使用抗生素，因?yàn)檫B續(xù)使用抗生素會(huì)促進(jìn)抗生素耐藥性細(xì)胞株的產(chǎn)生，導(dǎo)致輕度污染持續(xù)存在。一旦將抗生素從培養(yǎng)基中去除，這種輕度污染最終將發(fā)展成大規(guī)模污染，而且連續(xù)使用抗生素還會(huì)掩蓋支原體感染及其他隱性污染。另外，有些抗生素會(huì)與細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)，干擾您研究的細(xì)胞過(guò)程。抗生素只能作為對(duì)付污染的最后手段而且只能短期使用，并應(yīng)盡快撤除。如果長(zhǎng)期使用抗生素，則應(yīng)同時(shí)進(jìn)行無(wú)抗生素培養(yǎng)，以便作為鑒別隱性感染的對(duì)照。生物污染交叉污染抗生素的使用控制污染清洗和消毒清洗1玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗配方成分弱酸次強(qiáng)酸強(qiáng)酸重鉻酸鉀(g)5010060清水(ml)10001000200濃硫酸(ml)90160800硫酸濃度(v/v)8%14%80%Note：

選用酎酸塑料桶或不銹鋼桶配制為宜。

先將重鉻酸鉀溶于水（用玻璃棒攪拌助溶，有時(shí)不能完全溶解。

緩緩加入濃硫酸，切忌過(guò)急，否則將產(chǎn)熱而發(fā)生危險(xiǎn)（絕不可將重鉻酸鉀倒入濃硫酸中）。

清潔液配好呈棕紅色，待變綠色時(shí)表明失效，由于清潔液的腐蝕性極強(qiáng)，配制與應(yīng)用時(shí)必須小心，并做好防護(hù)。重鉻酸鉀-濃硫酸復(fù)合清潔液玻璃器皿的清洗矽酸鈉洗液貯存液（100×）矽酸鈉80g加偏磷酸鈉9g在加熱溶在1000ml水中。使用時(shí)用水稀釋100倍，將器皿放入煮沸20min，冷卻后沖洗，再用2%HCl浸泡2h后，自來(lái)水沖洗。矽酸鈉洗液較清潔液安全，但價(jià)格較貴。除菌濾器的處理用過(guò)的濾器將濾膜去除，用三蒸水充分洗凈殘余液體，置于干燥箱中烘干備用。塑料器皿的清洗膠塞等橡膠類的處理及清洗金屬器械的清洗包裝包裝的目的是防止消毒滅菌后再次遭受污染，所以經(jīng)清洗烤干或晾干的器材，應(yīng)嚴(yán)格包裝后再行消毒滅菌處理消毒滅菌適用于玻璃器皿的消毒，160-170℃，90-120min或180℃45-60min。優(yōu)點(diǎn)：使用簡(jiǎn)便，消毒后的物品干燥，易于保存。缺點(diǎn)：干熱傳導(dǎo)較慢，需較長(zhǎng)時(shí)間。用于玻璃制品、濾器、橡膠塞、解剖用具、耐熱塑料器具、受熱不變性的溶液等，不同物品的有效滅菌壓力和時(shí)間不同，如：培養(yǎng)液、橡膠制品、塑料器皿等[68kPa（115℃），10min]；布類、玻璃制品、金屬器械等[103kPa(121℃)，15min]。