β-葡萄糖苷酶的分離純化

本章以裂褶菌DS1液體發(fā)酵粗酶液為研究對象，對粗酶液中 伊葡萄糖甘酶先后進行硫酸銨沉淀、DEAE-SepharoseFastFlow陰離子層析、Sephacry1S-200分子篩層析等方法對其進行分離純化，并在此基礎(chǔ)上對該酶的一般性質(zhì)進行研究。4.1材料與方法4.1.1材料菌種:裂褶菌(S.communeDS1,由華中科技大學生命科學與技術(shù)學院資源與環(huán)境微生物所提供培養(yǎng)基:斜面培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)：馬鈴薯(200g),蔗糖(20g),瓊脂(30g)，水(1000mL)種子培養(yǎng)基(PDY培養(yǎng)基)：馬鈴薯(200g),蔗糖(20g),水(1000mL)發(fā)酵培養(yǎng)基：纖維素(3.2g),蛋白陳(3.0g),KH2P04(0.2g),Ca(NO3)2.4H2O(1.5g),MgSO4.7H2O(0.5g),水(100mL)緩沖溶液0.2mol/LpH=8.10Tris-HCL緩沖溶液：稱取 6.055gTris溶于500mL雙蒸水中；量取4.2mL鹽酸溶液溶于 500mL雙蒸水中；將 262mL鹽酸溶液和500mL雙蒸水(含Tris)混合即成0.2molpH=8.10Tris-HCl緩沖溶液。試劑:Sigma公司Sigma公司AmershamSigma公司Sigma公司Amersham公司Amersham公司北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司上海實驗試劑有限公司Fluka公司北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心中國醫(yī)藥 (集團)上?；瘜W試劑公司對硝基酚( NPG)DEAE-SepharoseFastFlow

Sephacry1S-200蛋白胨硫酸銨過硫酸按考馬斯亮藍 R-250，G-250丙烯酞胺、甲叉雙丙烯酞胺TEMEDPMSFSigmaTEMEDPMSFSigma公司

SDSTris甘氨酸甲硫氨酸低分子量標準蛋白PEG-20000快速銀染試劑盒產(chǎn)?。?gt;95^）槐角苷（90％）槐角提取物（10：1）儀器TG-332A微量分析天平低速大容量離心機電泳儀（DYY-m型）UV2000紫外-可見光分光光度計Sigma公司上海伯奧生物科技有限公司SigmaSigma公司上海伯奧生物科技有限公司Sigma公司上海伯奧生物科技有限公司天根生化科技（北京）有限公司天津市科密歐實驗化學試劑開發(fā)中心碧云天生物技術(shù)研究所國藥集團化學試劑有限公司實驗室自制西安天園生物技術(shù)有限公司上海天平儀器廠上海精密儀器儀表有限公司北京六一儀器廠尤尼柯 （上海）儀器有限公司粗酶液的獲得方法將菌種DS1接種到PDA斜面活化3d后，挑取一定大小的菌塊接入PDY培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3d制備一級液體種，再以10％的接種量接入 PDY培養(yǎng)基中培養(yǎng) 3d制備二級液體種。按 10%的接種量將二級種加入含有 100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于27C,150r/min搖床上培養(yǎng)。每天取一瓶發(fā)酵液在4000r/min條件下離心10min后，取上清液在標準條件下用pNPG測定&葡萄糖甘酶的活性。如此持續(xù)取三角瓶內(nèi)的培養(yǎng)液直至培養(yǎng)的第10d為止，取&葡萄糖甘酶的活性最高的培養(yǎng)液為粗酶液。對硝基酚標準曲線的繪制見方法。-蒂陶糖甘酶酶活測定對硝基酚-3■葡萄糖甘（pNPG）法［54］測定&葡萄糖甘酶酶活。蛋白質(zhì)含量的測定考馬斯亮藍G250法。將測試酶液稀釋到一定濃度，取0.5mL于試管中再加入2.5mL考馬斯亮藍G250試劑，搖勻，靜置10min后，在595nm條件下進行

蛋白質(zhì)含量測定。以牛血清蛋白做標準曲線為 Y=4.905X-0.0131,R2=0.9928(Y為吸光值，X蛋白質(zhì)含量)。硫酸俊分級沉淀、脫鹽和濃縮.確定鹽析時飽和度范圍(1)取粗酶液7份，每份15mL;(2)分別用飽和度為20%-80%相對飽和度的(NH4)2SO4于4c鹽析12h;(3)以不加硫酸俊的酶液為對照，于冰箱中于4c鹽析12h;8500r/min于4c離心20min;(5)分別收集各離心管中的上清液和沉淀，并用 pH5.0的乙酸-乙酸鈉恢復至原體積，在A595與A410條件下分別測定其蛋白質(zhì)含量和 伊葡萄糖甘酶活力。.最佳pH條件下鹽析(1)在100ml粗酶液中緩慢加入硫酸俊至Xi%飽和度；4c靜置12h;4C,8500r/min條件下離心20min,取上精液，測量上清液體積；(4)在上清液中繼續(xù)緩慢加硫酸俊至X2%飽和度；4c靜置12h;4C,8500r/min條件下離心20min,取上清液，沉淀溶于最佳pH值的乙酸-乙酸鈉中。并在相同的緩沖溶液中透析過夜，直至檢測不出 SO42+為止,4500r/min離心15min,取上清。DEAE-SepharoseF.F.陰離子交換柱層析將收集的上清液施于經(jīng)Tris-HCL緩沖液(pH=8.10,50mmolTris-HCL緩沖溶液)預平衡的DEAE-SepharoseF.F.層析柱上(1.0cmx20cm),酶蛋白先用約5倍柱體積的緩沖液洗脫至A595不變后，再用300mLpH=8.10,50mmol和300mL含1mol/LNaCl的相同緩沖液進行線性梯度洗脫，流速為1.2mL/min,5min收集1管。將每管在標準條件下進行活性測定，收集代葡萄糖甘酶酶活性較高的洗脫液。SephacrylS-200?膠過濾層析將上步所收集的酶液用聚乙二醇 (PEG)包埋法將酶液濃縮至 2mL,進行Sephacry1S-200#膠過濾層析(1.6cmx76cm),用pH=8.10,50mmolTris-HCI緩沖液洗脫，流速為0.4mL/min,5min收集1管。進行活性測定后收集具有酶活性的洗脫液部分，對其進行SDS(SDS聚丙烯吹胺凝膠電泳)確認純度。SDS電泳溶液及膠的配制表4.1SDS電泳溶液及膠的配制名稱配制方法保存條件

名稱配制方法保存條件A液凝膠濃度30%,交聯(lián)度2.67%丙烯酰胺3.00g雙丙烯酰胺0.08g加雙蒸水定容至5.0mL4cB液1.5MpH=8.8Tris-HCl緩沖溶液4c（分離膠緩沖溶液）Tris18.2g1MHCl調(diào)節(jié)pH至8.8雙蒸水定容至100mLC液0.5MpH=6.8Tris-HCl緩沖溶液4c（濃縮膠緩沖溶液）Tris1.8g1MHCl調(diào)節(jié)pH至6.8雙蒸水定容至30mL聚合起始劑10%過硫酸俊0.5g過硫酸俊，加5mL雙蒸水溶解室溫，現(xiàn)配現(xiàn)用聚合促進劑TEMED4c電泳緩沖液Tris9.0g甘氨酸43.2gSDS3g加雙蒸水至600mL4c樣品溶解液0.5MpH=6.8Tris-HCl3.0mL甘油 2.4mLSDS 0.48g&毓基乙醇 1.2mL0.5%(W/V)澳酚藍 1.2ml共計 8.0mL4c染色液考馬四亮藍R-250 0.125g甲醇 113.5mL冰乙酸 23mL加去離子水至250ml室溫脫色液甲醇 25mL冰乙酸 37.5mL加去離子水至 500mL室溫表4.2分離膠和濃縮膠的配制膠溶液分離膠(8%)濃縮膠(5%)A液5.3mL1.7mLB液7.6mL/C液/1.25mL10(W/V)SDS0.2mL0.1mL聚合起始液0.2mL0.1mL聚合促進劑12仙L10mL雙蒸水6.7mL6.8mL共計20mL10mL0電泳具體操作步驟(l)將配制好的8%的分離膠溶液混合均勻，然后將凝膠溶液迅速傾入制膠玻璃板中，至膠液面距玻璃板凹槽3cm左右，然后在膠面上輕輕鋪注1cm高的水層，垂直放置膠板，待膠凝聚后，用濾紙輕輕吸出膠面上的水，注意不要破壞膠面。(2)將配制好的5%濃縮膠迅速注入到分離膠的上層，至液面與玻璃板的凹槽平齊，插入梳子后，在室溫下放置20-30min,待其完全凝聚后，小心拔出梳子并倒入電極緩沖液。(3)將蛋白樣品加入等體積的樣品緩沖液，混勻后在沸水中煮 3-5min,冷卻后用微量進樣器將其加入上樣孔中。⑷將電泳槽與電泳儀相連，保持150V的恒定電壓進行電泳，直至樣品中染料遷移接近至下端時關(guān)閉電壓，停止電泳。蛋白質(zhì)的染色及脫色.固定：電泳結(jié)束后，取凝膠放入約100mL固定液中，在搖床上室溫搖動20min,搖動速度為60-70r/min。固定40min以上甚至過夜可以進一步降低背景。固定液的配制：依次加入50mL乙醇、10mL乙酸和40mLMilliQ級純水或雙蒸水，混勻后即成100mL固定液。.30%乙醇洗滌：棄固定液，加入100mL30%乙醇，在搖床上室溫搖動10min,搖動速度為60-70r/min。30%乙醇的配制：70mLMilliQ級純水或雙蒸水中加入30mL乙醇，混勻后即成100mL30%乙醇。.水洗滌：棄30%乙醇，加入200mLMilliQ級純水或雙蒸水，在搖床上室溫搖動10min,搖動速度為60-70r/min。.增敏：棄水，加入100mL銀染增敏液(1X),在搖床上室溫搖動2min,搖動速度為60-70r/min。銀染增敏液(1X)的配制：99mLMilliQ級純水或雙蒸水中加入1mL銀染增敏

液（100X）,混勻后即為銀染增敏液（IX）。銀染增敏液（1X）配制后需在2h內(nèi)使用。.水洗滌（共2次）：棄原有溶液，加入200mLMilliQ級純水或雙蒸水，在搖床上室溫搖動1min,搖動速度為60-70r/min。棄水，再加入200mLMilliQ級純水或雙蒸水，在搖床上室溫搖動1min,搖動速度為60-70r/min。.銀染：棄水，加入100mL銀溶液（1X）,在搖床上室溫搖動10min,搖動速度為60-70r/min。銀溶液（1X）的配制：99mLMilliQ級純水或雙蒸水中加入1mL銀溶液（100X）,混勻后即為銀溶液（IX）。銀溶液（1X）配制后需在2h內(nèi)使用。.水洗滌：棄原有溶液，加入100mLMilliQ級純水或雙蒸水，在搖床上室溫搖動1-1.5min,搖動速度為60-70r/min。注意：水洗滌的時間不能超過1.5min。.顯色：棄水，加入100mL銀染顯色液，在搖床上室溫搖動 3-10min,直至出現(xiàn)比較理想的預期蛋白條帶，搖動速度為60-70r/min。銀染顯色液的配制：90mLMilliQ級純水或雙蒸水中加入10mL銀染基本顯色液（10X）,再加入0.05mL銀染顯色加速液（2000X）,混勻后即為銀染顯色液。銀染顯色液配制后需在20min內(nèi)使用。.終止：棄銀染顯色液，加入100mL銀染終止液（1X）,在搖床上室溫搖動10min,搖動速度為60-70r/min。終止時有氣體產(chǎn)生屬正常現(xiàn)象，產(chǎn)生的氣體為二氧化碳。銀染終止液（1X）的配制：95mLMilliQ級純水或雙蒸水中加入5mL銀染終止液（20X），混勻后即為銀染終止液（1X）。銀染終止液（1X）配制后宜當d使用。.水洗滌：棄銀染終止液，加入100mLMilliQ級純水或雙蒸水，在搖床上室溫搖動2-5min,搖動速度為60-70r/min。.保存：可在MilliQ級純水或雙蒸水中保存?；虿捎眠m當?shù)姆绞街苽涑筛赡z。SDS測定蛋白質(zhì)含量（1）按4.1.4進行凝膠電泳（2）遷移率的計算和標準曲線的制作用直尺分別測量各蛋白質(zhì)區(qū)帶中心與凝膠頂端的距離。各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶的遷移率（以相對遷移率Rf表示）按下列公式進行計算：相對遷移率蛋白質(zhì)移動距離染色前膠長（Rf相對遷移率蛋白質(zhì)移動距離染色前膠長（Rf）= 染色后膠長父染料移動距離以各標準蛋白質(zhì)樣品遷移率作橫坐標，蛋白質(zhì)分子量的自然對數(shù)值為縱坐標作圖，即可得到一條標準曲線。（3）分子量測定測得待測蛋白質(zhì)的遷移率后，由標準曲線上即可查得其分子量的自然對數(shù)值，再換算成分子量即可。2葡萄糖苷酶性質(zhì)的研究（一）伊葡萄糖甘酶最佳反應(yīng)溫度將酶液分別在不同的溫度下 （30℃，40℃， 50℃， 60℃，70℃， 80℃），測定&葡萄糖甘酶的活性，將最高的酶活力定義為 100%,分別計算不同溫度條件下伊葡萄糖甘酶的剩余酶活性（采用相對酶活性來表示，即在不同溫度條件下的剩余的酶活性占其中酶活性的最高值的百分比）。（二）伊葡萄糖甘酶最佳反應(yīng)pH將酶液分別置于不同pH值（3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0）的NaH2PO4-檸檬酸緩沖液中進行反應(yīng)，并測定剩余的酶活性。將最高的酶活力定義為 100%，分別計算不同pH值條件下&葡萄糖甘酶的剩余酶活性（方法同上）。（三）伊葡萄糖甘酶的熱穩(wěn)定性將酶液分別置于不同的溫度條件下 （40℃， 50℃， 60℃， 70℃， 80℃）保溫不同的時間（10min,20min,30min,40min,50min,60min）后，將其迅速放置于冰水浴中，然后測定剩余的酶活性。將最高的酶活力定義為100%，分別計算不同溫度條件下伊葡萄糖甘酶的剩余酶活性與最高酶活性的比值。（四）不同金屬離子對&葡萄糖甘酶活性的影響在&葡萄糖甘酶與其底物進行反應(yīng)時，分別加入不同的金屬離子 （Cu2+,Mg2+,Co2+,Na+,Zn2+,Ba2+,Mn2+,K+,Al3+,Fe3+,Fe2+,Hg2+并使金屬離子的最終濃度為 0.05mol/L，以不加金屬離子的反應(yīng)體系中的酶活性定義為100%,分別測定加入金屬離子后各反應(yīng)體系中 伊葡萄糖甘酶的剩余相對酶活性。（五）伊葡萄糖甘酶對不同物質(zhì)的作用能力在標準反應(yīng)條件下，用濃度為10mg/mL的不同物質(zhì)，如槐角苷、染料木苷和產(chǎn)丁與&葡萄糖甘酶進行反應(yīng)，并用HPLC對變化前后的成分進行檢測。觀測&葡萄糖甘酶對不同物質(zhì)的作用能力。槐角苷轉(zhuǎn)化體系的洗脫條件：見方法 。產(chǎn)丁轉(zhuǎn)化體系的洗脫條件[59]:色譜柱：HypersilC-18反相柱（100mrK4.6mmi.d.;5 山m;流動相甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B）:0~20min（B:67~67）;20~25min（B:67~62）;25~60min（B:62~62）;60~65min（B:62~67）;進樣量：10L;流速：1.0mL?min-1;柱溫：25C;檢測波長355nm.4.2結(jié)果與分析不同培養(yǎng)時間對產(chǎn)生 伊葡萄糖甘酶的影響圖4.1不同培養(yǎng)時間對產(chǎn)伊葡萄糖甘酶的影響從圖4.1可知，不同培養(yǎng)天數(shù)里，裂褶菌DS1分泌,葡萄糖甘酶有很大差異。隨著培養(yǎng)時間的增加，伊葡萄糖甘酶的分泌量成上升趨勢，從第1d的0.01U/mL升高到第8d時的酶活最高值，為0.207U/mL;此后伊葡萄糖甘酶分泌量減少，酶活逐漸降低，在第12d時酶活為0.06U/mL。從上可知，搖瓶條件下，裂褶菌S.communeDS1產(chǎn)&葡萄糖甘酶的最佳時間是第8d。在培養(yǎng)的早期，裂褶菌通過利用培養(yǎng)基中的速效碳源得到生長， 此時由于速效碳源濃度較高，伊葡萄糖甘酶的分泌收到抑制；隨著培養(yǎng)的進行，裂褶菌逐漸將速效碳源耗盡，此時不得不通過分泌纖維素酶將培養(yǎng)基中的纖維素降解。 纖維素酶分泌量的提高，使得,葡萄糖甘酶酶量也得到提高，在第8d時達到最高值。隨后，隨著可利用碳源的枯竭，裂褶菌的生長受到抑制，并且出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，此時代葡萄糖甘酶酶活逐漸降低。硫酸俊分級沉淀0 1 10 1 1 ' 1 1 1 '——020%30%40%50%60%70%80%硫酸鏤濃度■3-葡萄糖甘酶?蛋白質(zhì)0208O14A64oO21,8,6,421oooO5-M5A圖4.2狗萄糖甘酶硫酸俊鹽析曲線從圖4.2可知，隨著硫酸俊飽和濃度的增加，3■葡萄糖甘酶逐漸鹽析出來。在飽和濃度為60%?80%范圍內(nèi)鹽析所得沉淀的,葡萄糖甘酶酶活和總蛋白質(zhì)得率明顯增加，前者從0.031U/mL升高到0.078U/mL,后者從41%升高到100%，因此，可確定,葡萄糖甘酶在粗酶液中的硫酸俊鹽析范圍是 60%到80%飽和度。DEAE-SepharoseF.F.陰離子交換柱層析將收集的上清液施于經(jīng) pH=8.10,50mmol/LTris-HCl緩沖溶液預平衡的DEAE-SepharoseF.F.層析柱上(1.0cmx20cm),酶蛋白先用約100mL柱體積的緩沖液洗脫至A595不變后，再用300mLpH=8.10,50mmol/LTris-HCl緩沖溶液和300mL含1mol/LNaCl的相同緩沖液進行線性梯度洗脫，流速為1.2mL/min,5min收集1管。將每管在標準條件下進行活性測定，收集,葡萄糖甘酶酶活性較高的洗脫液。2[-20.42[-20.4圖4.3DEAE-SepharoseFastFlowK離子交換柱層析圖譜從圖4.3可知，酶液經(jīng)在DEAE-SepharoseFastFlow陰離子交換柱層析后，共洗脫出3個蛋白峰(I-1,I-2,I-3)。用所述方法對各蛋白峰進行伊葡萄糖甘酶酶活的測定，結(jié)果表明峰I-3處有很強的,葡萄糖甘酶，而峰I-1和I-2處則酶活較低。收集第36管到44管的洗脫液進行下一步的分離純化。SephacrylS-200S膠過濾層析圖4.4Sephacry1S-20吩子篩層析圖譜將經(jīng)DEAE-SepharoseF.F.陰離子交換柱層析后的酶液用PEG-20000濃縮后，吸取2mL酶液施于經(jīng)pH=8.10,50mmol/LTris-HCI緩沖液平衡的Sephacry1S-200凝膠過濾進行層析，流速為0.4mL/min,5min收集一管(前20mL未收集)。從圖4.4可知，在Sephacry1S-2008膠過濾層析過程中，共洗脫出4個蛋白峰，其中峰II-1和II-4比較明顯，但是沒有,葡萄糖甘酶酶活存在。只有峰II-3具有

較高的,葡萄糖甘酶活性。收集峰II-3處的洗脫液（35-41管），用PEG-20000濃縮后進行SDS檢測，確認其純度。伊葡萄糖甘酶純化過程總表整個純化過程的結(jié)果如圖4.5所示。從該圖可知，,葡萄糖甘酶相對于粗酶液（100mL）已被純化了17.8倍，從酶的酶活力由最初的0.17U/mg提高到了3.1U/mg。表4.5前萄糖甘酶純化過程總表分離步驟總蛋白總酶活比酶活純化倍數(shù)得率stepTotalTotalSpecificPurificationRecoverproteinactivityactivityfactory(mg)(U10-3)-1 -3(U/mg1103)(%)發(fā)酵液270.0471001701100鹽析30.4256008404.854.0DEAE-Sepharose10.31560015008.733.1F.F.Sephacry1S-2001.324100310017.88.7-葡萄糖甘酶性質(zhì)研究蛋白質(zhì)純度鑒定用SDS電泳對經(jīng)過Sephacry1S-200s膠層析的蛋白質(zhì)進行純度鑒定,見圖4.5所示。由圖可知，經(jīng)過Sephacry1S-200凝膠層析后出現(xiàn)一條帶，說明所分離的代葡萄糖甘酶達到了較高的純度。

117,00090,000[-glucosidase49,000[-glucosidase34,00025,00019,0001.標準蛋白質(zhì)及分子量2.經(jīng)SephacrylS-200?膠層析的代葡萄糖甘酶圖4.5勖萄糖甘酶的SDS電泳圖分子量測定根據(jù)實驗繪制的標準蛋白質(zhì)分子量對數(shù)值和相對遷移率做圖4.6,線性回歸后得到的LgMr-Rf標準曲線方程為y=-1.1073x+5.3246,R2=0.9845（y=蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)值，x=蛋白質(zhì)的相對遷移率）。&葡萄糖甘酶經(jīng)SDS分析后Rf值=0.62,由此可推出其分子質(zhì)量是43.2kDa。表4.3標準蛋白的遷移率標準蛋白分子量（kDa）RfstandardproteinMolecularweight小乳糖甘酶^galactosidase1170.278兔磷酸化酶BRabbitphosphorylaseb900.322雞卵白蛋白Ovalbumin490.533碳酸酊酶Caibonicanhydrase340.678代乳球蛋白f-lactoglobulin250.867溶菌醐Lysozyme190.956

5.25.2圖4.6SDS電泳測定代葡萄糖甘酶分子量伊葡萄糖甘酶最佳反應(yīng)溫度將&葡萄糖甘酶置于不同溫度下進行酶活測定， 結(jié)果如圖4.5所示。從該圖可知，伊葡萄糖甘酶的最適反應(yīng)溫度為50Co,ooQ。,ooQ。O08642^1為性活對相0 1 1 1 1 1 1 120 30 40 50 60 70 80 90溫度（圖4.5溫度對3■葡萄糖甘酶活性的影響-郁萄糖甘酶最佳反應(yīng)pH將&葡萄糖甘酶置于不同pH的磷酸緩沖液中進行酶活測定，結(jié)果如圖 4.6所示。從圖4.6可知，&葡萄糖甘酶的最適反應(yīng)pH為5.0-6.0。圖4.6pH對代葡萄糖甘酶活性的影響圖4.6pH對代葡萄糖甘酶活性的影響-郁萄糖甘酶的熱穩(wěn)定性將酶液分別置于不同的溫度條件下(40C,50C,60C,70C,80C)保溫不同的時間(10min,20min,30min,40min,50min,60min)后，將其迅速調(diào)至酶的最適溫度，然后測定剩余的酶活性。結(jié)果如圖4.7所示，在pH值為5.0的條件下，該酶在40c和50c時活性是穩(wěn)定的，酶活沒有損失；在60c時，酶的半衰期是5min；在70c和80c保溫10min時，相對酶活性變成3.5%。00%1活酶對相一.—40c 50c 60c 70c 80c806000%1活酶對相一.—40c 50c 60c 70c 80c806040oO2圖4.7,葡萄糖甘酶的熱穩(wěn)定性金屬離子對伊葡萄糖甘酶酶活的影響實驗結(jié)果見表4.1,從表中可以看出Fe2+對酶有強烈的抑制作用，當反應(yīng)體系中濃度為50mmol/L時，酶活兒乎被全部抑制；Zn2+、K+、Cu2+和A產(chǎn)對酶的抑制性僅次于Fe2+,在濃度為50mmol/L時，酶活分別被抑制成16%、12.8%、10.1%和13.5%;Fe3+對&葡萄糖甘酶有一定的抑制作用，而其它金屬離子，如 Mg2+、Co2+、Na+、Ba2+、Mn2+和Hg2+對酶活無明顯的影響。表4.1金屬離子對伊葡萄糖甘酶活性的影響化學試劑濃度相對酶活力ChemicalConcentrationRelativeactivity(mmol/L)(%)對照/100Cu2+5010.1Mg2+5097.0Co2+5084.8+Na50100Zn2+5016.0Ba2+5095.3Mn2+50100K+5012.8

一一3+Al5013.53+Fe5060.72+Fe507.62+Hg50100酶水解pNPG動力學常數(shù)由米氏方程推出1/V=Km/(Vmax*1/[S])+1/Vmax,按Lineweaver-Burk法作圖(4.8)。線性回歸后得到方程：y=2.7974x+0.3075(R2=0.999,x為底物濃度的倒數(shù)，y為反應(yīng)速度的倒數(shù))。直線在橫軸上的截距為-1/Km,縱軸上的截距為1/Vmax。由此可以得到Km為9.10mmol/L,Vmax為3.25U/L。說明該酶對pNPG有很強的親和力，用pNPG為底物測定酶的活力是合適的。圖4.8-葡萄糖甘酶催化水解pNPG的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)關(guān)系圖-郁萄糖甘酶對不同底物的作用在標準反應(yīng)體系下，,葡萄糖甘酶對槐角昔的轉(zhuǎn)化情況如圖 4.9所