發(fā)酵機(jī)制及發(fā)酵動力學(xué)

第三章發(fā)酵機(jī)制及發(fā)酵動力學(xué)1發(fā)酵機(jī)制是指微生物通過其代謝活動，利用基質(zhì)合成人們所需要的產(chǎn)物的內(nèi)在規(guī)律。由于微生物的種類、遺傳特性和環(huán)境條件不同，微生物所能積累的代謝產(chǎn)物不同，主要有微生物菌體、微生物酶和代謝產(chǎn)物。微生物代謝產(chǎn)物很多，主要有酒精、丙酮丁醇、有機(jī)酸、氨基酸、核苷酸類、蛋白質(zhì)、抗生素、維生素、脂肪、多糖類等。微生物具有極其精確的代謝控制系統(tǒng)，能確保細(xì)胞內(nèi)所有生化反應(yīng)有條不紊的進(jìn)行并制止中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的過量積累。必須人為改變微生物的代謝調(diào)控機(jī)制，使有用中間代謝產(chǎn)物過量積累，同時利用環(huán)境因素對代謝方向產(chǎn)生影響，這就是發(fā)酵機(jī)制的研究內(nèi)容。發(fā)酵動力學(xué)是研究發(fā)酵過程中菌體生長、基質(zhì)消耗、產(chǎn)物生成的動態(tài)平衡及其內(nèi)在規(guī)律。其研究內(nèi)容包括微生物生長過程中質(zhì)量和能量的平衡，發(fā)酵過程中菌體生長速率、基質(zhì)消耗速率和產(chǎn)物生成速率的相互關(guān)系。研究發(fā)酵動力學(xué)的目的在于設(shè)計(jì)和優(yōu)化發(fā)酵動力學(xué)模型，并以此為依據(jù)，利用計(jì)算機(jī)來設(shè)計(jì)程序，模擬最適合的工藝流程和發(fā)酵工藝參數(shù)，從而使生產(chǎn)控制達(dá)到最優(yōu)化。2本章主要內(nèi)容第一節(jié)發(fā)酵工業(yè)微生物的基本代謝情況第二節(jié)微生物代謝調(diào)控機(jī)制第三節(jié)重要發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵機(jī)制第四節(jié)微生物發(fā)酵動力學(xué)3第一節(jié)發(fā)酵工業(yè)微生物的基本代謝和調(diào)控機(jī)制一、發(fā)酵工程微生物的基本代謝及產(chǎn)物（一）微生物初級代謝及產(chǎn)物初級代謝是指微生物從外界吸收各種營養(yǎng)物質(zhì)，通過分解代謝和合成代謝，生成維持生命活動所需要的物質(zhì)和能量的過程。初級代謝產(chǎn)物：由初級代謝過程所產(chǎn)生的產(chǎn)物，如糖、氨基酸、脂肪酸、核苷酸以及由這些化合物聚合而成的高分子化合物（如多糖、蛋白質(zhì)、酯類和核酸等）。4（二）微生物的次級代謝及產(chǎn)物次級代謝是指微生物在一定的生長時期，以初級代謝產(chǎn)物為前體物質(zhì)，合成一些對微生物的生命活動無明確功能的物質(zhì)的過程。這一過程的產(chǎn)物，即為次級代謝產(chǎn)物。次級代謝產(chǎn)物大多是一類分子結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的化合物，包括：抗生素、毒素、激素、色素等?？股兀菏怯晌⑸铮ò?xì)菌、真菌、放線菌屬）或高等動植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類次級代謝產(chǎn)物。抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成，破壞細(xì)胞質(zhì)膜，作用于呼吸鏈以干擾氧化磷酸化，抑制蛋白質(zhì)和核酸合成等方式抑制微生物生長。毒素：細(xì)菌毒素和真菌毒素。細(xì)菌毒素又分為內(nèi)毒素和外毒素。激素：微生物能產(chǎn)生刺激動物生長或性器官發(fā)育的激素類物質(zhì)，稱激素，如赤霉素、生長素等。5本章主要內(nèi)容第一節(jié)發(fā)酵工業(yè)微生物的基本代謝情況第二節(jié)微生物代謝調(diào)控機(jī)制第三節(jié)重要發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵機(jī)制第四節(jié)微生物發(fā)酵動力學(xué)6微生物有著一整套可塑性極強(qiáng)和極精確的代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)，以保證上千種酶能正確無誤、有條不紊地進(jìn)行極其復(fù)雜的新陳代謝反應(yīng)。微生物細(xì)胞的代謝調(diào)節(jié)方式很多，例如可調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)透過細(xì)胞膜而進(jìn)入細(xì)胞的能力，通過酶的定位以限制它與相應(yīng)底物的接近，以及調(diào)節(jié)代謝流等。其中以調(diào)節(jié)代謝流的方式最為重要，它包括兩個方面，一是“粗調(diào)”，即調(diào)節(jié)酶的合成量，二是“細(xì)調(diào)”，即調(diào)節(jié)現(xiàn)成酶分子的催化活力，兩者往往密切配合和協(xié)調(diào)，以達(dá)到最佳調(diào)節(jié)效果。利用微生物代謝調(diào)控能力的自然缺損或通過人為方法獲得突破代謝調(diào)控的變異菌株，可為發(fā)酵工業(yè)提供生產(chǎn)有關(guān)代謝產(chǎn)物的高產(chǎn)菌株。有關(guān)的實(shí)際例子將在本節(jié)后部分進(jìn)行介紹。7一、酶活性的調(diào)節(jié)

酶活性的調(diào)節(jié)是指通過對已存在的酶的活性的改變，影響代謝速率。這是一種快速調(diào)節(jié)，依靠酶分子結(jié)構(gòu)的改變而實(shí)現(xiàn)，主要方式有反饋抑制和酶的共價修飾兩種，包括酶活性的激活和抑制兩個方面。1、酶活性的激活最常見的酶活性的激活是前體激活，它常見于分解代謝途徑，即代謝途徑中后面的反應(yīng)可以被該途徑較前面的而一個產(chǎn)物所促進(jìn)。2、酶活性的抑制酶活性的抑制主要是反饋抑制。反饋抑制是指合成途徑的末端產(chǎn)物（即終產(chǎn)物）過量時，這個產(chǎn)物對該途徑前段的某一個酶活性的抑制現(xiàn)象。通常抑制的是反應(yīng)途徑的第一個酶（第一步反應(yīng)往往是限速步驟）。81）直線代謝途徑中的反饋抑制這是一種最簡單的反饋抑制類型，過量的終產(chǎn)物抑制途徑的第一個酶，就能很好的控制整個反應(yīng)過程。9（1）同工酶調(diào)節(jié)：其特點(diǎn)是在分支途徑中第一個酶有幾種結(jié)構(gòu)不同的一組同工酶，每一分支代謝產(chǎn)生的終產(chǎn)物只對一種同工酶具有反饋抑制作用，只有當(dāng)幾種種產(chǎn)物同時過量時，才能完全阻止反應(yīng)的進(jìn)行。2）分支代謝途徑中的反饋抑制在有兩種或兩種以上的末端產(chǎn)物的分支代謝途徑中，為避免在一個分支上的產(chǎn)物過多，影響另一分支上產(chǎn)物的供應(yīng)，微生物有下列多種調(diào)節(jié)方式：10（2）協(xié)同反饋抑制：在分支代謝途徑中，幾種末端產(chǎn)物同時都過量時，才對途徑中的第一個酶具有抑制作用，若某一末端產(chǎn)物單獨(dú)過量則對途徑的第一個酶無抑制作用。（3）累積反饋抑制：在分支代謝途徑中，任何一種末端產(chǎn)物過量時都能對共同途徑中第一個酶起抑制作用，而且各種末端產(chǎn)物的抑制作用互不干擾。當(dāng)各種末端產(chǎn)物同時過量時，它們的抑制作用是累加的。11（4）順序反饋抑制：分支代謝途徑中的兩個末端產(chǎn)物，不能直接抑制代謝途徑中的第一個酶，而是分別抑制分支點(diǎn)后的反應(yīng)步驟，造成分支點(diǎn)上中間產(chǎn)物的積累，這種高濃度的中間產(chǎn)物再反饋抑制第一個酶的活性，因此，只有當(dāng)兩個末端產(chǎn)物都過量時，才能對途徑中的第一個酶起到抑制作用。12二、酶合成的調(diào)節(jié)酶合成的調(diào)節(jié)是指酶在數(shù)量上和種類上的調(diào)節(jié)。這是一種緩慢調(diào)節(jié)，通過改變酶分子合成的速度實(shí)現(xiàn)代謝途徑的變化。這種調(diào)節(jié)共有兩種方式：一種是指酶生成的誘導(dǎo)，是指促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)酶的合成；另一種是代謝產(chǎn)物對酶生成的阻遏，是指細(xì)胞內(nèi)酶的合成停止，包括分解代謝降解物阻遏和合成代謝終產(chǎn)物的反饋?zhàn)瓒簟?、誘導(dǎo)

根據(jù)酶的生成是否與環(huán)境中所存在的該酶底物或其有關(guān)物的關(guān)系，可把酶劃分成組成酶和誘導(dǎo)酶兩類。

組成酶，如EMP途徑的有關(guān)酶類。

誘導(dǎo)酶則是細(xì)胞為適應(yīng)外來底物或其結(jié)構(gòu)類似物而臨時合成的一類酶，例如E．coli在含乳糖培養(yǎng)基中所產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶和半乳糖苷滲透酶等。能促進(jìn)誘導(dǎo)酶產(chǎn)生的物質(zhì)稱為誘導(dǎo)物。又可分為同時誘導(dǎo)和順序誘導(dǎo)。13藍(lán)白斑篩選原理野生型大腸桿菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可以將無色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-靛藍(lán)。有色物質(zhì)可以使整個培養(yǎng)菌落產(chǎn)生顏色變化，而顏色變化是鑒定和篩選的最直觀有效的方法。藍(lán)白斑篩選的宿主菌：為β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。這種宿主菌的染色體基因組中編碼β-半乳糖苷酶的基因突變，造成其編碼的β-半乳糖苷酶失去正常N段一個146個氨基酸的短肽（即α肽鏈），從而不具有生物活性，即無法作用于X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。14藍(lán)白斑篩選的載體：具有一段稱為lacz'的基因，lacz'中包括：一段β-半乳糖苷酶的啟動子；編碼α肽鏈的區(qū)段；一個多克隆位點(diǎn)(MCS)。MCS位于編碼α肽鏈的區(qū)段中，是外源DNA的選擇性插入位點(diǎn)，但其本身不影響載體編碼α肽鏈的功能活性。15雖然上述缺陷株基因組無法單獨(dú)編碼有活性的β-半乳糖苷酶，但當(dāng)菌體中含有帶lacz'的質(zhì)粒后，質(zhì)粒lacz'基因編碼的α肽鏈和菌株基因組表達(dá)的Ｎ端缺陷的β-半乳糖苷酶突變體互補(bǔ)，具有與完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成藍(lán)色物質(zhì)的能力，這種現(xiàn)象即α-互補(bǔ)。操作中，添加IPTG(異丙基硫代-β-Ｄ-半乳糖苷)以激活lacz'中的β-半乳糖苷酶的啟動子，在含有X-gal的固體平板培養(yǎng)基中菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。插入失活：當(dāng)外源DNA（即目的片斷）與含lacz'的載體連接時，會插入進(jìn)MCS，使α肽鏈讀碼框破壞，這種重組質(zhì)粒不再表達(dá)α肽鏈，將它導(dǎo)入宿主缺陷菌株則無α互補(bǔ)作用，不產(chǎn)生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培養(yǎng)基中的X-gal產(chǎn)生藍(lán)色，培養(yǎng)表型即呈現(xiàn)白色菌落。162、阻遏

在微生物的代謝過程中，當(dāng)代謝途徑中某末端產(chǎn)物過量時，除可用前述的反饋抑制的方式，還可通過阻遏作用來阻礙代謝途徑中包括關(guān)鍵酶在內(nèi)的一系列酶的生物合成，從而更徹底地控制代謝和減少末端產(chǎn)物的合成。阻遏的類型主要有末端代謝產(chǎn)物阻遏和分解代謝產(chǎn)物阻遏兩種。（1）末端產(chǎn)物阻遏（end-productrepression）指由某代謝途徑末端產(chǎn)物的過量累積而引起的阻遏。

直線式反應(yīng)途徑：即產(chǎn)物作用于代謝途徑中的各種酶，使之合成受阻遏，例如精氨酸的生物合成途徑（圖6-59）。

分支代謝途徑：每種末端產(chǎn)物僅專一地阻遏合成它的那條分支途徑的酶。代謝途徑分支點(diǎn)以前的“公共酶”僅受所有分支途徑末端產(chǎn)物的阻遏，此即稱多價阻遏作用。也就是說，任何單獨(dú)一種末端產(chǎn)物的存在，都沒有影響，只有當(dāng)所有末端產(chǎn)物都同時存在時，才能發(fā)揮出阻遏功能。17（2）分解代謝物阻遏指細(xì)胞內(nèi)同時有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時，利用快的那種分解底物會阻遏利用慢的底物的有關(guān)酶合成的現(xiàn)象?，F(xiàn)在知道，分解代謝物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的結(jié)果，而是通過甲碳源（或氮源等）在其分解過程中所產(chǎn)生的中間代謝物所引起的阻遏作用。因此，分解代謝物的阻遏作用，就是指代謝反應(yīng)鏈中，某些中間代謝物或末端代謝物的過量累積而阻遏代謝途徑中一些酶合成的現(xiàn)象。

例如，有人將E．coli培養(yǎng)在含乳糖和葡萄糖的培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)該菌可優(yōu)先利用葡萄糖，并于葡萄糖耗盡后才開始利用乳糖，這就產(chǎn)生了在兩個對數(shù)生長期中間隔開一個生長延滯期的“二次生長現(xiàn)象”。培養(yǎng)物濁度培養(yǎng)時間a葡萄糖耗盡bβ-半乳糖苷酶誘導(dǎo)大腸桿菌的“二次生長”現(xiàn)象培養(yǎng)物濁度培養(yǎng)時間a葡萄糖耗盡bβ-半乳糖苷酶誘導(dǎo)大腸桿菌的“二次生長”現(xiàn)象18三、微生物發(fā)酵中的代謝調(diào)控這里將討論如何控制微生物的正常代謝調(diào)節(jié)機(jī)制，使其累積更多為人們所需要的有用代謝產(chǎn)物。包括三個方面：（一）應(yīng)用營養(yǎng)缺陷型菌株以解除正常的反饋調(diào)節(jié)（二）應(yīng)用抗反饋調(diào)節(jié)的突變株解除反饋調(diào)節(jié)（三）控制細(xì)胞膜的滲透性19（一）應(yīng)用營養(yǎng)缺陷型菌株以解除正常的反饋調(diào)節(jié)在分支代謝途徑中，通過解除某種反饋調(diào)節(jié)，就可以使某一分支途徑的末端產(chǎn)物得到累積。

舉例1：賴氨酸發(fā)酵工業(yè)上選育了Corynebacteriumglutamicum（谷氨酸棒桿菌）的高絲氨酸缺陷型菌株作為賴氨酸的發(fā)酵菌種。這個菌種不能合成高絲氨酸脫氫酶（HSDH）。20舉例2：肌苷酸（IMP）的生產(chǎn)21（二）應(yīng)用抗反饋調(diào)節(jié)的突變株解除反饋調(diào)節(jié)抗反饋調(diào)節(jié)突變菌株，就是指一種對反饋抑制不敏感或?qū)ψ瓒粲锌剐缘慕M成型菌株，或兼而有之的菌株。在這類菌株中，因其反饋抑制或阻遏已解除，或是反饋抑制和阻遏已同時解除，所以能分泌大量的末端代謝產(chǎn)物。22（三）控制細(xì)胞膜的滲透性細(xì)胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物常常以很高的濃度累積著，并自然地通過反饋?zhàn)瓒粝拗屏怂鼈兊倪M(jìn)一步合成。采取生理學(xué)或遺傳學(xué)方法，可以改變細(xì)胞膜的透性，使細(xì)胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物迅速滲漏到細(xì)胞外。1．通過生理學(xué)手段控制細(xì)胞膜的滲透性232．通過細(xì)胞膜缺損突變而控制其滲透性應(yīng)用谷氨酸產(chǎn)生菌的油酸缺陷型菌株，在限量添加油酸的培養(yǎng)基中，也能因細(xì)胞膜發(fā)生滲漏而提高谷氨酸的產(chǎn)量。利用石油發(fā)酵產(chǎn)生谷氨酸的解烴棒桿菌的甘油缺陷型突變株，由于缺乏a-磷酸甘油脫氫酶，故無法合成甘油和磷脂。24本章主要內(nèi)容第一節(jié)發(fā)酵工業(yè)微生物的基本代謝情況第二節(jié)微生物代謝調(diào)控機(jī)制第三節(jié)重要發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵機(jī)制（一）糖代謝產(chǎn)物的發(fā)酵機(jī)制（二）氨基酸和核酸發(fā)酵機(jī)制（三）抗生素發(fā)酵機(jī)制第四節(jié)微生物發(fā)酵動力學(xué)25一、糖代謝產(chǎn)物的發(fā)酵機(jī)制（一）乙醇發(fā)酵（厭氧發(fā)酵代謝產(chǎn)物）1、以EMP途徑為基礎(chǔ)的酵母乙醇發(fā)酵酵母的乙醇發(fā)酵和酒精、白酒、葡萄酒、啤酒等各種酒類生產(chǎn)關(guān)系密切。丙酮酸脫羧酶是酵母菌乙醇發(fā)酵的關(guān)鍵酶。總反應(yīng)式為：葡萄糖+2ADP+2Pi→2乙醇+2CO2+2ATP26酵母乙醇發(fā)酵過程的三種形式Ⅰ型發(fā)酵：正常的乙醇發(fā)酵在弱酸性條件下進(jìn)行，產(chǎn)生2分子的乙醇和2分子CO2。這又稱為酵母的“同型酒精發(fā)酵”。Ⅱ型發(fā)酵：在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量NaHSO3，則乙醇發(fā)酵轉(zhuǎn)變?yōu)楦视桶l(fā)酵，形成大量甘油和少量乙醇。其機(jī)理：NaHSO3與乙醛形成復(fù)合物，封閉了乙醛，由磷酸二羥丙酮代替乙醛作為受氫體，形成α-磷酸甘油，在α-磷酸甘油酯酶的催化下脫去磷酸，形成甘油。Ⅲ型發(fā)酵：將發(fā)酵液pH值控制在弱堿性（pH7.6），酵母的乙醇發(fā)酵轉(zhuǎn)向甘油發(fā)酵，主產(chǎn)物為甘油，伴隨產(chǎn)生少量乙醇、乙酸和CO2。272、細(xì)菌的“同型酒精發(fā)酵”：由Zymomonasmobilis（運(yùn)動發(fā)酵單胞菌）等通過ED途徑進(jìn)行。葡萄糖+ADP+Pi→2乙醇+2CO2+ATP3、細(xì)菌的“異型酒精發(fā)酵”：由Leuconostocmesenteroides（腸膜狀明串珠菌）等通過HMP途徑進(jìn)行。葡萄糖+ADP+Pi→乳酸+乙醇+CO2+ATP此外，由于這三類酒精發(fā)酵所經(jīng)過的途徑是不同的，所以在發(fā)酵產(chǎn)物——乙醇分子上的碳原子來源也是不同的。如果將葡萄糖分子的不同碳原子進(jìn)行14C標(biāo)記，并測定14C在產(chǎn)物中的分布，則上述三條途徑的差別可從圖6-27中看到。28（二）乳酸發(fā)酵

乳酸發(fā)酵指某些細(xì)菌在厭氧條件下利用葡萄糖生產(chǎn)乳酸及少量其他產(chǎn)物的過程。能進(jìn)行乳酸發(fā)酵的細(xì)菌被稱為乳酸菌。乳酸菌雖多是一些兼性厭氧菌，但乳酸發(fā)酵卻是在嚴(yán)格厭氧條件下完成的。

1、同型乳酸發(fā)酵同型乳酸發(fā)酵的過程是：葡萄糖經(jīng)EMP途徑降解為丙酮酸，丙酮酸在乳酸脫氫酶的作用下被NADH還原為乳酸。由于終產(chǎn)物只有乳酸一種，故稱為同型乳酸發(fā)酵。

C6H12O6＋2ADP→2CH3CHOHCOOH＋2ATP

德氏乳桿菌屬（Lac.delbriickii）、乳酸鏈球菌屬（StreptococcusLactis）、酪乳桿菌屬（LactobacillusCasei）、保加利亞乳桿菌（Lac.bulgaricus）等。

2、異型乳酸發(fā)酵在腸膜明串珠菌(LeuconostocMesenteroides)中，利用HMP途徑分解葡萄糖，產(chǎn)生甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸，其中甘油醛-3-磷酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乳酸，乙酰磷酸經(jīng)兩次還原變?yōu)橐掖迹浑p歧桿菌經(jīng)PK途徑發(fā)酵葡萄糖形成的產(chǎn)物除乳酸外還有乙醇和乙酸。29

同型乳酸發(fā)酵

30

總反應(yīng)式為:

理論轉(zhuǎn)化率:

:31

異型乳酸發(fā)酵

A.6-磷酸葡萄糖酸途徑

32總反應(yīng)式為:

C6H12O6→CH3CHOHCOOH+CH3CH2OH

理論轉(zhuǎn)化率:

(90/180)×100%=50%

33三檸檬酸發(fā)酵機(jī)制（好氧發(fā)酵代謝產(chǎn)物）

檸檬酸發(fā)酵屬于好氧發(fā)酵，其發(fā)酵機(jī)制是在了解了三羧酸循環(huán)的基礎(chǔ)上才逐漸弄清楚的。341.檸檬酸生物合成途徑

35葡萄糖生成檸檬酸的總反應(yīng)式為:

2C6H12O6+3O22C6H8O7+4H2O

理論轉(zhuǎn)化率為106.7%

2.檸檬酸生物合成的代謝調(diào)節(jié)

(1).糖酵解及丙酮酸代謝的調(diào)節(jié)

磷酸果糖激酶(PFK)是調(diào)節(jié)酶,檸檬酸和ATP對該酶抑制,AMP、Pi和NH4+對酶激活;

NH4+在細(xì)胞內(nèi)濃度升高,解除胞內(nèi)積累的大量檸檬酸對酶的抑制;

3637

檸檬酸合成有關(guān)酶的調(diào)節(jié)性質(zhì)

酶

激活劑

抑制劑磷酸果糖激酶NH4+、AMP、Pi檸檬酸、PEP、ATP(濃度較高時)丙酮酸激酶NH4+、K+丙酮酸羧化酶K+天冬氨酸、Pi檸檬酸合成酶NH4+、K+CoA、ATP-Mg異檸檬酸脫氫酶檸檬酸、NADPH、-酮戊二酸琥珀酸脫氫酶草酰乙酸383940結(jié)論:

Mn2+缺乏使蛋白質(zhì)和核酸合成受阻,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NH4+水平升高而減少檸檬酸對PFK的抑制，促進(jìn)了EMP途徑的暢通。

41(2).CO2固定化反應(yīng)

丙酮酸+CO2+ATP丙酮酸羧化酶草酰乙酸+ADP+Pi①

磷酸烯醇丙酮酸+CO2+ADP+Pi磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶

草酰乙酸+

ATP②

結(jié)論1:

在組成型的丙酮酸羧化酶作用下,丙酮酸固定化CO2生成草酰乙酸,保證檸檬酸的積累。

結(jié)論2:

丙酮酸氧化脫羧生成乙酰CoA,和CO2固定兩個反應(yīng)平衡,保持了檸檬酸合成能力。42

(3).三羧酸循環(huán)的調(diào)節(jié)

結(jié)論:

在三羧酸循環(huán)的發(fā)酵過程中,阻斷順烏頭酸酶水合酶和異檸檬酸脫氫酶的催化反應(yīng),建立一種平衡關(guān)系，大量積累檸檬酸:

檸檬酸：順烏頭酸：異檸檬酸=90：3：7

A.絡(luò)合劑(亞鐵氰化鉀)除去Fe2+,順烏頭酸水合酶的活性被抑制。

B.檸檬酸的積累使pH值下降,在低pH值下,順烏頭酸水合酶和異檸檬酸脫氫酶失活,更有利于檸檬酸的積累并排出體外。

43二、氨基酸發(fā)酵機(jī)制

(一)、氨基酸發(fā)酵的機(jī)制和代謝控制

1、氨基酸發(fā)酵機(jī)制主要包括：谷氨酸族(谷、瓜、鳥、精氨酸等)、天冬氨酸族(賴、蘇、蛋等)、芳香族(苯丙、酪、色氨酸等)、分枝鏈(亮、異亮、纈氨酸等)。

2、氨基酸發(fā)酵代謝控制的一般措施：

A、控制發(fā)酵的環(huán)境條件；B、控制細(xì)胞滲透性；

C、控制旁路代謝；D、消除終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)作用

E、降低反饋?zhàn)饔梦锏臐舛龋籉、促進(jìn)ATP的積累

(二)、谷氨酸發(fā)酵機(jī)制

1.谷氨酸生物合成途徑：

EMP途徑、HMP途徑、TCA循環(huán)、DCA循環(huán)、CO2固定作用4445462.谷氨酸生物合成途徑的控制

(1).三羧酸循環(huán)的調(diào)節(jié)

通過馴育谷氨酸高產(chǎn)菌控制三羧酸循環(huán)下列酶的活性:

A.α-酮戊二酸脫氫酶應(yīng)喪失或僅有微弱的活力。

B.CO2固定反應(yīng)的酶系強(qiáng),使四碳二羧酸全部是由CO2固定

反應(yīng)提供,而不走乙醛酸循環(huán),以提高對糖的利用率。

C.谷氨酸脫氫酶的活力很強(qiáng),并喪失谷氨酸對谷氨酸脫

氫酶的反饋抑制和反饋?zhàn)瓒簟?/p>

47(2).氨的導(dǎo)入和控制

氨的導(dǎo)入主要方式:糖代謝中間體還原氨基化;天冬氨酸或丙氨酸通過氨基轉(zhuǎn)移；谷氨酸合成酶途徑。

谷氨酸發(fā)酵受NH4+的影響。使用生物素缺乏菌,在NH4+存在時,葡萄糖以很快的消耗速度和高的收率生成谷氨酸;

當(dāng)NH4+不存在時,糖的消耗速度很慢,生成物是α-酮戊二酸、丙酮酸、醋酸和琥珀酸。

48

NADP為輔酶的異檸檬酸脫氫酶和NADPH+H+為輔酶的

谷氨酸脫氫酶形成共軛反應(yīng),NADP濃度是實(shí)際上的

限速因子,添加氧化還原電位與NADP相似的氧化還

原染料,并通以電流可促進(jìn)還原氨基化作用,增加谷

氨酸產(chǎn)量。

49(3).控制細(xì)胞滲透性

A、控制生物素、油酸濃度或添加表面活性劑如吐溫80、陽離子表面活性劑。引起細(xì)胞膜的脂肪酸成分的改變,尤其是改變油酸含量,從而改變細(xì)胞膜通透性；

B、加入青霉素或控制Mn+、Zn+濃度。抑制細(xì)胞壁的合成,由于細(xì)胞膜失去細(xì)胞壁的保護(hù),細(xì)胞膜受到物理損傷,從而使?jié)B透性增強(qiáng)。

C、生產(chǎn)中菌種選育模型與控制方法:生物素缺陷型;油酸缺陷型;甘油缺陷型等。

50

(4).控制發(fā)酵的工藝條件

谷氨酸發(fā)酵是人工控制發(fā)酵條件成功進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)的典型例子。

主要的影響因子有：溶解氧、NH4+、pH、磷酸生物素、醇類和NH4Cl。

51三、抗生素發(fā)酵機(jī)制

1、抗生素的生物合成類型

A.蛋白質(zhì)衍生物

簡單的氨基酸衍生物：環(huán)絲氨酸、重氮絲氨酸等；

寡肽抗生素：青霉素、頭孢菌素等；

多肽類抗生素：多粘菌素、桿菌肽等；

多肽大環(huán)內(nèi)脂抗生素：放線菌素等；

含嘌呤和嘧啶堿基的抗生素：曲古霉素、嘌呤霉素等

522、青霉素、頭孢菌素的生物合成機(jī)制

青霉素、頭孢菌素的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：53543、鏈霉素的生物合成機(jī)制

鏈霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：555657

4、抗生素生物合成的代謝調(diào)節(jié)方式

(1)、細(xì)胞生長期到抗生素產(chǎn)生期的過渡

次級代謝產(chǎn)物是在菌體生長到達(dá)相對靜止期才產(chǎn)生。在細(xì)胞生長階段,負(fù)責(zé)次級代謝產(chǎn)物合成的酶受到阻遏。

A.誘導(dǎo)因子在生長期末積累或從外源加入;

B.初級代謝的終點(diǎn)產(chǎn)物耗盡;

C.易被利用的糖源分解代謝物被利用后,便解除了阻遏作用;

D.高能化合物ATP形成減少后，阻遏作用也就解除;

E.在生長期，RNA聚合酶只能啟動生長期基因的轉(zhuǎn)錄作用；當(dāng)生長停

止后,酶的結(jié)構(gòu)改變,允許RNA聚合酶啟動生產(chǎn)期基因的轉(zhuǎn)錄作用,

負(fù)責(zé)抗生素合成的酶開始生成。

58(2)酶的誘導(dǎo)作用

在抗生素合成期,參與次級代謝的有些酶是誘導(dǎo)酶。

需要底物或底物的結(jié)構(gòu)類似物(外源和內(nèi)源誘導(dǎo)劑)。

59

(3)分解代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)控制

碳、氮分解代謝產(chǎn)物(如葡萄糖)阻遏和抑制作用,抑制抗生素合成。解除分解產(chǎn)物阻遏的方法:

A.選育對葡萄糖代謝產(chǎn)物類似物抗性突變型;

B.培養(yǎng)過程中利用緩慢的碳源,連續(xù)流加葡萄糖;

C.使用含有慢慢向培養(yǎng)基內(nèi)滲透營養(yǎng)物質(zhì)的顆粒。

6061（4）磷酸鹽的調(diào)節(jié)

抗生素只有在磷酸鹽含量控制在生長的“亞適量”時才能合成。

磷酸鹽抑制抗生素合成的機(jī)制可能有以下二方面：

A.抑制或阻遏抗生素生物合成途徑中有關(guān)酶的活力和合成。

B.改變代謝途徑。

C.磷酸鹽可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ATP的形成。

62(5)次級代謝產(chǎn)物的自身反饋調(diào)節(jié)

在多種次級代謝產(chǎn)物的發(fā)酵中都發(fā)現(xiàn)了末端產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)作用。

產(chǎn)生菌抗生素的生產(chǎn)能力與自身抑制所需抗生素濃度呈正相關(guān)性。因此要選育生產(chǎn)能力強(qiáng)的抗反饋調(diào)節(jié)的突變菌株。63(6)初級代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)

某些初級代謝產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)次級代謝產(chǎn)物的合成的原因:

A.有一條共同的合成途徑,當(dāng)初級代謝產(chǎn)物積累時,反饋抑制了某一步反應(yīng)的進(jìn)行,而最終抑制了次級代謝產(chǎn)物的合成。

B.初級代謝產(chǎn)物直接參與次級代謝產(chǎn)物的生物合成,反饋抑制了它自身的合成時,必然也同時影響了次級代謝產(chǎn)物的合成。

6465(7)細(xì)胞膜透性的調(diào)節(jié)

細(xì)胞膜的運(yùn)輸影響胞內(nèi)合成及代謝物分泌和發(fā)酵產(chǎn)物收獲。

在青霉素發(fā)酵中,生產(chǎn)菌細(xì)胞膜輸入硫化物能力的大小影響青霉素發(fā)酵單位的高低。

66(8)次級代謝的能荷調(diào)節(jié)

A.能荷調(diào)節(jié)機(jī)制對次級代謝途徑的控制是有效的。

B.金霉菌菌株的ATP含量在生長期中迅速增加,而在金霉素形成期ATP含量迅速下降,并保持在較低的水平上。低產(chǎn)菌株的ATP量始終比高產(chǎn)茵株大2—4倍。

C.高濃度的磷酸鹽可增加細(xì)胞內(nèi)ATP的形成。

67第四節(jié)微生物發(fā)酵的動力學(xué)分批發(fā)酵動力學(xué)補(bǔ)料分批發(fā)酵動力學(xué)連續(xù)發(fā)酵動力學(xué)68一、分批發(fā)酵動力學(xué)分批培養(yǎng)的不同階段微生物分批培養(yǎng)的生長動力學(xué)方程分批培養(yǎng)時基質(zhì)的消耗速率分批培養(yǎng)中產(chǎn)物的生成速率分批培養(yǎng)過程的生產(chǎn)率691、分批培養(yǎng)的不同階段分批發(fā)酵隨著微生物生長和繁殖，細(xì)胞量、底物、代謝產(chǎn)物的濃度等均不斷發(fā)生變化，微生物的生長可以分為四個階段：延滯期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期。702、微生物分批培養(yǎng)的生長動力學(xué)方程分批培養(yǎng)發(fā)酵過程中，雖然培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)隨時間的變化而變化，但是通常在特定條件下，其比生長速率往往是恒定的。Monod方程71Monod方程特定溫度、pH值、營養(yǎng)物類型、營養(yǎng)物濃度等條件下，微生物細(xì)胞的比生長速率與限制性營養(yǎng)物的濃度之間存在如右關(guān)系式。μ——比生產(chǎn)率，1/hμm——最大比生產(chǎn)率1/hKs——飽和常數(shù)，g/LS——生長限制基質(zhì)濃度，g/LMonod方程式適用于條件：

適用于單一基質(zhì)限制及不存在抑制性物質(zhì)的情況，其他營養(yǎng)是過量的，且沒有抑制物的生成。72Monod方程Ks代表當(dāng)比生長速度為最大比生長速度一半時限制性營養(yǎng)物質(zhì)的濃度。Ks越大，表示微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收親和力越小，反之越大。一般微生物的Ks值都較小。比生長速率與基質(zhì)濃度的關(guān)系73例：乙醇為唯一碳源進(jìn)行面包酵母培養(yǎng)，獲得如下數(shù)據(jù)：S(g/L)0.400.330.180.100.0710.0490.0380.0200.014μ(h-1)0.1610.1690.1690.1490.1330.1350.1120.09090.0735求μmax和KS。解：莫諾方程可變形為計(jì)算S/μ，繪制曲線。74S(g/L)0.400.330.180.100.0710.0490.0380.0200.014μ(h-1)0.1610.1690.1690.1490.1330.1350.1120.09090.0735S/μ(gh/L)2.481.951.070.670.530.360.340.220.1975由圖中可知：直線截距=0.095,斜率為=5.7865,76微生物底物