2022年醫(yī)學(xué)專題-第二章-細(xì)胞破碎與提取要點(diǎn)

第二章蛋白質(zhì)的制備

---細(xì)胞破碎(pòsuì)與萃取第一頁，共九十二頁。第一節(jié)蛋白質(zhì)制備(zhìbèi)總則來源(láiyuán)、胞內(nèi)（胞外）、可溶性、分子大小、等電點(diǎn)、穩(wěn)定性（對溫度、pH、蛋白酶、金屬離子的耐受性）等二、方法(fāngfǎ)選擇依據(jù)：

根據(jù)不同蛋白質(zhì)的性質(zhì)和研究目的一、目標(biāo)：高效率、高收率、高純度、高活性1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)：第二頁，共九十二頁。工業(yè)化應(yīng)用(yìngyòng)：經(jīng)濟(jì)性（高收率，純度次要）一般研究：80%-90%純度結(jié)構(gòu)研究：95%以上純度醫(yī)療：全面分析2、研究(yánjiū)目的：越到后面的純化越困難，增加(zēngjiā)成本，延長操作時(shí)間，收率低考慮產(chǎn)品的質(zhì)量、數(shù)量和經(jīng)濟(jì)性第三頁，共九十二頁。三、確立(quèlì)有效成分的測定方法1、蛋白質(zhì)初步提取(tíqǔ)和濃縮

吸附法超濾法沉淀法（鹽析(yánxī)、有機(jī)溶劑沉淀、等電點(diǎn)沉淀）透析第四頁，共九十二頁。三、確立(quèlì)有效成分的測定方法2、蛋白質(zhì)高效(ɡāoxiào)分離純化

色譜法（凝膠過濾、離子交換、親和色譜等）電泳(diànyǒnɡ)法

（聚丙烯酰胺凝膠、等電聚焦、毛細(xì)管電泳等）第五頁，共九十二頁。3、根據(jù)(gēnjù)蛋白質(zhì)性質(zhì)確立分離方法溶解度不同：等電點(diǎn)，有機(jī)溶劑，鹽析電荷不同：電泳，離子交換分子(fēnzǐ)形狀大小不同：離心，透析，凝膠過濾第六頁，共九十二頁。四、蛋白質(zhì)的制備(zhìbèi)流程：原料(yuánliào)液細(xì)胞分離(fēnlí)(離心，過濾)細(xì)胞－胞內(nèi)產(chǎn)物細(xì)胞破碎碎片分離清液－胞外產(chǎn)物粗分離(鹽析、萃取、超過濾等)純化(層析、電泳)脫鹽(凝膠過濾、超過濾)濃縮(超過濾)精制(結(jié)晶、干燥)包含體溶解(加鹽酸胍、脲)復(fù)性第七頁，共九十二頁。首先(shǒuxiān)：材料的選擇和預(yù)處理細(xì)胞(xìbāo)的破碎和細(xì)胞(xìbāo)組分分離有效成分的萃取第八頁，共九十二頁。第二節(jié)材料的選擇(xuǎnzé)、預(yù)處理與保存一、原料選擇(xuǎnzé)原則：有效成分含量高、原料來源(láiyuán)豐富，易得；原料中雜質(zhì)含量少；原料成本低等；植物采收具有季節(jié)性微生物生長的對數(shù)期注意動(dòng)物的年齡與性別第九頁，共九十二頁。微生物：及時(shí)將菌細(xì)胞與培養(yǎng)液分開，進(jìn)行保鮮(bǎoxiān)處理。二、原料(yuánliào)的預(yù)處理：動(dòng)物原料：采集后要立即處理，去除結(jié)締組織、脂肪組織等，并迅速(xùnsù)冷凍貯存。植物原料：要擇時(shí)采集并就地去除不用的的部分，有用部分保鮮處理。第十頁，共九十二頁。（3）防腐劑保鮮：常用(chánɡyònɡ)乙醇、苯酚等。適用于液體原料，如發(fā)酵液、提取液等。三、原料的保存(bǎocún)方法（1）冷凍法：適用于所有生物原料(yuánliào)。常用-40℃速凍。（2）有機(jī)溶劑脫水法：丙酮，該法適用于原料少而價(jià)值高、有機(jī)溶劑對活性物質(zhì)沒有破壞作用的原料，如腦垂體等。第十一頁，共九十二頁。第三節(jié)細(xì)胞(xìbāo)破碎一、破碎(pòsuì)方法的原則和依據(jù)原則(yuánzé)：最大提取、不易變性、減少干擾具體須從材料特性和目的物特性綜合考慮。第十二頁，共九十二頁。1、材料細(xì)胞(xìbāo)的特性動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁，易破碎，只需用溫和方法植物細(xì)胞(xìbāo)有細(xì)胞(xìbāo)壁難破碎，須用中等或強(qiáng)度大的方法微生物細(xì)胞較復(fù)雜，一般用較強(qiáng)的方法第十三頁，共九十二頁。2、目的物的特性(tèxìng)⑶.處理量

有些(yǒuxiē)處理量大，如組織搗碎機(jī)等。有些處理量少，如超聲波破碎等。

⑴．細(xì)胞中的位置游離狀：只需溫和破碎(pòsuì)，除去不溶部分。結(jié)合狀：結(jié)合在膜或細(xì)胞器內(nèi)，先收集膜或細(xì)胞器，再破碎⑵．敏感性

溫度、pH、氧、剪切力、雜酶等影響第十四頁，共九十二頁。㈠機(jī)械(jīxiè)法1.組織(zǔzhī)搗碎機(jī)：

適用：動(dòng)植物組織二、破碎(pòsuì)方法原理：機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生剪切力的作用破細(xì)胞具體方法：2.勻漿器

適用：較柔軟、易分散的組織細(xì)胞3.研缽

適用：微生物（細(xì)菌）與植物細(xì)胞第十五頁，共九十二頁。㈡物理(wùlǐ)法1．超聲波破碎(pòsuì)2．滲透壓沖擊法：適用：處理胞壁較脆弱的微生物。細(xì)胞放在高滲溶液中，由于(yóuyú)滲透壓作用，細(xì)胞內(nèi)水分向外滲出，細(xì)胞發(fā)生收縮，當(dāng)達(dá)到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于(yóuyú)滲透壓發(fā)生突然變化，胞外的水分迅速滲入胞內(nèi)，使細(xì)胞快速膨脹而破裂第十六頁，共九十二頁。3．反復(fù)凍融法：-15℃～-20℃，適用：動(dòng)物材料將待破碎的細(xì)胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室溫(或40℃)迅速融化，如此反復(fù)凍融多次，由于細(xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞溶脹破碎。這種方法簡單方便，但要注意那些對溫度變化(biànhuà)敏感的蛋白質(zhì)不宜采用此法。4．急熱驟冷法：

85～90℃數(shù)分鐘，冰浴冷卻適用：細(xì)菌(xìjūn)及病毒中對熱不太敏感的物質(zhì)第十七頁，共九十二頁。㈢．化學(xué)法2．

表面活性劑法

破壞細(xì)胞膜，釋放(shìfàng)目的物（需與其它方法結(jié)合應(yīng)用）。

1．

溶劑處理(chǔlǐ)法：

丙酮、氯仿、甲苯等溶解胞膜上脂質(zhì)化合物，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞。第十八頁，共九十二頁。（四）酶解法(jiěfǎ)

2．

外加酶法

將細(xì)胞壁分解，使內(nèi)含物釋放出來。細(xì)菌：加溶菌酶（結(jié)合反復(fù)(fǎnfù)凍融或加EDTA）酵母：采用β-葡聚糖酶霉菌：添加幾丁質(zhì)酶植物材料：加纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶等。1．

自溶法保溫一定時(shí)間，通過(tōngguò)細(xì)胞本身的酶將細(xì)胞破壞。第十九頁，共九十二頁。例：外源蛋白(dànbái)在大腸桿菌中的積累蛋白0產(chǎn)物占菌體總蛋白/%外源蛋白的積累人胰島素50%形成包含體β-丙酰胺酶20%在細(xì)胞間區(qū)γ-人體干擾素25%形成包含體凝乳酶原形成包含體牛生長激素>30%形成包含體β-內(nèi)酰胺酶形成間區(qū)包含體人胰島素原5%~26%形成包含體三、包含(bāohán)體及其純化第二十頁，共九十二頁。包涵體（inclusionbodies），或包含體，是無定形的蛋白質(zhì)的聚集，不被任何膜所包圍。細(xì)胞破碎后，包涵體呈顆粒狀，致密，低速離心就可以沉淀。包涵體難溶于水中，在變性劑溶液（如鹽酸胍、脲）中才能溶解。在這些溶液中，溶解的蛋白質(zhì)呈變性狀態(tài)，即所有的氫鍵、疏水鍵全被破壞(pòhuài)，疏水側(cè)鏈完全暴露，但一級(jí)結(jié)構(gòu)和共價(jià)鍵不被破壞(pòhuài)。因此當(dāng)除去變性劑時(shí)，一部分蛋白質(zhì)可以自動(dòng)折疊成具有活性的正確構(gòu)型，這一折疊過程稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性。第二十一頁，共九十二頁。包涵體主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大多是基因表達(dá)產(chǎn)物(chǎnwù)。這些基因表達(dá)產(chǎn)物(chǎnwù)沒有生物活性。為此，欲獲得天然活性態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物(chǎnwù)，必需分離包涵體后，溶解包涵體并使其中的目標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。所以，包涵體的出現(xiàn)不僅增加了生化工程師生物分離設(shè)計(jì)的難度，也為生物化學(xué)家的蛋白質(zhì)折疊（proteinfolding）機(jī)理研究提出了新的課題。第二十二頁，共九十二頁。重組DNA技術(shù)為大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)提供了嶄新的途徑，開辟了現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展的新紀(jì)元。但是，人們在分離純化基因工程表達(dá)產(chǎn)物時(shí)遇到了意想不到的困難，很多利用大腸桿菌為宿主細(xì)胞的外源基因表達(dá)產(chǎn)物（如尿激酶、人胰島素、人生長激素、白細(xì)胞介素－６、人γ－干擾素等）不僅不能分泌到細(xì)胞外、而且在細(xì)胞內(nèi)凝聚(níngjù)成沒有生物活性的固體顆粒－包涵體（inclusionbodiesIBs)。第二十三頁，共九十二頁。2、包含(bāohán)體的構(gòu)成基因表達(dá)(biǎodá)產(chǎn)物的一級(jí)結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的，所以沒有生物活性。分離包含體后，需使目標(biāo)(mùbiāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。（蛋白質(zhì)折疊）包含體主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大多是基因表達(dá)產(chǎn)物。第二十四頁，共九十二頁。3、包含(bāohán)體特點(diǎn):是無定形的蛋白質(zhì)的聚集(jùjí)，不被任何膜所包圍。包含(bāohán)體難溶于水，易溶于變性劑（如鹽酸胍、脲）。細(xì)胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密，離心（5000-20000g15min）就可以沉淀。第二十五頁，共九十二頁。幾種常見的工藝(gōngyì)路線（一）機(jī)械(jīxiè)破碎(高壓勻漿、高速珠磨）差速離心提取(tíqǔ)出包含體加變性劑溶解除變性劑復(fù)性基因工程包含體的純化方法第二十六頁，共九十二頁。路線(lùxiàn)1的特點(diǎn)

特點(diǎn):用離心法將包含體與細(xì)胞碎片和可溶性蛋白質(zhì)分開，擺脫了大量的雜蛋白、核酸、熱原、內(nèi)毒素等雜質(zhì)，使后面的分離純化簡單(jiǎndān)。

缺點(diǎn):要經(jīng)過幾次離心才能除去大部分的細(xì)胞碎片，加工時(shí)間較長?；蚬こ贪?bāohán)體的純化方法第二十七頁，共九十二頁。幾種(jǐzhǒnɡ)常見的工藝路線（二）機(jī)械(jīxiè)破碎膜分離除可溶性蛋白(dànbái)加變性劑溶解包含體除變性劑復(fù)性基因工程包含體的純化方法第二十八頁，共九十二頁。路線(lùxiàn)2的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：應(yīng)用了膜分離技術(shù)(jìshù)，用微孔膜除去可溶性蛋白質(zhì)，封閉式操作，不污染環(huán)境也不受環(huán)境污染。基因工程包含(bāohán)體的純化方法缺點(diǎn)：細(xì)胞碎片和包含體一起被膜擋住，難以分開；而且膜的堵塞和濃差極化常導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)的滯留。第二十九頁，共九十二頁。幾種(jǐzhǒnɡ)常見的工藝路線（三）化學(xué)(huàxué)破碎（加變性劑）離心除細(xì)胞(xìbāo)碎片除變性劑復(fù)性基因工程包含體的純化方法第三十頁，共九十二頁。路線(lùxiàn)3特點(diǎn)：基因工程(jīyīngōngchéng)包含體的純化方法優(yōu)點(diǎn)：化學(xué)法破碎，所采用的試劑(shìjì)既可以破碎又可以溶解包含體，將兩道工序和為一道，節(jié)省了設(shè)備和時(shí)間，比前兩者更適合于實(shí)驗(yàn)室操作。缺點(diǎn)：所有的可溶性雜質(zhì)都沒有除去，混雜在產(chǎn)物中間，給后續(xù)分離帶來困難。第三十一頁，共九十二頁。一、概述(ɡàishù)第四節(jié)萃取(cuìqǔ)1、基本概念及分類概念：萃取是利用(lìyòng)溶質(zhì)在互不混溶的兩相之間分配系數(shù)的不同而使溶質(zhì)得到純化或濃縮的技術(shù)。第三十二頁，共九十二頁。液-固萃取(cuìqǔ)液-液萃取(cuìqǔ)化學(xué)(huàxué)萃取物理萃取雙水相萃取超臨界萃取萃取原理參與溶質(zhì)分配的兩相不同分類：第三十三頁，共九十二頁。概念：用某種溶劑(róngjì)把有用物質(zhì)從固體原料中提取到溶液中的過程稱為固-液萃取，也稱浸取或浸出。應(yīng)用：用溫水從甜菜中提取糖，用有機(jī)溶劑從大豆(dàdòu)、花生等油料作物中提取食用油，用水或有機(jī)溶劑從植物中提取藥物、香料或色素等。液-固萃取(cuìqǔ)第三十四頁，共九十二頁。用溶劑從溶液中抽提物質(zhì)(wùzhì)叫液-液萃取，也稱溶劑萃取。經(jīng)典的液-液萃取指的是有機(jī)溶劑萃取液-液萃取(cuìqǔ)有機(jī)溶劑萃取法廣泛應(yīng)用于抗生素、有機(jī)酸、維生素、激素等發(fā)酵產(chǎn)物工業(yè)規(guī)模(guīmó)的提取上。應(yīng)用比化學(xué)沉淀法分離程度高；比離子交換法選擇性好、傳質(zhì)快；比蒸餾法能耗低；生產(chǎn)能力大、周期短、便于連續(xù)操作、易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制優(yōu)點(diǎn)第三十五頁，共九十二頁。溶劑萃取法和其他新型(xīnxíng)分離技術(shù)相結(jié)合，產(chǎn)生了一系列新型分離技術(shù)：超臨界流體萃?。⊿upercriticalfluidextraction）反膠團(tuán)萃取（Reversedmicelleextraction）雙水相萃取技術(shù)（Partitionoftwoaqueousphasesystem）液-液萃取(cuìqǔ)用于高品質(zhì)的天然物質(zhì)、胞內(nèi)物質(zhì)（胞內(nèi)酶、蛋白質(zhì)、多肽、核酸等）的分離(fēnlí)提取上。第三十六頁，共九十二頁。根據(jù)(gēnjù)萃取原理分類的基本概念化學(xué)萃取利用脂溶性萃取劑與溶質(zhì)之間發(fā)生(fāshēng)化學(xué)反應(yīng)生成脂溶性復(fù)合分子實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)向有機(jī)相分配的過程。物理萃取溶質(zhì)根據(jù)相似相溶的原理(yuánlǐ)在兩相間達(dá)到分配平衡而進(jìn)行萃取的分離過程。第三十七頁，共九十二頁。2、萃取技術(shù)的操作(cāozuò)特點(diǎn)①萃取過程具有選擇性②能與其他(qítā)純化步驟相配合③適用于各種不同的規(guī)模④傳質(zhì)速度快，生產(chǎn)周期短，便于連續(xù)操作

第三十八頁，共九十二頁。3、萃取需要考慮下列(xiàliè)問題①生物系統(tǒng)的錯(cuò)綜復(fù)雜(cuòzōngfùzá)和多組分特性②產(chǎn)物(chǎnwù)的不穩(wěn)定性③相分離性能第三十九頁，共九十二頁。把目標(biāo)物質(zhì)從第一個(gè)液相中依靠更強(qiáng)大的溶解力抽提到第二個(gè)液相中。物質(zhì)的溶解和相似相溶原理。萃取是通過溶質(zhì)(róngzhì)在兩個(gè)液相之間的竟?fàn)幮匀芙猓ǚ峙洌┒鴮?shí)現(xiàn)的。二、溶劑萃取技術(shù)(jìshù)（液-液萃取）第四十頁，共九十二頁。影響萃取(cuìqǔ)操作的因素：溫度(wēndù)pH值鹽分溫度↑互溶性增大；溫度↓產(chǎn)物穩(wěn)定性提高，粘度(zhāndù)增加，擴(kuò)散性能減小。影響分配系數(shù)，影響物質(zhì)解離情況無機(jī)鹽類如硫酸銨、氯化鈉等一般可降低產(chǎn)物在水中的溶解度而使其更易于轉(zhuǎn)入有機(jī)溶劑相中，另一方面還能減小有機(jī)溶劑在水相中的溶解度。鹽分↑分配系數(shù)↑第四十一頁，共九十二頁。d．乳化(rǔhuà)分散(fēnsàn)非均相一種(yīzhǒnɡ)另一種乳劑均相（溶液）乳化即水或有機(jī)溶劑以微小液滴分散在有機(jī)相或水相中的現(xiàn)象。第四十二頁，共九十二頁。乳化劑類型(lèixíng)乳狀液可分為兩大類型水包油，O/W，油分散在水中油包水，W/O，水分散在油中O/W(水包油型)W/O(油包水型)第四十三頁，共九十二頁。（親憎平衡(pínghéng)值）HLBHLB數(shù)即親水與親油平衡(pínghéng)程度，HLB數(shù)越大，親水性越強(qiáng)，形成O/W型乳濁液，HLB數(shù)越小，親油性越強(qiáng)，形成W/O型乳濁液。第四十四頁，共九十二頁。乳化(rǔhuà)與去乳化(rǔhuà)在發(fā)酵液中，蛋白質(zhì)是引起乳化(rǔhuà)的最重要的表面活性物質(zhì)。

由蛋白質(zhì)引起的乳化多為水包油型（O/W）。乳化帶來的問題：有機(jī)相和水相分相困難，出現(xiàn)(chūxiàn)夾帶。第四十五頁，共九十二頁。破乳的方法(fāngfǎ)：1.加熱(jiārè)破乳升溫加速乳狀液液珠的布朗運(yùn)動(dòng)使絮凝速率加快，同時(shí)使界面粘度迅速降低(jiàngdī)，使聚結(jié)速率加快，有利于膜的破裂。2.高壓電破乳高壓電場的破乳較復(fù)雜不能只看作擴(kuò)散雙電層的破壞，在電場下液珠質(zhì)點(diǎn)可排成一行，呈珍珠項(xiàng)鏈?zhǔn)?，?dāng)電壓升到某一值時(shí)，聚結(jié)過程在瞬間完成。第四十六頁，共九十二頁。3.過濾(guòl(fā)ǜ)破乳當(dāng)乳狀液經(jīng)過一個(gè)(yīɡè)多孔性介質(zhì)時(shí)，由于油和水對固體潤濕性的差別，也可引起破乳。4.化學(xué)(huàxué)破乳化學(xué)破乳的原則是破壞吸附在界面上的乳化劑，使其失去乳化能力。常用的是使用破乳劑。破乳劑也是一種表面活性劑，有很高的表面活性，能將界面上原來存在的乳化劑頂替走；但破乳劑分子一般具有分支結(jié)構(gòu)，不能在界面上緊密排列成牢固的界面膜，從而使乳狀液的穩(wěn)定性大大降低。第四十七頁，共九十二頁。5.電解質(zhì)破乳對于稀的乳狀液，起穩(wěn)定作用的是擴(kuò)散(kuòsàn)雙電層，加入電解質(zhì)可破壞雙電層，也能使乳狀液聚沉第四十八頁，共九十二頁。三反膠束萃取(cuìqǔ)

（反膠團(tuán)萃取(cuìqǔ)）第四十九頁，共九十二頁。1、基本(jīběn)術(shù)語膠束(micelles):

向水中加入表面活性劑，水溶液的表面張力隨[S]增大而下降。當(dāng)[S]達(dá)到一定值后，溶液的表面張力不再隨表面活性劑濃度的增大而降低(jiàngdī)。臨界膠束濃度(criticalmicelleconcentration,CMC):

S在水溶劑中形成膠束的最低濃度。第五十頁，共九十二頁。反膠束(reversemicelles):若向有機(jī)溶劑中加入(jiārù)一定濃度S和水，在有機(jī)溶劑中所會(huì)形成內(nèi)部含少量水的膠束。微水相或“水池”(waterpool)：反膠束內(nèi)溶解的水。第五十一頁，共九十二頁。第五十二頁，共九十二頁。2 反膠束的溶解(róngjiě)作用微水池溶解(róngjiě)和分離作用：

反膠團(tuán)的微水池的水可溶解氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等生物分子,為生物分子提供易于生存的親水微環(huán)境.因此,反膠團(tuán)萃取可用于氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等生物分子的分離純化，特別是蛋白質(zhì)類生物大分子。第五十三頁，共九十二頁。2 反膠束的溶解(róngjiě)作用溶解推動(dòng)力A 靜電作用：

理論上,當(dāng)溶質(zhì)所帶電荷與表面活性劑相反時(shí),由于靜電引力的作用,溶質(zhì)易溶于反膠團(tuán),溶解率或分配系數(shù)(xìshù)較大,反之,則不能溶解到反膠團(tuán)相中,左圖為pH值對不同蛋白質(zhì)的溶解率急劇變化,當(dāng)pH<7,即在帶正電荷的pH范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的溶解率接近100%,說明靜電相互作用對蛋白質(zhì)的反膠團(tuán)萃取起決定性作用。第五十四頁，共九十二頁。2、反膠束的溶解(róngjiě)作用B 空間相互作用

鹽濃度增大對反膠團(tuán)相產(chǎn)生脫水效應(yīng),含水率W0隨鹽濃度的增大而降低,反膠團(tuán)直徑減小,空間排阻作用增大,pro溶解下降.如，AOT/異辛烷系統(tǒng)的含水率與I-0.5成正比。圖還示：AOT/異辛烷系統(tǒng)的含水率與AOT濃度(nóngdù)無關(guān),這是多數(shù)反膠團(tuán)系統(tǒng)的共性.第五十五頁，共九十二頁。3、反膠束萃取(cuìqǔ)的影響因素1)pHvalueAOT=二-(2-已基已基)琥珀酸酯磺酸鈉。第五十六頁，共九十二頁。2)鹽濃度鹽濃度W0S&ProZ選擇性第五十七頁，共九十二頁。3)、鹽離子(lízǐ)的種類第五十八頁，共九十二頁。4)蛋白質(zhì)分子量M第五十九頁，共九十二頁。5)、表面(biǎomiàn)活性劑SA 種類B [S]第六十頁，共九十二頁。6)助表面(biǎomiàn)活性劑第六十一頁，共九十二頁。4、應(yīng)用(yìngyòng)1)蛋白質(zhì)分離(fēnlí)第六十二頁，共九十二頁。2)胞內(nèi)酶的提取(tíqǔ)第六十三頁，共九十二頁。四、超臨界流體(liútǐ)萃取

SupercriticalFluidExtraction第六十四頁，共九十二頁。簡介(jiǎnjiè)：超臨界流體萃取(SCF)是20世紀(jì)70年代后期迅速發(fā)展起來(qǐlái)的一種新興的萃取分離技術(shù)，是利用超臨界流體作為萃取劑，對物質(zhì)進(jìn)行溶解和分離的過程。超臨界流體具有氣體和液體之間的性質(zhì)，且對許多物質(zhì)均具有很強(qiáng)的溶解能力，分離速率遠(yuǎn)比液體萃取快，可以實(shí)現(xiàn)高效的分離過程。第六十五頁，共九十二頁。超臨界流體(liútǐ)的發(fā)展

1822年，首次報(bào)道1879年，發(fā)現(xiàn)超臨界流體(liútǐ)對固體有溶解能力1970年從咖啡豆提取咖啡因1992年，首先報(bào)道了超臨界聚合反應(yīng)第六十六頁，共九十二頁。（一）、超臨界流體的萃取(cuìqǔ)的原理1.流體的臨界特征氣相、液相、固相三相成平衡態(tài)共存(gòngcún)的點(diǎn)叫三相點(diǎn)。液、氣兩相成平衡狀態(tài)的點(diǎn)叫臨界點(diǎn)。在臨界點(diǎn)是所要求的溫度和壓力分別稱為臨界溫度（Tc）和臨界壓力（pc）。穩(wěn)定的純物質(zhì)及由其組成的固定組分混合物具有固有的臨界狀態(tài)點(diǎn)。第六十七頁，共九十二頁。超臨界流體(liútǐ)(SCF)第六十八頁，共九十二頁。2.超臨界流體(liútǐ)的特征超臨界流體(SCF)是處于臨界溫度和臨界壓力以上的非凝縮性的高密度流體。超臨界流體沒有明顯的氣-液界面，既不是氣體，也不是液體(yètǐ)，是一種氣-液不分的狀態(tài)，性質(zhì)介于氣體和液體(yètǐ)之間。流體處于超臨界狀態(tài)時(shí)，其密度接近液體(yètǐ)密度，并且隨流體壓力和溫度的變化發(fā)生十分明顯的變化。第六十九頁，共九十二頁。超臨界流體(liútǐ)的性質(zhì)

物理特征密度（g/cm3）粘度（g/cm/s）擴(kuò)散系數(shù)（cm2/s）氣體（0.6-2）*10-3（1-4）*10-40.1-0.4)*10-2液體0.6-1.6（0.2-3）*10-2（0.2-2)*10-5SCF0.2-0.9（1-9）*10-4（0.2-0.7)*10-3第七十頁，共九十二頁。超臨界流體(liútǐ)的主要特性

密度類似液體壓力和溫度的變化均可改變相變粘度,擴(kuò)散系數(shù)接近于氣體SCF的介電常數(shù)，極化率和分子行為與氣液兩相均有著(yǒuzhe)明顯的差別第七十一頁，共九十二頁。溶質(zhì)在超臨界流體(liútǐ)中的溶解度隨超臨界流體(liútǐ)密度的增大而增大。2.超臨界流體(liútǐ)的特征超臨界流體萃取正是利用這種性質(zhì)，在較高壓力下，將溶質(zhì)(róngzhì)溶解于流體中，然后降低流體溶液的壓力或升高流體溶液的溫度，使溶解于超臨界流體中的溶質(zhì)因密度下降，溶解度降低而析出，從而實(shí)現(xiàn)特定溶質(zhì)的萃取。第七十二頁，共九十二頁?？勺鳛?zuòwéi)超臨界流體的物質(zhì)：二氧化碳、一氧化亞氮、六氟化硫、乙烷、庚烷、氨等。第七十三頁，共九十二頁。常用的流體(liútǐ)介質(zhì)

二氧化碳：臨界溫度(línjièwēndù)：31.1℃；臨界壓力：7.2MPa臨界條件容易達(dá)到、化學(xué)性質(zhì)不活潑、無色無味無毒、安全性好、價(jià)格便宜、純度高、容易獲得等優(yōu)點(diǎn)第七十四頁，共九十二頁。3.超臨界流體萃取特點(diǎn)(tèdiǎn)(優(yōu)點(diǎn))①萃取和分離合二為一②壓力和溫度都可以成為調(diào)節(jié)萃取過程的參數(shù)③萃取溫度低④臨界CO2流體常態(tài)(chángtài)下是氣體，無毒⑤超臨界流體的極性可以改變第七十五頁，共九十二頁。4.萃取(cuìqǔ)技術(shù)的應(yīng)用舉例

生物活性物質(zhì)和生物制品的提取

CO2萃取技術(shù)主要應(yīng)用(yìngyòng)于有害成分成分的脫除、有效成分的提取、食品原料的處理等幾個(gè)方面。例如：用SFE從咖啡、茶中脫咖啡因；啤酒花萃取；從植物中萃取風(fēng)味物質(zhì)；從各種動(dòng)植物中萃取各種脂肪酸、提取色素；從奶油和雞蛋中去除膽固醇等。第七十六頁，共九十二頁。例1脫咖啡因超臨界流體(liútǐ)萃取技術(shù)得到最早大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用的是天然咖啡豆的脫咖啡因。用SF-CO2法從咖啡豆中脫出(tuōchū)咖啡因工藝流程

第七十七頁，共九十二頁。例2.啤酒花萃取(cuìqǔ)普通的有機(jī)溶劑萃取法制取的啤酒花萃取液為暗綠色膏狀（即啤酒花浸膏），含有(hányǒu)許多不純物質(zhì)，而且還殘留有機(jī)溶劑。液體CO2和SC-CO2抽提的酒花萃取物顏色為微欖綠，在20～25MPa，40℃萃取4h，浸膏得率可14％，硬樹脂萃取率僅為5.2%，而且不萃取農(nóng)藥，芳香成分不氧化。第七十八頁，共九十二頁。例3.其他從工業(yè)性應(yīng)用的萃取分離角度，SC-CO2萃取技術(shù)在醫(yī)藥、食品、化妝品等工業(yè)領(lǐng)域中有較寬的應(yīng)用面。①醫(yī)藥工業(yè)

酶、維生素等的精制回收動(dòng)植物中藥效成分的萃取（生物堿、生育(shēngyù)酚、EPA、DHA、鴉片、嗎啡、精油等）醫(yī)藥品原料的濃縮、精煉、脫溶劑酵母、菌體產(chǎn)物的萃取第七十九頁，共九十二頁。②食品工業(yè)

植物油脂的萃取動(dòng)物(dòngwù)油脂的萃取奶脂中脫除膽固醇等食品脫脂咖啡、紅茶脫咖啡因、酒花萃取香辛料萃取植物色素的萃取共沸混合物分離，含醇飲料的軟化脫色、脫臭，煙草脫尼古丁第八十頁，共九十二頁。③化妝品及香料工業(yè)天然香料萃取，合成香料的分離和精制(jīngzhì)化妝品原料萃取，精制（界面活性劑、脂肪酸脂、甘油單酯等）第八十一頁，共九十二頁。1896年Beijerinck觀察到當(dāng)把明膠與瓊脂或把明膠和可溶性淀粉(diànfěn)的水溶液混合時(shí)，先得到一混濁不透明的溶液，隨后分成兩相，上相含有大部分明膠，下相含有大部分瓊脂(或可溶性淀粉(diànfěn))。再如下圖中，2.2％的葡聚糖水溶液與等體積的0.72％甲基纖維素鈉的水溶液相混合并靜置后，可得到兩個(gè)粘稠的液層。葡聚糖與甲基纖維素鈉的雙水相體系(tǐxì)

五、雙水相萃取(cuìqǔ)第八十二頁，共九十二頁。有機(jī)(yǒujī)溶劑萃取的不足：許多蛋白質(zhì)都有極強(qiáng)的親水性，不溶于有機(jī)溶劑；蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑相中易變性失活。親水性聚合物加入水中，形成兩相，在這兩相中，水分都占大比例（85～95％），蛋白質(zhì)在兩相中不會(huì)失活，且以一定(yīdìng)比例分配于兩相中。雙水相萃取(cuìqǔ)的優(yōu)點(diǎn)使固液分離和純化兩個(gè)步驟同時(shí)進(jìn)行，一步完成；適合熱敏物質(zhì)的提取，主要是胞內(nèi)酶；第八十三頁，共九十二頁。（一）、雙水相體系(tǐxì)的組成雙聚物：聚合物-低相對(xiāngduì)分子質(zhì)量的化合物：PEG/DEX、聚乙二醇/聚乙烯醇(jùyǐxīchún)、聚乙烯醇(jùyǐxīchún)/甲基纖維素、聚丙二醇/葡聚糖、聚丙二醇/甲氧基乙二醇等PEG/磷酸鉀、PEG/磷酸胺、PEG/硫酸鈉、PEG/葡萄糖等、常用聚合物：聚乙二醇－葡聚糖聚乙二醇－無機(jī)鹽系統(tǒng)無毒原則第八十四頁，共九十二頁。（二）、雙水相體系形成(xíngchéng)的原因雙水相體系的成因是聚合物之間的不相溶性，即聚合物分子的空間阻礙作用，相互間無法滲透，從而分為兩相。一般認(rèn)為(rènwéi)，只要兩種聚合物水溶液的水溶性有所差異，混合時(shí)就可發(fā)生相分離，并且水溶性差別越大，相分離的傾向越大。2.

加入(jiārù)鹽分，由于鹽析作用，聚合物與鹽類溶液也能形成兩相。第八十五頁，共九十二頁。水溶液中聚合物的疏水性(shuǐxìng)依下列次序遞增：

葡萄糖硫酸鹽＜甲基葡萄糖＜葡萄糖＜羥丙基葡聚糖＜甲基纖維素＜聚乙烯醇＜聚乙二醇＜聚丙三醇，這種疏水性的差別對目的產(chǎn)物與相的相互作用是重要的。同一聚合物的疏水性隨分子量增加而增加。（三）、影響