種植模式影響施肥導(dǎo)致的土壤反硝化勢變化及其微生物機(jī)制

種植模式影響施肥導(dǎo)致的土壤反硝化勢變化及其微生物機(jī)制國家自然科學(xué)基金(41977102)和江西省自然科學(xué)基金(20192BAB203022)共同資助。FundingfortheworkwasprovidedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(41977102)andNaturalScienceFoundationofJiangxiProvince(20192BAB203022)

王海翠1，2，劉兆東3，李丹丹1，2，柳開樓4，黃慶海4，趙炳梓1，通訊作者Correspondingauthor，Email：

bzhao@

作者簡介：王海翠(1986-)，女，山東臨沂人，博士，主要從事土壤生態(tài)、氮循環(huán)研究。Email：hcwang@

，張佳寶1

（1土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（中國科學(xué)院南京土壤研究所），南京210008）

（2中國科學(xué)院大學(xué)，北京10049）

（3農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮海平原農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山東省環(huán)保肥料工程技術(shù)研究中心（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所），濟(jì)南250100）

（4國家紅壤改良工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部江西耕地保育科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站（江西省紅壤研究所），南昌330046）

摘要水田土壤反硝化勢（SDP）往往高于旱地土壤，但施肥對水田和旱地SDP的影響差異往往基于不同氣候條件下的不同土壤類型獲取，其準(zhǔn)確性可能受外界條件干擾。本研究以發(fā)育自同一母質(zhì)的相鄰水田和旱地長期試驗(yàn)為平臺，比較不同施肥模式下水田和旱地SDP的變化及其與功能基因（narG、nirS、nirK和nosZ）豐度及nirS-型反硝化細(xì)菌群落組成之間關(guān)系的異同。結(jié)果表明，在水田中，與常規(guī)氮磷鉀平衡施肥（NPK）處理相比，缺鉀(NP)和缺氮(PK)處理的SDP分別提高了33.01%和23.57%，而缺磷(NK)處理則降低了35.76%，其中NP和NK處理的SDP變化與nirS基因豐度顯著相關(guān)這可能與施肥導(dǎo)致的土壤速效磷和氮/磷比變化有關(guān)，而PK處理的SDP變化與nirS-型反硝化細(xì)菌Azospirasp.NC3H-14豐度的顯著升高有關(guān)。在旱地中，與NPK處理相比，NP、NK和缺氮鉀(P)處理的SDP分別提高了13.94%、26.51%和25.41%，NK和P處理的SDP變化既與narG基因豐度顯著增加相關(guān)，也與不同的nirS-型反硝化細(xì)菌豐度增加有關(guān)，其中NK處理與Azospirasp.NC3H-14和Ideonellasp.NC3L-43b豐度增加有關(guān)，P處理與Azospirasp.NC3H-14、Rhodanobactersp.D206a和Rubrivivaxgelatinosus豐度增加有關(guān)；而土壤無定形氧化鐵含量的變化可能是影響narG基因豐度的主要因素。本研究通過直接比較相同環(huán)境條件下的水田和旱地結(jié)果表明，水田中施肥導(dǎo)致的SDP變化主要與反硝化微生物群落組成變化有關(guān)，而旱地中則可能同時受制于功能基因變化和反硝化微生物群落組成變化。

關(guān)鍵詞水田；旱地；反硝化勢；功能基因；nirS-型反硝化細(xì)菌群落

中國分類號：X17文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

土壤反硝化是土壤氮循環(huán)的重要過程，是溫室氣體N2O的重要排放源[1]。土壤潛在反硝化作用的大小可用土壤反硝化潛勢（SDP）來表示，常用的測定方法有乙炔抑制厭氧培養(yǎng)法[2-3]、15N同位素示蹤法[4]及N2/Ar法[5]，其中乙炔抑制厭氧培養(yǎng)法由于經(jīng)濟(jì)且易操作性應(yīng)用最廣泛。土壤反硝化包括生物反硝化和化學(xué)反硝化，其中以生物反硝化為主[6]。生物反硝化是指異養(yǎng)微生物在厭氧條件下將NO3-逐步還原為N2的硝酸鹽異化過程[7]。反硝化細(xì)菌是土壤反硝化的主要驅(qū)動微生物，在土壤生物反硝化過程中起著重要作用[8-9]。反硝化細(xì)菌群落是一個復(fù)雜的生物體系，廣泛分布于復(fù)雜的屬種中，而不是一個特定的分類群。因此16rRNA并不適用于反硝化微生物的系統(tǒng)發(fā)生研究，而功能基因經(jīng)常被用來表征反硝化微生物，如narG、nirS、nirK和nosZ基因，經(jīng)常被廣泛用于反硝化細(xì)菌群落的豐度和結(jié)構(gòu)的檢測[10-11]。傳統(tǒng)的微生物鑒定技術(shù)由于僅僅只能鑒定1%的微生物，并不適用于反硝化微生物的鑒定[12]。高通量測序技術(shù)一次可以對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行測序[13]，與其他分子生物鑒定技術(shù)相比具有通量高、節(jié)省成本和時間的優(yōu)點(diǎn)。近幾年來，高通量測序技術(shù)越來越多的被應(yīng)用于反硝化微生物鑒定。由NO2-到NO的反應(yīng)被認(rèn)為是區(qū)分反硝化過程與其它硝酸鹽代謝的關(guān)鍵步驟，也被認(rèn)為是反硝化過程的限速步驟[14-15]。nirS/nirK基因是控制此過程的編碼基因[16]，但nirS比nirK基因在環(huán)境中的分布更廣泛，因此nirS常被用于反硝化微生物的檢測[17]。自1970年以來，大氣中的N2O濃度一直以每年約750ppt的速度增加[18]，且全球一半以上的溫室氣體N2O來自于農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)[1]。因此，系統(tǒng)研究農(nóng)田土壤的反硝化及其相關(guān)影響因素對調(diào)控農(nóng)田土壤氮循環(huán)具有重要的參考意義。

農(nóng)田土壤往往種植水稻和旱地作物，不同施肥模式下的水田SDP往往高于旱地土壤[19-20]，并且影響水田和旱地的微生物機(jī)制也可能不同。針對水田土壤，施氮可以明顯改變反硝化微生物的群落組成，從而提高水田的SDP[21-22]。已有的研究表明，有效磷的缺乏會限制反硝化微生物活性[23-24]。Wei等[25]向缺P水稻土中施入P肥之后，發(fā)現(xiàn)通過改變土壤的N/P比，顯著降低了amoA基因豐度，增加了反硝化功能基因豐度（narG、nirS、nirK及nosZ）。因此，施P可以通過改變土壤中P的有效性[23-26]和N/P比[27]，對土壤反硝化過程產(chǎn)生顯著影響。而針對旱地土壤，施氮在短期內(nèi)也顯著改變了旱地土壤中nirS型反硝化細(xì)菌[28]和SDP[29]。Mori和Ohta[26]在旱地土壤中加入P之后，發(fā)現(xiàn)土壤的硝化及反硝化速率都顯著提高。施用K肥能夠引起根際土壤中有效鉀含量的變化，從而能夠影響微生物分泌的酶，改善土壤微域環(huán)境，進(jìn)而調(diào)控微生物代謝的一些功能[30-31]。Xue等[32]研究表明：有效K是影響旱地土壤nirK-型反硝化細(xì)菌群落的重要因子。以上研究結(jié)果顯示，不同種植模式下施肥對土壤反硝化過程的影響機(jī)制存在顯著差異[33]，但是，上述施肥模式對水田和旱地土壤SDP的影響效應(yīng)及其微生物機(jī)制均基于不同地點(diǎn)的水田和旱地獲取，不同研究地點(diǎn)存在的土壤母質(zhì)[34]和氣候條件[35]差異可能會影響水田和旱地間結(jié)果的可比性。

本研究選擇位于江西進(jìn)賢的相鄰水田和旱地長期施肥試驗(yàn)為研究平臺，輔以室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、基于實(shí)時熒光定量PCR（qPCR）及高通量測序，開展不同種植模式下施肥對SDP及其與功能基因和微生物群落組成關(guān)系的影響研究，主要研究目的包括：（1）明確施肥模式對水田和旱地土壤SDP的不同影響效應(yīng)；（2）剖析施肥模式對水田和旱地土壤功能基因narG、nirS、nirK和nosZ豐度，及nirS-型反硝化細(xì)菌群落組成影響；（3）評估水田和旱地土壤SDP與功能基因及nirS-型反硝化細(xì)菌群落組成之間的潛在關(guān)系。為探索種植模式與施肥措施對土壤反硝化微生物學(xué)機(jī)制的雙重影響提供參考，為優(yōu)化農(nóng)田溫室氣體減排方案提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1長期試驗(yàn)概況

試驗(yàn)地點(diǎn)位于江西省進(jìn)賢縣的江西省紅壤研究所（116°20′24″N，28°15′30″E），土壤母質(zhì)為第四紀(jì)紅黏土，屬于亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，平均海拔25-30m，年降雨量1727mm，年平均氣溫18.1℃。

水田長期施肥試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個處理3個重復(fù)，每個小區(qū)面積是46.6m2。本研究選取了4個施肥處理，分別是常規(guī)平衡施肥（NPK）處理、缺鉀（NP）、缺磷（NK）和缺氮（PK）處理。施肥量及施肥方式為：水稻單季施用尿素（N90kg·hm-2）、鈣鎂磷肥（P45kg·hm-2）和氯化鉀（K75kg·hm-2）。有機(jī)肥和鈣鎂磷肥作基肥施用，氮肥和鉀肥在水稻返青后和分蘗盛期按6：4比例分兩次追施。試驗(yàn)前土壤基本性質(zhì)是pH5.4，有機(jī)碳16.3g·kg-1，全氮、全磷和全鉀含量分別是1.49g·kg-1、0.44g·kg-1和10.39g·kg-1，堿解氮144mg·kg-1，有效磷（Olsen-P）為9.5mg·kg-1，速效鉀（NH4OAC-K）為81.2mg·kg-1，CEC27cmol·kg-1，黏粒含量（<0.002mm）241g·kg-1[36]。

與水田試驗(yàn)類似，旱地長期施肥試驗(yàn)也采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個處理3個重復(fù)，每個小區(qū)面積是22.22m2。選取常規(guī)平衡施肥（NPK）處理、缺鉀（NP）、缺磷（NK）和缺氮鉀（P）處理為研究對象。施肥量及施肥方式為：尿素（N60kg·hm-2）、鈣鎂磷肥（P2O530kg·hm-2）、氯化鉀（K2O60kg·hm-2），其中磷肥、鉀肥作為基肥，氮肥用量的2/3為基肥，1/3為追肥。試驗(yàn)前土壤基本性質(zhì)pH6.0，有機(jī)碳9.39g·kg-1，全氮、全磷和全鉀含量分別是0.98g·kg-1、1.42g·kg-1和15.83g·kg-1，堿解N60.3mg·kg-1，速效P12.9mg·kg-1，速效K81.2mg·kg-1[37]。

1.2樣品采集與處理

在2015年12月冬季完成樣品的采集，每個小區(qū)隨機(jī)選取5點(diǎn)，采集0~20cm耕層土混勻。取約100g新鮮土樣-80℃保存，用于土壤反硝化微生物的測定；取約50g新鮮土在4℃條件下貯存，用于氨態(tài)氮（NH4+-N）和硝態(tài)氮（NO3--N）的測定；剩余土樣在室溫下風(fēng)干，移除肉眼可見的落葉，植物根系，石塊，過2mm篩，用于后期土壤理化性質(zhì)的測定。

1.3土壤理化性質(zhì)的測定

土壤pH按土水比1：5充分混合后用pH計(jì)測定；土壤有機(jī)碳（SOC）用重鉻酸鉀氧化外加熱法測定[38]?？偟═N）用凱氏法測定[38]。NO3--N和NH4+-N用2MKCl萃取后用流動注射自動分析儀測定[38]。用0.5M的NaHCO3提取有效磷（AP），并用鉬藍(lán)法測定（Olsen，1954）。土壤速效鉀（AK）用CH3COONH4提取[38]，火焰光度計(jì)測定，檢測限為0.004mmol·L-1。采用草酸銨酸性法提取非晶態(tài)氧化鐵（Feo）和非晶態(tài)氧化鋁（Alo）[39]，利用ICP-MS測定了萃取液中的鐵和鋁。

1.4厭氧培養(yǎng)試驗(yàn)

土壤反硝化勢是指在厭氧及充足碳源和氮源的條件下土壤的反硝化速率，常用于指示土壤反硝化作用的強(qiáng)弱[40]。乙炔抑制厭氧培養(yǎng)法是測定SDP的常用方法之一[41-42]。該方法被廣泛用于測定水田和旱地的SDP，培養(yǎng)過程的土壤含水量可以從50%到淹水狀態(tài)[43-47]。當(dāng)水稻田完全淹水時土壤的N2O排放量非常少，75%WFPS左右時土壤N2O的排放量最大，且主要來自于反硝化作用[48-49]。為了準(zhǔn)確測定水田和旱地中不同施肥模式下SDP的差異，我們在培養(yǎng)過程中土壤含水量調(diào)節(jié)為70%WFPS,有利于土壤反硝化過程釋放最大的N2O，減少N2的排放。具體試驗(yàn)過程如下：將風(fēng)干土含水量調(diào)節(jié)到40%WFPS，25°C黑暗條件下預(yù)激活1周。取相當(dāng)于6g干土的預(yù)激活土到120mL血清培養(yǎng)瓶中，加入8.658mg硝酸鉀（N200μg·(g干土)-1）和20.508mg乙酸鈉（C1mg·(g干土)-1）。調(diào)節(jié)含水量到70%WFPS。血清培養(yǎng)瓶用黑色橡膠塞和鋁蓋密封，用真空泵抽真空2min，注入120mL純Ar（99.999%），再進(jìn)行抽真空處理，此過程重復(fù)3次。最后向培養(yǎng)瓶內(nèi)分別注入108mLAr和12mLC2H2（10%v/v）。25°C條件下，以180轉(zhuǎn)/分振蕩15min，然后在25°C的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)6h。用注射器從培養(yǎng)瓶頂部采集氣體樣品并儲存在20mL采氣瓶中。之后培養(yǎng)瓶抽真空，重新注入Ar，此過程重復(fù)3次，以確保培養(yǎng)瓶的厭氧條件，培養(yǎng)瓶再次注入12mLC2H2和108mLAr，進(jìn)行下一階段的6h厭氧培養(yǎng)。培養(yǎng)總共進(jìn)行24h。培養(yǎng)期間，N2O-N的排放積累量呈線性增加（水田平均R2=0.970，旱地平均R2=0.974），N2O-N的平均排放速率代表SDP。

1.5土壤反硝化勢（N2O-N）的測定

氣體樣品采用安捷倫氣相色譜儀（GC，Agilent7980，AgilentTechnologies，SantaClara，CA，USA）測定。代表SDP的N2O的排放量計(jì)算公式是（1）：

F=dcdtMVmV273273+T1M（1）

式中：F表示N2O-N的排放速率（μgNkg·h-1），dc/dt表示單位時間內(nèi)氣體濃度的變化量（ppm·h-1），M表示N2O的摩爾質(zhì)量（28g·mol-1，N2O-N），Vm表示摩爾體積（22.4L·mol-1），V表示培養(yǎng)瓶的有效體積（0.12L），T表示培養(yǎng)溫度（25°C），M表示培養(yǎng)土干重（kg）。

1.6DNA提取及實(shí)時熒光定量PCR（qPCR）

土壤DNA提取采用FastDNASpinKitforSoil（MPBiomedicals，SantaAna，CA，USA）試劑盒。每個土樣連續(xù)提取3次，混勻，降低DNA提取偏差。提取的DNA在-80°C條件下保存。

采用SYBRPremixExTaqTM試劑盒于CFX96OpticalReal-TimePCRSystem擴(kuò)增儀（Bio-RadLaboratories,Hercules,CA）上進(jìn)行qPCR分析。narG、nirK及nosZ基因的擴(kuò)增體系包括10μLSYBR?PremixExTaq（TliRNaseHPlus，2×，TakaraBio，日本）、正向/反向引物各0.4μL（10μmol·L-1）、2μLDNA模板（<20ng·μL-1）和7.2μL雙蒸水（ddH2O）。nirS基因的擴(kuò)增體系包括10μLSYBR?PremixExTaq（TliRNaseHPlus，2×，TakaraBio，日本）、正向/反向引物各0.5μL（10μmol·L-1）、1μLDNA模板（<20ng·μL-1）和8μLddH2O。引物信息及擴(kuò)增條件參照Wang等[19]。標(biāo)準(zhǔn)曲線用各基因的代表性質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋獲得，共5個梯度，ddH2O為陰性對照。narG、nirS、nirK和nosZ基因的擴(kuò)增效率分別為90.4%-93.1%、84.1%-92.8%、86.0%-87.8%和89.8%-89.0%。

1.7測序分析

利用IlluminaMiSeq測序平臺（Illumina，SanDiego，CA，USA）對nirS基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了測序，引物為cd3aF/R3cd。所用PCR反應(yīng)體系及序列結(jié)果分析步驟詳細(xì)參照Wang等[19]。

序列結(jié)果按以下步驟分析：（1）采用FLASH進(jìn)行雙端序列拼接；（2）標(biāo)簽完全匹配的原始序列被分配給相應(yīng)的樣本，被識別為有效序列，之后過濾低質(zhì)量序列：平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)<Q20的序列，長度<150bp的序列，含有不明確的堿基對的序列；（3）利用UCLUST將獲得的高質(zhì)量序列以97%相似度聚類成可操作的分類單元（OTU）；（4）刪除含量低于0.001%的OTUs。（5）樣本抽平，達(dá)到相同的測序深度進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。（6）進(jìn)行不同分類水平（門、綱、目、科、屬）的相對豐度分析。利用BLAST（NCBI數(shù)據(jù)庫）對序列進(jìn)行在線比對注釋。

1.8數(shù)據(jù)分析

利用SPSS20.0（Chicago,USA）和R3.6.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Duncan多重比較對不同處理的反硝化勢、土壤性質(zhì)、功能基因進(jìn)行差異分析。置換多元方差分析（PERMANOVA）對不同施肥模式下水田、旱地反硝化細(xì)菌群落組成進(jìn)行差異分析[50]。利用火山灰圖（R“DESeq2”）分析水田、旱地差異OTUs[51]。Spearman（R“corrplot”）相關(guān)分析分析土壤性質(zhì)與SDP和反硝化功能基因的關(guān)系。

2結(jié)果分析

2.1土壤理化性質(zhì)

表1結(jié)果顯示，不同施肥模式對水田pH、SOC、TN、NH4+-N和Alo沒有顯著影響；與平衡施肥NPK相比，NP處理的NO3--N、C/N比和N/P比分別降低了86.75%、3.51%和96.84%，而AP和Feo含量明顯提高了346.72%和13.11%；NK處理的AP含量顯著降低了48.15%，而AK含量和N/P比明顯提高了25.08%、107.37%；PK處理的NO3--N、C/N比和N/P比分別下降了83.43%、5.15%和96.84%。

長期不同施肥模式對旱地TN、NH4+-N及C/N比沒有顯著影響；與平衡施肥NPK相比，NP處理顯著提高土壤pH和AP含量，分別提高了4.88%和11.36%，而SOC、NO3--N、AK和N/P比分別降低了9.97%、75.14%、74.43%和78.05%；NK處理的土壤pH、NO3--N、AP、Feo和N/P比分別降低了4.21%、59.53%、55.79%、8.11%和8.54%，Alo含量顯著提高；單施P處理，土壤pH和AP顯著提高了16.35%和43.31%，但SOC、NO3--N、AK、Feo、Alo和N/P明顯分別降低了11.03%、88.34%、56.49%、9.96%、23.63%和91.46%。

表1長期不同施肥模式對水田和旱地基本性質(zhì)影響

Table1Soilchemicalpropertiesofthepaddyfieldanduplandrelativetofertilizationregime

處理

Treatments

pH

SOC

(g·kg-1)

TN

(g·kg-1)

NO3--N

(mg·kg-1)

NH4+-N

(mg·kg-1)

AP

(mg·kg-1)

AK

(mg·kg-1)

Feo

(g·kg-1)

Alo

(g·kg-1)

C/N

N/P

水田Paddysoil

NPK

5.39±0.05a

19.88±1.19a

2.05±0.14a

3.32±0.13a

17.82±2.25a

3.51±0.04c

46.66±7.04b

0.61±0.03c

1.34±0.17a

9.70±0.15a

0.95±0.08b

NP

5.27±0.06a

19.76±0.59a

2.11±0.09a

0.44±0.11b

15.23±5.94a

15.68±0.53b

48.68±5.34ab

0.69±0.10b

1.53±0.06a

9.36±0.15b

0.03±0.00c

NK

5.24±0.35a

19.89±0.50a

2.03±0.06a

3.50±0.46a

17.99±4.91a

1.82±0.22d

58.36±7.05a

0.63±0.06c

1.52±0.04a

9.77±0.20a

1.97±0.08a

PK

5.28±0.00a

19.51±0.27a

2.12±0.04a

0.55±0.11b

14.19±2.36a

19.65±0.27a

54.85±0.23ab

0.92±0.02a

1.40±0.10a

9.20±0.02b

0.03±0.01c

旱地Uplandsoil

NPK

4.71±0.06c

9.43±0.61a

1.03±0.03a

7.24±0.64a

2.40±0.07a

8.89±0.27c

202.17±10.86a

7.03±0.37a

1.82±0.11b

9.11±0.36a

0.82±0.11a

NP

4.94±0.11b

8.49±0.52b

0.99±0.03a

1.80±0.26c

2.44±0.06a

9.90±0.69b

51.70±2.59b

7.01±0.19a

1.94±0.24b

8.59±0.33a

0.18±0.03b

NK

4.52±0.09d

9.47±0.66a

1.02±0.05a

2.93±0.11b

2.86±0.12a

3.93±0.15d

236.34±21.23a

6.46±0.14b

2.34±0.30a

9.30±0.15a

0.75±0.01a

P

5.48±0.05a

8.39±0.55b

0.98±0.08a

0.84±0.13c

2.75±0.39a

12.74±0.51a

87.96±16.93b

6.33±0.08b

1.39±0.07c

8.60±0.87a

0.07±0.01c

注：SOC表示土壤有機(jī)碳，TN表示土壤全氮，AP表示土壤速效磷，AK表示土壤速效鉀，F(xiàn)eo表示土壤無定形氧化鐵，Alo表示土壤無定形氧化鋁，C/N比表示土壤有機(jī)碳與土壤全氮的比，N/P表示土壤硝態(tài)氮與速效磷的比。表中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3），同一列數(shù)據(jù)后不同字母表示同一土壤類型不同施肥處理之間顯著性差異（Duncan多重比較，P<0.05）。Note:SOC:Soilorganiccarbon,TN:TotalN,AP:AvailableP,AK:AvailableK,Feo:amorphousironoxide,Alo:amorphousaluminumoxide,C/N:Ratioofsoilorganiccarbontototalnitrogen,N/P:RatioofNO3--NtoAvailableP.Differentletterswithinthesamecolumnindicatesignificantdifferencebetweentreatment（P<.05,Duncan'smultiplerangetest）.

2.2土壤反硝化勢

不同施肥模式顯著影響水田和旱地的SDP，但影響規(guī)律不同（圖1）。在水田中，NP處理的SDP最高，其次為PK、NPK，NK處理的SDP最低；與NPK相比，NP和PK處理的SDP分別提高了33.01%和23.57%，而NK處理則降低35.76%（圖1a）。

旱地NK和P處理SDP最高，并且NK和P處理間沒有顯著差異，其次為NP處理，而NPK處理最低；相對于NPK處理，NK、P和NP處理的SDP分別顯著增加了26.51%、25.41%和13.94%（圖1b）。

圖1長期不同施肥模式對水田和旱地反硝化勢的影響（圖中小寫字母表示不同施肥模式下SDP差異顯著，(Duncan多重比較，P<0.05,下圖同））

Fig.1Soildenitrificationpotentialinthepaddyfieldanduplandrelativetofertilizationregime

2.3土壤反硝化功能基因及與SDP之間關(guān)系

反硝化功能基因豐度能影響反硝化過程N(yùn)2O的排放[40-41]。除了水田的narG基因，本研究采用的施肥模式均顯著影響nirS、nirK和nosZ的豐度（圖2和圖3）。圖2表明，在水田中，與NPK處理相比，NP處理顯著提高nirS基因豐度，提高了22.94%，而NK和PK處理則顯著降低了24.07%和19.80%；NK處理的nirK基因豐度顯著降低了26.08%，NP和PK處理沒有顯著變化；NP和NK處理的nosZ基因豐度分別顯著提高了22.45%和17.98%。Spearman相關(guān)性分析表明，水田SDP變化與nirS基因豐度顯著正相關(guān)（r=0.783**），與narG、nirK和nosZ基因豐度沒有顯著相關(guān)性（表2）。

在旱地中（圖3），與NPK處理相比，NP處理的narG基因豐度顯著降低了12.97%，而NK和P處理顯著提高了46.90%和46.94%；NK處理對nirS基因豐度沒有顯著影響，NP和P處理顯著提高了80.36%和468.19%；nirK基因豐度不受NP和NK處理影響，單施P肥顯著降低了38.40%；NP和P處理的顯著提高nosZ基因豐度，分別提高了8035.71%和116.47%。Spearman相關(guān)性分析表示，旱地SDP變化與nirG基因豐度顯著正相關(guān)（r=0.783**），與nirS、nirK和nosZ基因豐度沒有顯著相關(guān)性（表2）。

圖2長期不同施肥模式對水田反硝化功能基因豐度的影響

Fig.2AbundancesofnarG,nirS,nirKandnosZgenesinthepaddyfieldrelativetofertilizationregime

圖3長期不同施肥模式對旱地反硝化功能基因豐度的影響

Fig.3AbundancesofnarG,nirS,nirKandnosZgenesintheuplandfieldrelativetofertilizationregime

表2水田和旱地的反硝化勢與功能基因的Spearman相關(guān)分析

Table2Spearman’scorrelationsanalysisofSDPsofthepaddyfieldanduplandfieldwithfunctionalgenes

處理

Treatments

水田Paddyfield

旱地Uplandfield

narG

nirS

nirK

nosZ

narG

nirS

nirK

nosZ

SDP

0.252

0.783**

0.531

0.217

0.592*

-0.035

-0.524

-0.049

2.4nirS-型反硝化細(xì)菌群落組成

水田和旱地24個土壤樣品測序總共獲得415848條高質(zhì)量序列，在97%相似度聚類下得到4727個OTUs。在門水平上，水田樣品中的nirS型反硝化細(xì)菌有97.49%來自Proteobacteria，包括Betaproteobacteria（62.39%）、Alphaproteobacteria（30.16%）和Gammaproteobacteria（4.93%）；旱地樣品中有99.28%來自Proteobacteria，包括Betaproteobacteria（74.85%）、Gammaproteobacteria（19.29%）和Alphaproteobacteria（5.14%）。

置換多元方差分析結(jié)果表明，水田nirS-型反硝化細(xì)菌群落組成只有PK處理與NPK處理存在顯著差異（p<0.05），而NP和NK處理與NPK處理間均不存在顯著差異（p>0.05）（表3）；而對旱地來說，只有NP處理的nirS-型反硝化細(xì)菌群落組成與NPK處理間沒有顯著差異（p>0.05），NK和P處理與NPK處理間均存在顯著差異（p<0.05）。

進(jìn)一步采用火山灰圖分析不同施肥處理間nirS-型反硝化細(xì)菌的差異（圖4），結(jié)果表明，在水田中，NK和NP處理與NPK處理間沒有產(chǎn)生顯著差異的OTUs（圖4a，4b），這與表3結(jié)果一致；而PK處理與NPK處理之間微生物差異主要表現(xiàn)為PK處理中的1個OTU（Azospirasp.NC3H-14）豐度顯著增加，而11個OTUs豐度顯著降低（圖4c）。

在旱地中，NK處理與NPK處理之間的差異主要表現(xiàn)為NK處理中具有更高豐度的3個OTUs，它們歸類為Azospirasp.NC3H-14和Ideonellasp.NC3L-43b（圖4e）。而P處理與NPK處理間的主要差異表現(xiàn)為P處理中具有更高豐度的72個OTUs，它們主要?dú)w類為Azospirasp.NC3H-14、Rhodanobactersp.D206a和Rubrivivaxgelatinosus（圖4f）。

表3水田和旱地nirS-型反硝化細(xì)菌群落組成的置換多元方差分析

Table3PERMANOVAanalysiscommunitycompositionofnirS-typedenitrifier

inthepaddyfiledandupland

處理

Treatments

水田Paddyfield

旱地Uplandfield

F.Model

p.adjusted

F.Model

p.adjusted

NPKvs.NP

1.77

0.846

3.70

0.270

NPKvs.NK

1.66

1.000

6.98

0.018

NPKvs.PK

6.92

0.018

—

—

NPKvs.P

—

—

17.70

0.018

注：黑點(diǎn)代表豐富型物種，灰點(diǎn)代表消弭型物種，空心點(diǎn)代表穩(wěn)定型物種。(a)、(b)、(c)分別是紅壤水田NP、NK、PK與NPK對比，(d)、(e)、(f)分別是紅壤旱地NP、NK、P與NPK對比。Note:BlackpointrepresentsOTUsenriched,graypointrepresentsOTUsdepleted,andthehollowpointrepresentsthestableOTUs.(a),(b),and(c)standsforNPvs.NPK,NKvs.NPK,andPKvs.NPKinthepaddyfield,respectively.(d),(e),and(f)areNPvs.NPK,NKvs.NPK,andPvs.NPKintheuplandfield,respectively.

圖4長期不同施肥模式下水田和旱地OTU水平nirS型反硝化細(xì)菌差異物種

Fig.4Volcanoplotsshowingenrichment(black)anddepletion(gray)ofnirS-typedenitrifiersattheOTUlevelinthepaddyfieldanduplandrelativetotreatment

3討論

3.1水田和旱地影響SDP與功能基因的關(guān)系

反硝化功能基因豐度對SDP的影響一直以來存在不確定性。有研究認(rèn)為反硝化功能基因豐度與SDP沒有直接的關(guān)系[54]，同時也有研究指出反硝化功能基因豐度變化能顯著影響SDP[12,43]。本研究通過Spearman相關(guān)分析研究發(fā)現(xiàn)水田SDP變化與nirS基因豐度顯著正相關(guān)（r=0.783**），而與narG、nirK和nosZ基因豐度沒有顯著相關(guān)性（表2），這與羅希茜（2010）的研究結(jié)果一致，其研究結(jié)果表明施肥導(dǎo)致的水田SDP變化與nirS基因豐度有關(guān)[55]。如圖1和圖2所示，與NPK處理相比，NP處理同時提高了nirS基因豐度和SDP，而NK處理同時降低了nirS基因豐度和SDP。上述結(jié)果表明，與NPK處理相比，NP處理和NK處理的SDP差異與nirS基因豐度的變化有關(guān)。土壤微生物生物量通常比土壤和植物具有更低的N/P比，微生物更容易受到磷的限制[56]。Mori和Ohta[26]及Hartman和Richardson[57]通過對缺磷土壤反硝化的研究發(fā)現(xiàn)，土壤AP含量的提高可以促進(jìn)土壤氮循環(huán)及反硝化微生物的生長，從而提高土壤反硝化速率。Wei和Hu[25]研究也發(fā)現(xiàn)，通過改變土壤的C/P和N/P，可以顯著提高反硝化功能基因豐度。因此我們推斷NP處理中較高的AP含量以及較低的N/P比可能會引起nirS基因豐度的增加，進(jìn)而導(dǎo)致其SDP顯著高于平衡施肥NPK。而NK處理中較低的AP含量以及較高的N/P比可能減少了nirS基因豐度，從而有可能與NK處理較低的SDP有關(guān)（圖1）。

與水田不同，不同施肥模式下，旱地SDP變化與narG基因豐度顯著正相關(guān)（r=0.592*）（表2），這與Dong等的研究結(jié)果非常相似[58]，其研究發(fā)現(xiàn)narG基因豐度顯著影響玉米-小麥生態(tài)系統(tǒng)中N2O的排放。與NPK處理相比，P和NK處理同時提高了narG基因豐度和SDP，表明narG基因豐度的變化與P處理和NK處理的SDP差異有關(guān)（圖1和圖3）。如表1所示，不同施肥模式下，NPK處理和NP處理的Feo含量明顯高于NK處理和P處理。Feo膠體對陰陽離子的吸附性限制反應(yīng)基質(zhì)的有效性，例如SOC的有效性，從而降低narG基因豐度[59]。因此，P和NK施肥處理中較低的Feo可能引起narG基因豐度顯著高于NPK處理，從而與P和NK處理較高的SDP有關(guān)（圖1）。

3.2水田和旱地影響SDP與nirS-型反硝化細(xì)菌群落組成的關(guān)系

在水田中，Azospirasp.NC3H-14是PK處理和NPK處理間具有明顯差異的反硝化微生物，而NP和NK處理與NPK處理間反硝化細(xì)菌群落組成間沒有差異（圖4c）。Azospira菌屬不能利用碳水化合物，但可利用有機(jī)酸、氨基酸等為碳源，氧或者硝酸鹽作為末端電子受體[60]。Li等[61]研究發(fā)現(xiàn)，與NPK相比，不平衡施肥改變土壤有機(jī)碳結(jié)構(gòu)，且養(yǎng)分有效性比養(yǎng)分含量對微生物的影響更大[62]。因此，PK施肥可能改變了土壤有機(jī)碳的形態(tài)更容易被AzospiraNC3H-14利用，而提高了Azospirasp.NC3H-14的豐度。這與PK處理和NPK處理間nirS-型反硝化細(xì)菌群落組成差異有關(guān)，并提高了PK施肥處理的SDP（圖1）。

在旱地中，與NPK處理相比，NK處理下的Azospirasp.NC3H-14和Ideonellasp.NC3L-43b豐度更高（圖4e），而P處理下的Azospirasp.NC3H-14、Rhodanobactersp.D206a和Rubrivivaxgelatinosus具有更高的豐度（圖4f）。有研究表明，在厭氧條件下，Rubrivivaxgelatinosus可以通過將亞硝酸鹽還原為N2來提高SDP[50-51]。上述反硝化細(xì)菌豐度的增加與P處理與NK處理顯著改變nirS-型反硝化細(xì)菌群落組成有關(guān)（表3），從而提高了P處理和NK處理的SDP（圖1）。旱地NP處理的SDP變化沒有發(fā)現(xiàn)與本研究測定的功能基因豐度和nirS型反硝化細(xì)菌組成有關(guān)，這可能與其他本研究沒有測定的參數(shù)變化有關(guān)。比如，反硝化酶活性也是調(diào)控SDP變化的重要因素[65-66]。另外，Chee-Sanford等[67]研究發(fā)現(xiàn)，非特異性nosZ基因（CladeⅡnosZ）比特異性擴(kuò)增的nosZ基因物在生態(tài)系統(tǒng)中（特別是土壤中）更具有優(yōu)勢。因此，非特異性nosZ基因在水田、旱地不同種植模式下可能會對SDP有不同的影響。而本研究中的nosZ基因擴(kuò)增引物無法反應(yīng)非特異性nosZ基因代表的微生物。因此，影響水田和旱地間SDP變化的機(jī)理值得進(jìn)一步深入研究。

4結(jié)論

通過直接比較相同土壤母質(zhì)和氣候條件下的水田和旱地SDP變化發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)平衡施肥NPK處理相比，水田中NP和PK處理的SDP顯著升高，而NK處理顯著降低，其中NP和NK的SDP變化主要與nirS基因豐度變化有關(guān)，而PK處理升高的SDP與其中的反硝化細(xì)菌Azospirasp.NC3H-14的豐度增加有關(guān)；而在旱地中，NP、NK、P處理的SDP均顯著增加，其中NK和P處理的SDP變化與narG基因豐度顯著正相關(guān)，同時與NK處理中反硝化細(xì)菌Azospirasp.NC3H-14和Ideonellasp.NC3L-43b豐度顯著增加，及P處理中Azospirasp.NC3H-14、Rhodanobactersp.D206a和Rubrivivaxgelatinosus豐度顯著增加有關(guān)。

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