細(xì)胞工程動物染色體工程

關(guān)于細(xì)胞工程動物染色體工程第1頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五ChromosomesandInheritanceSincegenesarecarriedonchromosomes,knowledgeofchromosomenumberandstructurehasfar-reachingimplicationsforbasicgenetics,humanhealth,andevolution.Anormalhumanmalekaryotype.第2頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五Chromosomestructure第3頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五ChangesinChromosomeNumberandStructureChangesinchromosomenumberandstructureareimportantforhealthandevolution.Downsyndromeiscausedbyachangeinchromosomenumber.第4頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五染色體變異染色體數(shù)變異一種是體細(xì)胞內(nèi)以染色體組為基數(shù)進(jìn)行的整倍性變化，這產(chǎn)生的變異導(dǎo)致多倍體或單倍體；另一種是染色體組內(nèi)的個別染色體數(shù)目有所增減，使細(xì)胞內(nèi)的染色體數(shù)目不是基數(shù)的的完整倍數(shù)，因此被稱為非整倍體。第5頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五染色體變異染色體結(jié)構(gòu)變異染色體易位：一個染色體上某一區(qū)段與另一非同源染色體上的區(qū)段發(fā)生互換。染色體缺失：染色體的某一區(qū)段及其帶有的基因一起丟失染色體倒位：染色體上某一區(qū)段連同它帶有的基因順序發(fā)生180度倒轉(zhuǎn)。染色體復(fù)制：一個染色體上增加了相同的某個區(qū)段。第6頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五Thereare4typesofchromosomestructuralchange–allofthemassociatedwithhumandisordersChromosomeStructuralChanges易位缺失倒位復(fù)制第7頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五什么是染色體工程？定義：是指人們按照預(yù)先的設(shè)計，消減、添加或替換同種或異種動物細(xì)胞染色體的技術(shù)。Rich和Khush于1966年最先提出這一概念。第8頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五第一節(jié)多倍體誘導(dǎo)（polyploidyinduction）第二節(jié)雌核發(fā)育（gynogenesis）雄核發(fā)育（androgenesis）性別控制（sexcontrol）第三節(jié)染色體片段轉(zhuǎn)移

(transferofchromosomefragment)染色體特定位點重組

(region-specificrecombinationofchromosome)

第9頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五第一節(jié)動物多倍體誘導(dǎo)多倍體（polyploid）Winkler(1916年)首先使用的，它是指體細(xì)胞中含有三個或更多染色體組的個體。在高等植物中相當(dāng)多，但動物中卻少得多。60年代發(fā)現(xiàn)一種美洲角蛙是四倍體動物，之后陸續(xù)在低等脊椎動物中發(fā)現(xiàn)許多多倍體動物。銀鯽第10頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五多倍體第11頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五由于多倍體動物生長速度快，成活率高及抗病能力強等特點，所以人工誘導(dǎo)多倍體、改善動物經(jīng)濟(jì)性狀倍受重視。魚類和貝類都是重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物，多為體外產(chǎn)卵、體外受精和體外發(fā)育，因而人工誘導(dǎo)多倍體的研究在魚類和貝類已取得很大進(jìn)展。三倍體太平洋牡蠣第12頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五(一)人工誘導(dǎo)多倍體的機制人工誘導(dǎo)染色體加倍主要有抑制受精卵第二極體排放(三倍體)或抑制受精卵的第一次卵裂(四倍體)抑制第一極體的排放-很少采用，魚類不成功，貝類畸形率高。第13頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五1stpolarbody2ndpolarbody第14頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五精子入卵時卵子所處的時相是不同的貽貝、玻璃海鞘和毛翼蟲等。大多數(shù)脊椎動物和文昌魚等如海濱蛤、海綿、蛔蟲、沙蠶如海膽和腔腸動物第15頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五三倍體誘導(dǎo)第16頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五(二)人工誘導(dǎo)多倍體的方法1、生物學(xué)方法

主要采用雜交方法，尤其是種間雜交的方法。雌性草魚2n=48與雄性三角魴2n=48雜交獲得子一代染色體數(shù)目為72的草魴雜種三倍體，其中草魚提供了二倍數(shù)目的染色體48，三角魴提供了單倍數(shù)目的染色體24。為什么種間雜交會導(dǎo)致草魚第二極體不排出，從而導(dǎo)致多倍體產(chǎn)生？第17頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五2、物理學(xué)方法⑴溫度休克法

冷休克法0-5℃

熱休克法30℃左右必須要優(yōu)化的三個因素：處理時刻（即處理開始時間，一般從受精開始算起）、處理持續(xù)時間和處理溫度。一般說來，冷水性魚類采用熱休克，而溫水性魚類如鯉科和鯛科魚類采用冷休克效果好。第18頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五2、物理學(xué)方法⑵靜水壓法

較高的水靜壓650kg/cm2，誘導(dǎo)率高90-100%，時間短3~5min，損傷小，成活率高。需要專門設(shè)備如水壓機，成本高；樣品室容量有限，不適于大規(guī)模生產(chǎn)。⑶高鹽高堿法

高pH值或高鹽的條件，尚待完善。

第19頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五3、化學(xué)方法秋水仙堿(colchicine)：可以抑制細(xì)胞分裂中紡綞絲的形成，因而抑制有絲分裂。細(xì)胞松弛素(cytochalasinB)：能抑制肌動蛋白聚合成微絲，從而抑制細(xì)胞質(zhì)分裂。聚乙二醇(polyethyleneglycol)其他如麻醉劑(N2O和CHClF2)藥品有毒性，且多嵌合體，很少被使用。

第20頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五（三）多倍體倍性鑒定原因：所處理的受精卵不能百分之百地成為多倍體，且常表現(xiàn)為嵌合體。直接方法：染色體計數(shù)和DNA含量測定等。間接方法：核體積測量法(細(xì)胞核大小與染色體數(shù)目成正比)、蛋白質(zhì)電泳、生化分析和形態(tài)學(xué)檢查等。第21頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五染色體計數(shù)：準(zhǔn)確、直接的方法。DNA含量測定：流式細(xì)胞儀。核體積測量：二倍體/三倍體核體積之比為1:1.5，二倍體與四倍體的核體積之比為1:1.74。蛋白質(zhì)電泳：生化分析：如在關(guān)東系銀鯽中，三倍體紅血球的丙酮酸激酶的含量含著高于二倍體。第22頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五多倍體動物的生活力及生長能力。許多誘導(dǎo)的多倍體動物如兩棲類、魚類、貝類等都具有良好的生存力和生長率。誘導(dǎo)三倍體可以增加種間雜種的成活率，三倍體種間雜種可以比二倍體雜種成活得更好一些。（四）多倍體動物的應(yīng)用前景第23頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五三倍體的優(yōu)勢三倍體性腺不育：不需要消耗能量用于性腺的發(fā)育，避免了繁殖季節(jié)的肉質(zhì)下降、生長停滯和死亡率增高，縮短了養(yǎng)殖周期，降低了養(yǎng)殖成本。利用三倍體的不育性來控制養(yǎng)殖密度，防止品種混雜和退化。第24頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五三倍體的缺點三倍體的高度不育不利于種質(zhì)保存，每次都需重新誘導(dǎo)。培育四倍體，性成熟后與二倍體雜交，獲得不育的三倍體種苗，是當(dāng)前的熱門課題。第25頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五多倍體動物的其它經(jīng)濟(jì)性狀三倍體虹鱒的魚肉質(zhì)量確實優(yōu)于二倍體，其抗傳染性造血器官壞死病毒能力較強；三倍體大西洋鮭耐低氧，故可適用于低氧環(huán)境養(yǎng)殖；三倍體香魚對聲音和光線的感受能力比二倍體香魚略顯遲鈍，適于在噪音較大的環(huán)境中放養(yǎng)。第26頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五第二節(jié)雌、雄核發(fā)育和性別控制意義：產(chǎn)生單性種群，在純系建立、性別控制、遺傳機制研究等方面具有重要的理論和實際意義。（一）雌核發(fā)育(Gynogenesis)定義俗稱假受精，指精子雖然正常地進(jìn)入卵內(nèi)，激動卵子，但其細(xì)胞核并未參與胚胎發(fā)育，而是很快消失，胚胎發(fā)育僅在母體遺傳的控制下進(jìn)行，因而雌核發(fā)育個體完全表現(xiàn)母本性狀，其基因型也與母本相同。第27頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五雌核發(fā)育不同于孤雌生殖它需要同種或異種精子進(jìn)入卵子，來啟動胚胎發(fā)育。同型雌性配子，后代都是雌性個體，異型雌性配子，后代雌性雄性都有。蜜蜂進(jìn)行孤雌生殖產(chǎn)生的單倍體卵發(fā)育成雄蜂，二倍體受精卵發(fā)育成雌蜂。第28頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五（二）人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育可分為兩步：雌核發(fā)育的誘導(dǎo)雌核發(fā)育卵子的二倍體化

第29頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五1、雌核發(fā)育的誘導(dǎo)即采用生物、物理或化學(xué)的方法使精子的遺傳物質(zhì)失活，然后用失活精子與卵子受精，啟動卵子的雌核發(fā)育。精子雖然入卵，但并不會和雌原核融合，精原核最終降解消失，不參與胚胎發(fā)育，只起啟動卵子胚胎發(fā)育的作用。第30頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五第31頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五生物學(xué)方法：遠(yuǎn)緣精子受精，不與卵原核融合。異種精子可能提供中心粒物理學(xué)方法：

-射線、-射線或紫外線照射精子，使DNA分子形成胸腺嘧啶二聚體。玻璃針刺激魚卵或用弱電流來處理魚卵。化學(xué)方法：甲基硫酸乙烷（EMS）、咔碇黃、噻嗪、乙烯脲等處理精子。第32頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五2、雌核發(fā)育卵子的二倍體化含有單倍染色體組的受精卵，胚胎不能正常發(fā)育--單倍體綜合癥。必須使雌核發(fā)育的卵子染色體二倍體化，才能使胚胎正常發(fā)育。誘導(dǎo)染色體加倍的方法和多倍體誘導(dǎo)相同：一是抑制第二極體的排放，二是抑制第一次卵裂。

第33頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五（三）雌核發(fā)育的鑒別1、染色體數(shù)目和染色體組型分析法--準(zhǔn)確2、遺傳標(biāo)記法--標(biāo)記基因和著絲粒的距離3、表型特征鑒別法第34頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五“中科三號”利用銀鯽雙重-雌核和有性生殖方式，從高體型(D系)異育銀鯽(♀)與平背型(A系)異育銀鯽(♂)交配所產(chǎn)后代中選育出來，再經(jīng)異精雌核生殖培育而來的異育銀鯽新品種。第35頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五二、雄核發(fā)育androgenesis定義：是指卵子經(jīng)過射線照射等處理，使其遺傳失活，再與正常精子受精，然后采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ咕拥娜旧w加倍為二倍體，發(fā)育成完全父本性狀的純合個體。意義：純合體，在遺傳育種中具有重要的理論和實際意義，種質(zhì)保存。研究較少第36頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五三、動物的性別控制定義：是指通過人為地干預(yù)或操作，使動物按照人們的設(shè)計繁殖出所需性別后代的技術(shù)。動物性別控制在畜牧業(yè)、家禽養(yǎng)殖業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和養(yǎng)蠶業(yè)等方面都有重要的經(jīng)濟(jì)意義。第37頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五(一)性別決定的遺傳類型1雄性異配子型XY型和XO型2雌性異配子型ZW型和ZO型3雄性單倍體型如蜜蜂4內(nèi)在環(huán)境決定型如蚯蚓、玉米和蘋果等。5外在環(huán)境決定型如蝌蚪

20℃，雌雄各半；30℃，全雄。染色體組成不變。第38頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五(二)家畜性別控制的途徑1.X、Y精子分離技術(shù)2.胚胎性別鑒定技術(shù)3.控制受精條件調(diào)節(jié)陰道的酸堿度。

偏酸雌性；偏堿雄性。在精液中加入激素或睪丸、胎盤、腦垂體等組織的抽提物。第39頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五(三)魚類、兩棲類和爬行類的性別控制途徑控制發(fā)育條件性反轉(zhuǎn)人工雌核和雄核發(fā)育種間雜交三倍體不育第40頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五1、控制發(fā)育條件發(fā)育溫度蝌蚪性別。鱷魚：無性染色體。30℃,全雌；34℃以上,全雄；32℃,雌/雄之比為1:5；大于36℃，低于26℃下,胚胎死亡。第41頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五產(chǎn)卵地點揚子鱷：潮濕陰暗處，較多雌體；陽光暴曬處，較多雄體。1、控制發(fā)育條件第42頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五2、性反轉(zhuǎn)魚類：投喂雌激素或雄激素，性別改變。但染色體沒有改變。

將性反轉(zhuǎn)法和交配技術(shù)以及雌核發(fā)育技術(shù)結(jié)合起來培育全雌或全雄魚。第43頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五一、染色體片段轉(zhuǎn)移技術(shù)定義：指通過顯微注射法將外源染色體片段注入受體胚胎中，獲得轉(zhuǎn)染色體動物(Transomics)的技術(shù)。方法：顯微切割特定的染色體片段，然后注入受體動物受精卵中，并可在受體動物中表達(dá)該染色體片段的性狀。不完全雌核發(fā)育也可以將外源染色體片段導(dǎo)入受體動物體內(nèi)。不需經(jīng)基因重組構(gòu)建載體可轉(zhuǎn)移超大型外源DNA。

第三節(jié)染色體片段轉(zhuǎn)移和特定位點重組技術(shù)第44頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五二、染色體特定位點重組技術(shù)能夠在特定位點誘發(fā)染色體的各種重排。該技術(shù)與小鼠胚胎干細(xì)胞技術(shù)以及基因打靶技術(shù)相結(jié)合，成為染色體工程中的一個新的亮點。第45頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五第46頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五構(gòu)建含有一段同源序列（與靶基因）的載體。neor基因：新霉素抗性基因，正選擇作用，同源序列內(nèi)部。HSV-tk基因：皰疹病毒胸苷激酶，負(fù)選擇作用，同源序列之外。5’3’neorHSV-tk同源序列同源序列同源重組第47頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五第48頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五Positive-negative-selection

正負(fù)雙向選擇

應(yīng)用G418正向選擇發(fā)生重組事件后將neo’基因?qū)牖蚪M的ES細(xì)胞;反向選擇是根據(jù)同源重組發(fā)生時，載體末端的HSV-tk基因?qū)⒈蝗コ?，在Ganciclovir存在時能存活，相反隨機整合者，由于HSV一tk的存在而被Ganciclovir殺死，從而起到很高效的選擇作用，富集了同源重組這一小概率事件，使基因打靶操作更為有效。第49頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五第50頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五第51頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五Cre-loxP重組系統(tǒng)

Cre-loxPrecombinationsystem）Cre重組酶來源于P1噬菌體。作用特點：

在大腸桿菌體內(nèi)或體外，都能啟動DNA分子間或分子內(nèi)的聯(lián)合與重組；

重組發(fā)生在一個被稱為loxP的特異位點，且不需要其他的蛋白質(zhì)因子。

在Cre酶存在時，兩個loxP位點可以同源重組。第52頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五PropertiesofCreandFlp?Sitespecific:位點特異性--34bp非對稱靶序列34bpasymmetricrecognitiontargetsequence?Conservative:保守--無核苷酸增加或減少recombinationoccurswithoutanyoverallgainorlossofnucleotides?Simple:簡單--不需要其他因子或能量recombinasefunctionsautonomously,nocofactorsorATPrequired第53頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五特定位點重組酶識別位點第54頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五?Substratetopology:底物的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)supercoiledcircular,relaxedcircularorlinearDNA?Heritableproduct:可遺傳的產(chǎn)物resultantgeneticalterationisstableandheritable?Broadutility:廣泛的應(yīng)用functioninawiderangeofcelltypes,includingundifferentiatedaswellaspost-mitoticcellsfunctionoverlargedistances(Mb)PropertiesofCreandFlp第55頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五Cre-loxP重組系統(tǒng)示意圖Cre酶作用于基因組上loxP位點Cre酶使兩個loxP位點聯(lián)合兩個loxP位點發(fā)生同源重組切除X基因及一個loxP位點而僅留下一個loxP位點。第56頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五第57頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五Cre-mediatedRecombination第58頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五第59頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五染色體特定位點重組技術(shù)構(gòu)建要導(dǎo)入靶細(xì)胞的靶載體首先，將載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞（ES），篩選出發(fā)生同源重組的puro抗性細(xì)胞；篩選和鑒定；最后，用Cre表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞并瞬時表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)生的重組酶Cre催化loxP位點間的染色體發(fā)生重組。第60頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五第61頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五第62頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五第63頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五第64頁，共69頁，2022年，5月20日，23點26分，星期五Applications?GenetargetingKnock-out/Knock-in/Conditionalknock-out?Chromosomeengineering/ablationLargedeletionChromosomerearrangementGenom