HIV抗體檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)介 深圳市疾病預(yù)防控制中心艾滋病防治科 王曉輝 2008

HIV抗體檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)介

深圳市疾病預(yù)防控制中心艾滋病防治科

王曉輝

2021年4月29日1HIV1+2抗體檢測(cè)依據(jù)衛(wèi)生部?關(guān)于頒發(fā)〈全國(guó)艾滋病檢測(cè)工作標(biāo)準(zhǔn)〉的通知?〔衛(wèi)疾控發(fā)[1998]第28號(hào)〕2HIV抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室種類(lèi)和分級(jí)1.種類(lèi)：確證實(shí)驗(yàn)室：抗體確證中心、確證實(shí)驗(yàn)室初篩實(shí)驗(yàn)室：初篩中心和初篩實(shí)驗(yàn)室。分級(jí)：省級(jí)HIV抗體確證中心，在市、縣區(qū)衛(wèi)生防疫站或有關(guān)系統(tǒng)中設(shè)立HIV抗體確證、初篩中心和初篩實(shí)驗(yàn)室。3HIV抗體初篩實(shí)驗(yàn)室任務(wù)作HIV抗體初篩檢測(cè)，并提供檢測(cè)前、后的咨詢(xún)效勞。及時(shí)將初檢陽(yáng)性的標(biāo)本送HIV抗體初篩中心實(shí)驗(yàn)室，再轉(zhuǎn)送確證實(shí)驗(yàn)室確證。作好初檢標(biāo)本登記、實(shí)驗(yàn)記錄，每月5日向當(dāng)?shù)氐腍IV抗體初篩中心實(shí)驗(yàn)室報(bào)告HIV抗體檢測(cè)情況。4HIV抗體確證實(shí)驗(yàn)室任務(wù)◆承擔(dān)衛(wèi)生部和省衛(wèi)生廳指定區(qū)域HIV抗體確證任務(wù)?！舫袚?dān)局部HIV抗體初篩任務(wù)?！艏皶r(shí)向省級(jí)HIV抗體確證中心和同級(jí)衛(wèi)生局報(bào)告確證的陽(yáng)性結(jié)果?！舭丛孪蚴IV抗體確證中心報(bào)告HIV抗體檢測(cè)工作情況。5HIV抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室必備條件◆人員條件：人數(shù)、職稱(chēng)、從事血清學(xué)檢驗(yàn)經(jīng)歷、培訓(xùn)、復(fù)訓(xùn)◆設(shè)備條件◆實(shí)驗(yàn)用房或檢測(cè)操作區(qū)間；◆儀器設(shè)備；◆使用高敏感度和特異度的初篩、確證試劑；◆要建立血清庫(kù)6HIV抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的審批和管理廣東省實(shí)行HIV抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室資格審批制度從事HIV抗體檢測(cè)工作人員必須要有上崗合格證未經(jīng)審批的實(shí)驗(yàn)室和人員不得開(kāi)展HIV抗體檢測(cè)工作7HIV抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的審評(píng)◆省衛(wèi)生廳成立廣東省HIV抗體檢測(cè)初篩實(shí)驗(yàn)室資格審評(píng)組◆審評(píng)組的職責(zé)：對(duì)申報(bào)HIV抗體檢測(cè)初篩實(shí)驗(yàn)室的單位進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)考核、技術(shù)論證和評(píng)價(jià)；對(duì)HIV抗體檢測(cè)初篩實(shí)驗(yàn)室的工作進(jìn)行技術(shù)指導(dǎo)和考核；為全省HIV抗體檢測(cè)工作和實(shí)驗(yàn)室建立及管理提供咨詢(xún)和建議◆審評(píng)組的常規(guī)組織工作委托廣東省HIV抗體檢測(cè)確證中心負(fù)責(zé)。8910艾滋病檢測(cè)方法一、HIV抗體檢測(cè)1.HIV抗體初篩檢測(cè):ELISA法、顆粒凝集法、免疫斑點(diǎn)法、放射免疫法2.HIV抗體確證檢測(cè):免疫印跡法〔WB〕、條帶免疫印跡法〔LIA〕、免疫熒光法〔IFA〕、放射免疫沉淀法〔RIPA〕。二、艾滋病的病原學(xué)診斷1.HIV抗原〔P24〕和逆轉(zhuǎn)錄酶〔RT〕檢測(cè)；2.病毒培養(yǎng);3.基因診斷:探針雜交、nt-PCR、HIVRNA定量〔RT-PCR、bDNA、NASBA〕11HIV抗體初篩檢測(cè)一、HIV抗體檢測(cè)要求:1.實(shí)驗(yàn)室:HIV抗體檢測(cè)初篩和確證實(shí)驗(yàn)室須分別經(jīng)省級(jí)衛(wèi)生行政部門(mén)和衛(wèi)生部考核、審評(píng)和批準(zhǔn)前方可從事艾滋病檢測(cè)工作:2.檢測(cè)場(chǎng)所：符合?全國(guó)艾滋病檢測(cè)工作標(biāo)準(zhǔn)?的要求；3.人員:經(jīng)國(guó)家或省級(jí)艾滋病抗體檢測(cè)學(xué)習(xí)班培訓(xùn);4.試劑:批批檢合格、進(jìn)口許可證、生物制品檢定所檢定、在有效期內(nèi)的HIV-1/2混合型試劑；5.保密:初篩檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果不是最終結(jié)果,必須經(jīng)確證試驗(yàn)由HIV抗體確證實(shí)驗(yàn)室出具陽(yáng)性報(bào)告才具有法律效應(yīng),且須由衛(wèi)生行政部門(mén)選擇適當(dāng)方式和時(shí)間通知其本人及其家屬,不得向無(wú)關(guān)人員透露有關(guān)情況,感染者檔案以機(jī)密形式專(zhuān)人負(fù)責(zé)管理;126.標(biāo)本運(yùn)送和保存:及時(shí)別離血清(漿)、無(wú)變質(zhì)、無(wú)污染、無(wú)溶血。7.天氣炎熱、路途較遠(yuǎn)時(shí)應(yīng)低溫用帶蓋不易破損容器專(zhuān)人運(yùn)送，8.并詳細(xì)填寫(xiě)送檢單；城區(qū)24小時(shí)、農(nóng)村48小時(shí)內(nèi)送確證實(shí)驗(yàn)室9.并及時(shí)報(bào)轄區(qū)衛(wèi)生防疫站。13HIV抗體檢測(cè)HIV感染后的“窗口期〞〔Windowperiod〕：指從HIV感染后到用現(xiàn)有方法能檢出HIV病原體〔HIV抗原或核酸〕和/或抗體前的這段時(shí)間。血清陽(yáng)轉(zhuǎn)〔Seroconversion〕：隨著感染的過(guò)程進(jìn)展，HIV抗體濃度或滴度隨之增多，血清HIV抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)之。個(gè)體差異、檢測(cè)方法的種類(lèi)和試劑的敏感性是影響“窗口期〞長(zhǎng)短主要因素。通常情況下，病毒別離培養(yǎng)和PCR法檢測(cè)HIVRNA的“窗口期〞約為7天左右；檢測(cè)P24抗原的“窗口期〞約為14-21天；檢測(cè)抗體的“窗口期〞約為31-60天。盡量縮短“窗口期〞，提高檢測(cè)方法的靈敏度對(duì)于HIV感染的早期診斷，特別是在獻(xiàn)血員的篩查，防止病毒傳播方面具有重要意義。目前許多試劑生產(chǎn)商已成功研制開(kāi)發(fā)出能同時(shí)檢出HIV抗原和抗體第四代診斷試劑，并開(kāi)始進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)和推廣應(yīng)用。14哪種情況下需要進(jìn)行HIV檢查1、有高危行為者：如不平安性行為、賣(mài)淫嫖娼、吸毒者；2、不平安受血或血制品使用史者，接受器官移植手術(shù)者；3、HIV感染者/AIDS病人密切接觸者及經(jīng)常接觸這類(lèi)患者的醫(yī)護(hù)人員或?qū)嶒?yàn)室工作人員；4、有以下臨床病癥或體癥者：〔1〕反復(fù)而持續(xù)性的低熱、腹瀉；〔2〕不明原因的體重下降；〔3〕浸潤(rùn)性宮頸癌〔年輕女性〕；〔4〕中青年出現(xiàn)嚴(yán)重皰疹病毒感染，且治療效果不佳；〔5〕局部或全身性念珠菌、真菌感染〔口腔、腸道、呼吸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外陰或陰道等〕、CMV感染等；〔6〕弓形體腦病、隱球菌性腦膜炎、年輕人不明原因失明、失憶、智力障礙等；〔7〕嚴(yán)重進(jìn)展迅速的結(jié)核桿菌感染；〔8〕反復(fù)發(fā)作的肺部炎癥、PCP等?！?〕皮膚癌、卡波氏肉瘤、淋巴瘤、嚴(yán)重毛囊炎等。15常用的HIV抗體初篩檢測(cè)方法一、顆粒凝集法原理：將可溶性HIV抗原吸附或偶聯(lián)至無(wú)關(guān)載體顆粒上，使之成為致敏載體顆粒，與待檢標(biāo)本中HIV抗體結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象。HIV抗原通常為完整病毒裂解產(chǎn)物、基因重組或合成多肽抗原成分，常用的無(wú)關(guān)載體為RH–O型人紅細(xì)胞和動(dòng)物〔綿羊、兔、雞等〕紅細(xì)胞、活性炭或硅酸鋁顆粒、聚丙乙烯乳膠顆粒、明膠顆粒等。16PA定性試驗(yàn)C對(duì)照顆粒S致敏顆粒M陰性顆粒17PA定量試驗(yàn)C對(duì)照顆粒S致敏顆粒M陰性顆粒1819顆粒凝集法的特點(diǎn)和適用范圍1.操作簡(jiǎn)便，快速，通常在1-2小時(shí)時(shí)間報(bào)告結(jié)果，適于大規(guī)模普查。2.整個(gè)實(shí)驗(yàn)在18-25℃室溫下完成，無(wú)需洗滌和任何儀器特別適合于基層衛(wèi)生單位、野外或緊急情況的HIV抗體檢測(cè)。3.價(jià)格低廉。4.特異性，敏感性較好。20快速試劑和PA的應(yīng)用偏遠(yuǎn)地區(qū)急診臨床〔高?！陈殬I(yè)暴露臨產(chǎn)21二、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

〔Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA〕簡(jiǎn)介：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)簡(jiǎn)稱(chēng)酶標(biāo)法，是根據(jù)酶免疫測(cè)定原理開(kāi)展的一種技術(shù)，目前已廣泛用于各種抗原和抗體的檢測(cè)，也是最常用的HIV抗體檢測(cè)方法。近年來(lái)隨著生物技術(shù)的不斷開(kāi)展，眾多試劑生產(chǎn)商對(duì)檢測(cè)方法的多個(gè)環(huán)節(jié)從技術(shù)上進(jìn)行改進(jìn)和完善，目前已推出第四代HIV抗體ELISA檢測(cè)試劑，但其根本方法分三類(lèi)：間接法、雙抗原夾心法和抗原競(jìng)爭(zhēng)法。22HIV抗體測(cè)定

HIV抗體試劑盒進(jìn)展代次 抗原 方法 檢測(cè)時(shí)間 1 全病毒 間接 >2個(gè)月 2 重組或多肽 間接 3-4周 3 重組+多肽 夾心 4-7天 4 抗原+抗體 夾心 抗原5pg23HIV抗體測(cè)定

特點(diǎn)第一代 全病毒 HIV-1型第二代 重組/蛋白/多肽 聯(lián)合HIV-2型 敏感度同第一代，特異度提高第三代 重組/蛋白/多肽間接法改為直接法 除IgG外能檢出早期IgM,縮短窗口期24第四代HIV抗體試劑的特點(diǎn)抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)不能取代血液?jiǎn)蝹€(gè)抗原的篩查〔前者抗原檢測(cè)范圍20-100pg/ml，后者3.5-15pg/ml〕，增加假陰性在急性感染期單一P24測(cè)定較第四代試劑檢出早1-2天第四代試劑在HIV-1非B亞型、O型和HIV-2的敏感度差異較大由于參加檢測(cè)抗原的抗-24抗體可減少單一第三代HIV抗體試劑的敏感度可能會(huì)增加非特異性反響的危險(xiǎn)性〔第三代假陽(yáng)性率0.2%增至0.3%-0.8%〕在檢測(cè)程序上凡第四代陽(yáng)性，要進(jìn)行抗原的證實(shí)試驗(yàn)核酸測(cè)定比抗體提前11天1998年BernardWebur首先評(píng)估了第四代試劑平均減少4天窗口期25酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)影響因素1.反響溫度：ELISA實(shí)驗(yàn)一般在35~40度，在一定范圍內(nèi)，提高溫度可以加快抗原抗體的結(jié)合率。2.反響時(shí)間：在ELISA測(cè)定中，抗原或抗體被包被在固相的外表，抗原抗體反響只能在固相外表附近進(jìn)行，遠(yuǎn)離固相外表的物質(zhì)要靠濃度差的改變緩慢地參與反響，所以在37度條件下需要1~2小時(shí)才能到達(dá)反響平衡，在操作時(shí)一定要使各步反響到達(dá)足夠的時(shí)間。3.樣本參加量：加樣量太少使敏感性下降和產(chǎn)生誤差；加大樣本量在一定范圍內(nèi)可提高敏感性，但有可能使特異性下降。要注意檢查加樣器的精確度。4.酶穩(wěn)定性：酶結(jié)合物在凍干或濃縮狀態(tài)下可以在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，稀釋后滴度下降較快。試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用。5.交叉反響性：加樣或分血過(guò)程中血樣的交叉污染可導(dǎo)致假陽(yáng)性反響。6.“灰區(qū)〞反響:將OD值在Cut-Off±10%范圍內(nèi)的樣本稱(chēng)之。此類(lèi)樣本應(yīng)該高度重視并進(jìn)行復(fù)檢，以便于發(fā)現(xiàn)早期感染者。26HIV抗體初篩檢測(cè)的局限性1.陽(yáng)性反響樣本不能確證，需用本法和其它方法復(fù)檢，如仍為陽(yáng)性，需確證試劑進(jìn)一步確證。2.陰性結(jié)果不能排除HIV感染：HIV感染后血清陽(yáng)轉(zhuǎn)前的“窗口期〞，HIV抗體檢測(cè)為陰性，晚期艾滋病患者某些抗體〔如P24等〕可能檢測(cè)不到。此外反響中抗體量過(guò)多，抗原抗體比例不適而不能形成特定的結(jié)合，而出現(xiàn)凝集抑制。3.可能出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果：了解試劑供給商因其使用抗原和包被方法技術(shù)存在一定差異。4.不能診斷<18月齡新生兒的母嬰垂直感染。27初篩檢測(cè)中值得注意的幾個(gè)問(wèn)題(1)1、初篩檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果不是最終結(jié)論，不能通知受檢者到本人及其他人員，陽(yáng)性樣本需用該試劑和另一種試劑復(fù)檢，如仍為陽(yáng)性，應(yīng)及時(shí)送HIV抗體確證試驗(yàn)室用確證試驗(yàn)檢測(cè)；2、初篩檢測(cè)的宗旨是要盡可能檢出所有的陽(yáng)性樣本，因此應(yīng)選用敏感性高的符合國(guó)家要求的高質(zhì)量試劑，且必須為HIV-1/2混合型，最好能同時(shí)檢測(cè)HIV-1O亞群。使用不符合規(guī)定的試劑可能導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果和法律糾紛，甚至造成嚴(yán)重后果；3、各單位可根據(jù)不同目的、檢測(cè)對(duì)象、人群流行率、本錢(qián)-效益比、實(shí)驗(yàn)室設(shè)備、和技術(shù)水平等選擇不同初篩實(shí)驗(yàn)方法。如血站對(duì)獻(xiàn)血員進(jìn)行篩選時(shí)，應(yīng)選擇高敏感性試劑，盡可能防止任何情況的漏檢，從而保證血液平安；28初篩檢測(cè)中值得注意的幾個(gè)問(wèn)題(2)4、交叉反響性或假陽(yáng)性反響：研究說(shuō)明，某些病毒〔如CMV，EBV病毒等〕、寄生蟲(chóng)〔如瘧原蟲(chóng)等〕、MHC抗原等的局部抗原性物質(zhì)和某些自身免疫病患者〔如系統(tǒng)性紅班狼瘡和風(fēng)濕病〕體內(nèi)的自身抗體與HIV的某些抗原決定簇有交叉反響性，在初篩檢測(cè)時(shí)可能導(dǎo)致假陽(yáng)性現(xiàn)象。此種情況下，樣本OD值與臨界值〔CUTOFF〕的比值〔S/CO〕通常為1-1.2,也即所謂的“灰色區(qū)〞內(nèi)，對(duì)這種結(jié)果除應(yīng)考慮早期感染、HIV-2或HIV-1“O〞亞型感染、真弱陽(yáng)性等可能性外，還應(yīng)注意假陽(yáng)性，以及實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中的技術(shù)誤差和和檢測(cè)設(shè)備的工作性能等；5、不同廠家及同一廠家生產(chǎn)的不同批次試劑的敏感性和特異性可能存在一定差異，各實(shí)驗(yàn)室最好應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控血清對(duì)新購(gòu)試劑及在每次檢測(cè)時(shí)進(jìn)行質(zhì)量控制和質(zhì)量評(píng)價(jià)，以確保檢測(cè)工作結(jié)果的準(zhǔn)確可靠性；6、實(shí)驗(yàn)室的平安：HIV實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格規(guī)定要求進(jìn)行操作。29初篩檢測(cè)中值得注意的幾個(gè)問(wèn)題(3)7、HIV-1與HIV-2之間的交叉反響性；8、針對(duì)HIV感染的不同時(shí)期選用不同的檢測(cè)方法：病毒載量、nt-PCR：HIV感染1周后；病毒別離、P24抗原、RT酶檢測(cè)：HIV感染2周后；HIV抗體檢測(cè)：HIV感染6~8周后。9、HIV抗體的檢測(cè)反響強(qiáng)度與HIV感染的概率：許多HIV抗體檢測(cè)方法既是一種定性實(shí)驗(yàn)，也是一種半定量實(shí)驗(yàn)。ELISA方法可根據(jù)OD值的強(qiáng)度確定抗體量的多少。反響性越強(qiáng)的血清，含有HIV抗體的可能性越大，S/CO值>6的樣本絕大局部為陽(yáng)性。30HIV抗體確證檢測(cè)HIV抗體確證是目前國(guó)際上通用的對(duì)樣品中血清學(xué)檢測(cè)HIV抗體陽(yáng)性結(jié)果的最終評(píng)價(jià)。它是應(yīng)用高特異性試劑來(lái)證實(shí)和判斷HIV抗體初篩陽(yáng)性反響是由于真的HIV-1和/或HIV-2感染引起，還是由于非特異性交叉反響或與HIV感染無(wú)關(guān)的其它因素所致。根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生部規(guī)定，HIV抗體陽(yáng)性報(bào)告必須由衛(wèi)生部認(rèn)證并取得資格的HIV抗體確證實(shí)驗(yàn)室出具才有法律效應(yīng)。常用的HIV抗體確證實(shí)驗(yàn)方法有免疫印跡法〔WesternBlot，WB〕，條帶免疫印跡法〔StripImmunoblotAssay或LinearImmunoblotAssay，SIA或LIA〕，免疫熒光法〔ImmunofluorescenceAssay，IFA〕和放射免疫沉淀法〔RadioimmunopreciptationAssay，RIPA〕。其中以WB法最常用，而后二種在我國(guó)極少使用，在此不作詳細(xì)介紹。31免疫印跡實(shí)驗(yàn)〔WB〕原理：HIV-1純培養(yǎng)物經(jīng)滅活和裂解處理后在SDS凝膠上電泳，不同分子量的HIV-1抗原在凝膠中的泳動(dòng)速率不同而被別離。通過(guò)電轉(zhuǎn)移等方法將凝膠中的抗原轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上〔如為HIV-1/2混合型試劑還需在硝酸纖維素膜上的適當(dāng)位置噴涂基因重組或合成的HIV-2抗原多肽〕，含HIV抗原的條膜與適當(dāng)比例稀釋的待檢血清〔漿〕樣品共同孵育，如樣品中含有HIV-1和/或HIV-2特異性抗體那么與條膜上一定位置的相應(yīng)HIV抗原分子結(jié)合，在膜上形成HIV抗原-HIV抗體復(fù)合物。洗滌除去未結(jié)合物質(zhì)，參加酶標(biāo)記抗人免疫球蛋白，形成HIV-抗原-HIV抗體-酶標(biāo)記抗人免疫球蛋白復(fù)合物，再次洗滌后參加反響，在HIV抗體與相應(yīng)HIV抗原分子結(jié)合位置處出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的呈色條帶。32HIV抗體確證實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)〔1〕陽(yáng)性：至少一條env帶(gp41、gp120、gp160)和一條pol帶〔p65、p51,p32〕。至少一條env帶和一條gag帶〔p55、p24、p18〕。至少一條env帶和一條gag帶和一條pol帶。至少兩條env帶。陰性：無(wú)上述反響條帶可疑：只有g(shù)ag帶和pol帶，無(wú)env帶

33HIV抗體確證實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)〔2〕HIV抗體不確定〔或可疑〕結(jié)果的評(píng)價(jià)：在某些情況下，有些初篩陽(yáng)性或陰性樣品的HIV抗體確證實(shí)驗(yàn)可出現(xiàn)不典型的HIV抗體反響性條帶圖譜，既不能確定為陽(yáng)性也不能確定為陰性，稱(chēng)為HIV抗體不確定〔Indeterminant〕或可疑陽(yáng)性。該現(xiàn)象的出現(xiàn)頻率通常取決于所分析的人群類(lèi)型和/或選擇用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)人群的篩選方法。此時(shí)應(yīng)每3個(gè)月追蹤隨訪一次，共2次，如為陰性或仍為不確定結(jié)果，那么按陰性結(jié)果報(bào)告；如出現(xiàn)陽(yáng)轉(zhuǎn)，那么按陽(yáng)性結(jié)果報(bào)告。34HIV抗體確證實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)〔3〕可能導(dǎo)致HIV抗體不確定結(jié)果出現(xiàn)的原因：①HIV早期感染，此時(shí)可能僅出現(xiàn)一條env帶，或p24、p31、p55帶；②非特異反響，如在高丙球