電針手厥陰心包經(jīng)穴對 MCAO 大鼠血清、腦組織中 NGF 和 Nogo

電針手厥陰心包經(jīng)穴對MCAO大鼠血清、腦組織中NGF和Nogo〔〕:

摘要：目的討論電針心經(jīng)穴對腦缺血損傷的干預效應及神經(jīng)保護、血管新生的作用。方法將SD大鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組、心經(jīng)組、肺經(jīng)組，每組10只。采用頸外動脈插入線栓法復制局灶性腦缺血模型。心經(jīng)組取"靈道";"極泉";"少海";"神門";穴，肺經(jīng)組取"天府";"尺澤";"列缺";"太淵";穴，于造模后6、24、48、72h進展電針治療，每次30min。用TTC染色法檢測腦梗死體積，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中神經(jīng)生長抑制因子〔Nogo-A〕的含量，免疫組化法檢測腦梗死區(qū)Nogo-A的表達程度。結果與正常組、假手術比擬，模型組血清Nogo-A含量增多〔P0.05〕。結論電針可降低血清、腦組織中Nogo-A的含量，且心經(jīng)組作用優(yōu)于肺經(jīng)組，對腦缺血后神經(jīng)修復具有一定促進作用。

關鍵詞：MCAO大鼠；電針；心經(jīng)穴

本文引用格式：馬紋蕊,武娟,灑玉萍,等.電針手厥陰心包經(jīng)穴對MCAO大鼠血清、腦組織中NGF和Nogo-A的影響[J].世界最新醫(yī)學信息文摘,2022,19(80):221-223.

0引言

腦梗死是由于動脈狹窄或完全閉塞，導致腦組織缺氧、缺血、壞死，從而引起的一種腦血管疾病。根據(jù)臨床報告顯示，目前腦缺血疾病的治療普遍應用針灸，研究發(fā)現(xiàn)針灸可以干預腦缺導致血發(fā)病相關的多種危險因素[1-2]，對患者語言、運動、神志等功能的進步和預防并改善并發(fā)癥都有顯著的促進作用[3-5]。大量文獻記載[6-7]電針"內關";和"神門";對腦缺血損傷后心腦組織細胞凋亡與炎性損傷有抵抗作用，電針"內關";、"曲澤";有促進腦缺血血管新生的作用。此次實驗擬以大鼠局灶性腦缺血模型〔MCAO〕為觀察對象，觀察電針心經(jīng)穴對大鼠神經(jīng)功能缺損、腦梗死體積、微血管密度以及對大鼠血清和腦組織中Nogo-A表達的影響。探究電針心經(jīng)穴對腦缺血損傷的干預效應及神經(jīng)保護、血管新生的作用，為心經(jīng)穴治療腦血管病及從心治腦的研究提供實驗根據(jù)。

1材料與方法

1.1動物與分組

SPF級安康成年雄性SD大鼠50只，體重220~250g。其飼養(yǎng)籠具、墊料、飼料、飲水均按照SPF級實驗動物的要求進展制備和消毒，造模前禁食1d。

動物分組采用先造模后分組的方式，將大鼠隨機分為5組，每組6只。正常組：不作處理；模型組：MCAO模型對照組；假手術組：大鼠切開頸部皮膚，別離CCA及ICA至PPA，不插栓線；手少陰心經(jīng)穴組：造模＋電針心經(jīng)穴；手太陰肺經(jīng)穴組：造模＋電針肺經(jīng)穴。

1.2主要試劑與儀器

主要試劑：Nogo-A酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒；Nogo-A兔抗鼠抗體；SABC免疫組化染色試劑盒；

主要儀器：SDZ-II華佗電針治療儀、華佗牌0.30mmx15mm毫針；全自動酶標洗板機；酶標儀；電熱恒溫枯燥箱；石蠟切片機;雙目顯微鏡；顯微攝像系統(tǒng)；高明晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)。

1.3造模方法

采用大鼠大腦中動脈持久性局灶性缺血模型。參照ZeaLonga和Koizumi[8-9]報道的方法，即用頸外動脈插入線栓法建立MCAO腦缺血模型。造模完成后對各組大鼠采用ZeaLonga5級4分制評分：無神經(jīng)功能缺損計0分；梗死對側前爪內收、伸直障礙計1分；向偏癱側轉圈者計2分；行走時向偏癱側傾倒計3分；意識喪失、不能行走計4分。選取評分為1-3分的大鼠納入觀察。假手術組僅暴露頸部正中切口，不做其他處理。

1.4針刺方法

根據(jù)?實驗針灸學?[10]動物穴位圖譜及擬人比照法定位：按照經(jīng)脈"從胸走手";的循行方向，依次選取癱瘓側肢體不同節(jié)段的常用穴位，作為心經(jīng)、肺經(jīng)的代表穴。手少陰心經(jīng)選取神門、靈道、少海、極泉；手太陰肺經(jīng)選取太淵、列缺、尺澤、天府。

于造模后6、24、48、72h時進展治療，針刺癱瘓側上肢，以15mm、36號毫針刺入穴位，針刺深度3-4mm，接SDZ-Ⅱ型電針治療儀。"神門";"靈道";一組，"少海";"極泉";一組，"太淵";"列缺";一組，"尺澤";"天府";一組，正極接近心端穴位，負極接遠心端穴位，采用連續(xù)波，頻率為20Hz，輸出電壓2-4V，輸出電流4-6mA以部分組織輕顫為度，時間30min。

1.5觀察指標及檢測方法

大鼠血清Nogo-A含量的檢測：治療完畢后，所有大鼠用10%水合氯醛〔0.3mL/100g〕腹腔注射麻醉，腹主動脈插管取血4-5mL，靜置30min后離心(3000r/min,15min)，用移液槍抽取上清液，嚴格按照試劑盒的操作說明，應用ELISA法檢測血清Nogo-A的濃度。以標準物的濃度為橫坐標，吸光度(OD)值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

Nogo-A在腦梗死區(qū)的陽性表達：處死大鼠，斷頭取腦，切取病灶側腦組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、透蠟、包埋、切片，切片厚度4um，選取相鄰的切片分別應用免疫組織化學法檢測梗死區(qū)腦組織的Nogo-A表達量。詳細步驟：石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min，采用高壓修復，當高壓鍋漸漸噴氣時，計時2min，自然冷卻，蒸餾水水洗，PBS洗5minx3次，3%H2O2室溫20min，PBS洗2minx3次，滴加一抗兔抗鼠〔1:100〕，4℃過夜，PBS洗2minx3次，滴加二步法二抗通用工作液，室溫30min，PBS洗3minx3次，DAB顯色，蘇木精復染，脫水透明，分片。免疫組化后，Nogo-A在腦細胞胞質及突起內標記為棕黃色的顆粒。應用高明晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)，每只大鼠取5張切片，每張切片選取患側腦組織海馬區(qū)C1、C2、C3周邊選擇3個高倍〔x400〕視野進展NGF和Nogo-A陽性表達吸光度值測定。

1.6統(tǒng)計學方法

計量資料采用均數(shù)加減標準差〔s〕表示。所有資料進展正態(tài)性檢驗。符合正態(tài)分布者，多組計量資料采用單因素方差分析，方差齊者用LSD法和SNK法，方差不齊者用Tambane"sT2或Dunnett"sT3法。不符合正態(tài)分布者，采用多個獨立樣本比擬的秩和檢驗。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進展分析，結果以P0.05〕,說明模型成功復制，治療前組間具有可比性；〔3〕組內比擬：與2h比，心經(jīng)組在24h、48h、72h神經(jīng)功能缺損評清楚顯降低，差異有統(tǒng)計學意義，心經(jīng)組神經(jīng)功能缺損評清楚顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義〔P0.05〕;〔4〕組間比擬：與模型組各時相點比，心經(jīng)組在48h、72h神經(jīng)功能缺損評分有不同程度的下降〔P0.05〕；與肺經(jīng)組各時相點比，心經(jīng)組評分無統(tǒng)計學差異。提示電針心經(jīng)穴組可較好的改善大鼠神經(jīng)功能缺損的病癥，肺經(jīng)穴組未見明顯的改善。

2.2各組大鼠腦梗死體積的比擬

由表2可知，〔1〕各組大鼠全腦體積比擬無差異〔P>0.05〕，但模型組、肺經(jīng)穴組數(shù)值上相對偏大，可能與腦缺血后腦組織水胖有關系；〔2〕正常組、假手術組大鼠無腦梗死杜，說明手術本身不會引起腦缺血改變；〔3〕與正常組和假手術組比擬，模型組、心經(jīng)肺經(jīng)穴組腦梗死體積、梗死率明顯增大〔P0.05〕，提示三組作用相當，電針干預調節(jié)暫未能表達出經(jīng)脈的特異性。

2.3各組大鼠血清中Nogo-A表達的比擬

由圖一可知：空白組和假手術組Nogo-A的表達隨時間推移無明顯變化,模型組和假手術組組Nogo-A的表達開始升高至到達頂峰,然后明顯下降,但仍稍高于空白組。電針組各時間點Nogo-A的表達均低于模型組和假手術組,后兩組Nogo-A表達程度無明顯差異。

2.4各組大鼠腦梗死區(qū)中Nogo-A表達的比擬

由圖1可知：與正常組、假手術組比，模型組腦梗死區(qū)NGF陽性表達量均升高〔P0.05〕，說明假手術過程、造模過程及電針干預對腦梗死區(qū)Nogo-A的表達無明顯調節(jié)作用，可能與樣本量小或〔和〕Nogo-A在腦缺血急性期腦組織中的變化趨勢不穩(wěn)定有關。

3討論

腦缺血后患者的康復主要取決于中樞神經(jīng)系統(tǒng)修復，基于腦血管新生為構造根底的前提下[11-12]，多種神經(jīng)功能因子之間的互相作用決定神經(jīng)功能修復的好與壞。多種神經(jīng)功能因子中NGF作為一種重要因子調節(jié)神經(jīng)細胞生長，對神經(jīng)元的生長、發(fā)育、分化及再生和功能性表達都具有重要的調控作用；其次Nogo-A作為Nogo蛋白家族中一種，在CNS損傷后抑制軸突再生的才能最為強烈[13]。

大量文獻研究顯示[14-18]，針刺"內關";"足三里";"水溝";"百會";等穴，均可有效的增加內源性神經(jīng)生長因子的表達，從而改善大鼠腦缺血后突觸超微構造，促進神經(jīng)修復，改善肢體功能，到達抗腦缺血損傷的作用。同時研究[19-20]還顯示：電針治療可下調腦堵塞區(qū)神經(jīng)生長抑制因子Nogo-A的表達，誘導神經(jīng)軸突再生，減輕腦梗死后的神經(jīng)損害。

?內經(jīng)?中記載心主血脈，心主血脈是人體神志活動的物質根底，如?素問痿論?："心主身之血脈";，?素問六節(jié)?："諸血者皆屬于心";，故二者的關系是功能活動和物質根底的關系。

根據(jù)中醫(yī)理論，心具有主血脈的生理功能，而血液對人體四肢百骸、諸官彎均有霜養(yǎng)作用，腦亦需要血液的滿養(yǎng)。中醫(yī)學藏象學說，將腦的生理和病理統(tǒng)歸于心而分屬于五臟，認為心是"五臟六腑之大主[19]";，人體臟腑器官的功能活動，氣血津液的運行，以及臟腑之間的聯(lián)絡和協(xié)調，均須通過經(jīng)絡系統(tǒng)的運輸傳導、聯(lián)絡調節(jié)得以實現(xiàn)，并使之成為一個有機的整體[20]。心與腦的經(jīng)絡聯(lián)絡有：手少陰心經(jīng)經(jīng)目系入腦，其經(jīng)別也與手太陽小腸經(jīng)會于目內眥而入腦；心包絡為心之包膜，與心密不可分，而手厥陰心包經(jīng)絡于上、中、下三焦，人之頭部〔包括腦〕又歸屬上焦，這樣，又加強了心與腦的聯(lián)絡；?素問骨空論?云：督脈者，入絡腦上貫心";，通過督脈，加強了心與腦的聯(lián)絡；心與小腸相表里，而手太陽小腸經(jīng)的經(jīng)筋從目周入腦，這樣，腦與心又多一條聯(lián)絡途徑。以上為腦與心的直接聯(lián)絡。因此在心腦病癥的治療方面，臨床或從心而治，或從腦而治，或心腦同冶，均能獲得良好的療效?？梢姡呐c腦的關系是非常親密的。說明"心腦共主神明";實際上是以心主血脈為物質根底，聯(lián)絡心腦與絡脈-血管系統(tǒng)理念相一致的整體觀。

心經(jīng)作為心所屬經(jīng)脈，與心有著親密的聯(lián)絡。手少陰心經(jīng)起于心中，聯(lián)絡心系、肺、咽及目系，屬心絡小腸，淺出腋下，循行于上肢內側后緣，止于小指橈側端。其絡脈在腕關節(jié)后一寸處分出上行，沿本經(jīng)進入心中，向上聯(lián)絡舌相部，歸屬于眼與腦相連的系帶。其經(jīng)別分出后進入腋下兩筋之間，歸屬于心臟，向上走到喉呢，成出面部，與手太陽小腸經(jīng)會于目內眥。其經(jīng)筋起于手小指內側，結于碗豆骨處，向上結于肘內，交手太陰經(jīng)筋伏行于孔頭里，結于胸中，沿腦向下，聯(lián)絡于臍部。

〔1〕在生理上：手少陰心經(jīng)加強了心與人體體表、官竅及其他臟腑之間的聯(lián)絡，如?靈樞海論?曰："夫十二經(jīng)脈者，內屬于腑臟，外絡于肢節(jié)";。

〔2〕從病理上：手少陰心經(jīng)為病，就會表現(xiàn)為：咽喉枯燥，心口痛，口渴；前臂麻木酸痛等，如?靈樞經(jīng)脈?曰："益干，心痛，渴而欲飲，是為臂厥";。?靈樞本神?："心藏脈，脈舍神，心氣虛那么悲，實那么笑不休";。?靈樞五邪?："邪在心，那么病心痛，喜悲，時眩仆";。

〔3〕治療上：手少陰心經(jīng)可以治療與心相關疾病，如?素問刺熱?："心熱病者，先不樂，數(shù)日乃熱。熱爭那么卒心痛，煩悶善喉，頭痛、面赤無汗刺手少陰、太陽";，宋王惟一?新鑄銅人腧穴針灸圖經(jīng)?曰："靈道治心痛悲恐";。

心經(jīng)與腦關系也很親密。其經(jīng)絡經(jīng)目系入腦，其經(jīng)別也與手太陽小腸經(jīng)會于目內眥而入腦。正是基于此理論，歷代醫(yī)家在治療與腦相關疾病時，都會用到手少陰心經(jīng)的相關經(jīng)穴。如王惟一?新鑄銅人腧穴針灸圖經(jīng)?曰："少海治寒熱齒麟痛，目瞭發(fā)狂";?；矢χ?針灸曱乙經(jīng)卷七?曰："風陵頭痛，少海主之";。楊繼洲?針灸大成?："神門去心性之呆疾";。徐鳳?針灸大全?："心中驚悸，言語錯亂，取少海二穴，少府二穴，心命二穴";，心性呆疾，悲泣不已，取通里二穴，后溪二穴，神門二穴，大鐘二穴";。近代醫(yī)家根據(jù)以上理論，取手少陰心經(jīng)的相關經(jīng)穴治療與腦相關疾病如失眠、郁證、中風、癲癇、癡呆、腦萎、神經(jīng)衰弱等疾病，都有非常確切地療效。

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