生科導(dǎo)-原課件class

InsulinFactor

Ⅷ發(fā)酵工程：解決規(guī)模放大的問題plasma

derived

FVIII優(yōu)點(diǎn)：1.成本低廉；2.制作簡單；缺點(diǎn)：1.

資源受限；含有雜質(zhì)；污染；（HIV，HBV）Source

of

FactorVIIIGlobal

Factor

VIII

sales

exceed

US$5

billion

per

yearThe

Cost

of

Factor

VIII

TherapyA

single

treatment

costs

$1,000

to

$2,000

for

an

adult對比：蛇毒抗血栓藥物生產(chǎn)過程4times/yearPurifyAntibodyaffinitychromatography15,000

snakes1250

gcrude100,000

vialsFermentation10L

supernatantFormulation1

g

nAnfibatideHarvest1

wk/batchHarvestPurifyCommonchromatography100,000

vialsFormulation1

grAnfibatide天然提取工程發(fā)酵工程：解決規(guī)模放大的問題小試中試發(fā)酵工程的發(fā)展簡史1第一階段傳統(tǒng)釀造技術(shù)（1900之前），食品11發(fā)酵工程的發(fā)展簡史118431822,born

法國高師1854里爾工學(xué)院院長1840

1846中學(xué)畢業(yè)

畢業(yè)1847博士1849乙醇發(fā)酵1859自然發(fā)生論1865解決蠶病1870蠶病,法國啤酒1857,乳酸發(fā)酵1873法國（高溫滅菌） 醫(yī)學(xué)院1882法蘭西學(xué)院1882狂犬1881炭疽1895逝世L.Pasteur事跡簡介12第二階段:準(zhǔn)“純菌培養(yǎng)”階段，1900—1940現(xiàn)代工業(yè)發(fā)酵技術(shù)之父，利用丁醇梭桿菌來生產(chǎn)發(fā)酵工程的發(fā)展簡史113發(fā)酵工程的發(fā)展簡史1第三階段：通氣發(fā)酵技術(shù)及裝備，抗生素，1940-1950代表性成就：1921溶菌酶；1928青霉素；14Discovered

byAlexander

Fleming1928proved

to

be

too

difficultFull

scale

production1940’s

1945Fermentationroute

waschosenEfforts

toincrease

productioncell

line

selectionmedium

optimizationprocess

development15+

years發(fā)酵工程的發(fā)展簡史1厭氧發(fā)酵→有氧發(fā)Chemical

synthes酵is弗洛里The

story

of

penicillin15第四階段誘變育種和代謝控制時(shí)期,氨基酸，1950-1980發(fā)酵工程的發(fā)展簡史116發(fā)酵工程的發(fā)展簡史1工程藥物也屬于轉(zhuǎn)

產(chǎn)品

！第五階段現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)，重組胰島素、干擾素，1980-現(xiàn)在17發(fā)酵工程的發(fā)展簡史118第一階段第二階段發(fā)酵設(shè)備的進(jìn)步1900年以前

木制，溫度和熱交換儀器1900-1940年鋼制，出現(xiàn)機(jī)械攪拌第三階段第四階段第五階段1940-1950年使用檢測電極1950-1980年更大，更完善，計(jì)算機(jī)初步使用1980-現(xiàn)在大規(guī)模細(xì)胞發(fā)酵罐，自動(dòng)化219發(fā)酵工程簡介發(fā)酵食品工業(yè)Fermented

Foods有機(jī)酸發(fā)酵工業(yè)

anic

Acids3．氨基酸發(fā)酵工業(yè)Amino

Acids低聚糖與多糖發(fā)酵工業(yè)oligosaccharides

and

polysaccharides核苷酸發(fā)酵工業(yè)Nucleotides

藥物發(fā)酵工業(yè)Pharmaceutical維生素發(fā)酵工業(yè)vitamin酶制劑發(fā)酵工業(yè)Enzymes發(fā)酵飼料工業(yè)Feedstuff生物肥料與

工業(yè)biofertilizer

and

biological

pesticide溶劑發(fā)酵工業(yè)Solvent水的生物處理工業(yè)及環(huán)保Environmental

Application(Waste

Treatment)發(fā)酵工業(yè)類型2發(fā)酵工程簡介20發(fā)酵工程：利用微生物/細(xì)胞的特定性狀，通過現(xiàn)代工程技術(shù)在生物反應(yīng)器中生產(chǎn)有用物質(zhì)的一種技術(shù)體系。221發(fā)酵工程簡介一、發(fā)酵的相關(guān)概念決定發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)水平的三要素：生產(chǎn)菌種、發(fā)酵設(shè)備、生產(chǎn)工藝FERMENTATIONProcess

Control上游工程UPSTREAMPROCESSES下游工程DOWNSTREAMPROCESSES二、發(fā)酵工程組成從廣義上講，由三部分組成：上游工程、發(fā)酵工程、下游工程2發(fā)酵工程簡介發(fā)酵菌種發(fā)酵設(shè)備（發(fā)酵工藝）產(chǎn)品的提取（純化工藝）生產(chǎn)工藝221

選育獲得高產(chǎn)菌種2

反應(yīng)器及過程放大3

發(fā)酵過程優(yōu)化和控制4

發(fā)酵產(chǎn)物分離提取三、發(fā)酵工程的主要內(nèi)容Part1：上游工程-菌種篩選過程2發(fā)酵工程簡介以生物技術(shù)藥物領(lǐng)域

酵母發(fā)酵工程研究為例，進(jìn)一步介紹發(fā)酵工程的上游工程、中游工程和下游工程24The

ther utic

protein

dividedinto

two

segments：Proteins

that

are

not

PTM（Posttranslational

modification）Proteins

that

require

PTM

(mostly

N-glycosylation)2發(fā)酵工程簡介-上游工程25各種重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)勢比較2發(fā)酵工程簡介-上游工程Heterologous

proteins

expressed

by

P.

pastorisUp

to

5000proteinsexpressed

inP.

pastorisTheruticproteinsproduced

inP.

pastorisKalbitor

is

a

drug

used

for

the

treatment

of

hereditarioedema(HAE)

and

in

the

prevention

of

blood

loss

in

cardiothoracic

surgery.

Itis

an

inhibitor

of

the

protein

kallikrein.approved

byFDA

in

20092發(fā)酵工程簡介-上游工程Advantages

of

Pichitoris:Growing

on

chemically

defined

mediaThe

high

yieldsFacilitate

scale-upPTM

(glycosylation,

disulphide

isomerization,

lipidation,sulphation

orphosphorylation)Strong&inducible

AOX

promoter

(30%

of

total

cellular

protein)不存在原核表達(dá)系統(tǒng)的內(nèi)毒素難以除去的問題不存在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的

和支原體污染等問題Comparison

of

yeast-based

expression

systemsCandida,

Turolopsis2發(fā)酵工程簡介-上游工程High

MannoseHumanized

glycosylation2發(fā)酵工程簡介-上游工程Disadvantages

of

Pichitoris:Tillman

Gerngross,

the

ScientistTurned

Scientific

BusinessmanProfessor

of

Engineering常規(guī)酵母人源糖基化改造酵母改造Pichi toris

expression

systemVectors

StrainsGS115KM71X-33SDMsNRRLY-11430Pichia

pinks……pHIL-D2pGAPZpPIC3KpGAPZ

αpPIC9KpAO815pPICZpPICZαpHIL-S1Promoters:

PAOX,PGAP;Signals:

α-MF,PHO,SUC23.:

G418,Zeocin4.High

copies

selectionTransformationPhenotype:

Mut+

,MutS,

His+Protease…

…2發(fā)酵工程簡介-上游工程302發(fā)酵工程簡介-上游工程0.5

1.0G4182.0

3.0ScreeningConstructionOptimizationGene

of

interest目的：獲得最優(yōu)的發(fā)酵菌株對于工程藥物需要注意：1.這個(gè)菌株是轉(zhuǎn)菌株；2.這個(gè)是人類的；3.一般不直接食用轉(zhuǎn)菌體；232生物制藥發(fā)酵工程簡介Part2：發(fā)酵工程-產(chǎn)物生產(chǎn)累積過程233發(fā)酵工程簡介-中游工程中游工程：發(fā)酵菌種擴(kuò)大培養(yǎng)2發(fā)酵工程簡介-中游工程擴(kuò)培的目的：接種量的需要菌種的馴化縮短發(fā)酵時(shí)間、保證生產(chǎn)水平的質(zhì)量要求：總量及濃度能滿足要求生理狀況穩(wěn)定，

與群體強(qiáng)，移種至發(fā)酵后，能夠迅速生長無雜菌污染34中游工程：發(fā)酵設(shè)備與工藝發(fā)酵條件調(diào)控、無菌環(huán)境控制、過程分析和控制等設(shè)備

工藝235發(fā)酵工程簡介-中游工程2發(fā)酵工程簡介-中游工程36GMP標(biāo)準(zhǔn)的工作環(huán)境2發(fā)酵工程簡介-中游工程37溫度影響及控制pH值的影響及控制溶解氧的影響及控制基質(zhì)濃度及補(bǔ)料的控制菌體濃度CO2和呼吸商的影響及其控制發(fā)酵終點(diǎn)的判斷發(fā)酵染菌及防治發(fā)酵過程控制2發(fā)酵工程簡介-中游工程參數(shù)傳感器參數(shù)傳感器溫度熱電偶，熱敏電阻，鉑電阻，溫度計(jì)DCO2CO2電極，膜管傳感器氣體流量熱質(zhì)量流量計(jì)，孔板流量計(jì)，轉(zhuǎn)子流量計(jì)各種培養(yǎng)基組分及代謝物生物傳感器攪拌轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速傳感器金屬離子濃度離子選擇性電極料液量測力傳感器排氣中的氧分壓熱磁氧分析儀，氧化鎬陶瓷氧分析儀氣泡接觸電極排氣中的CO2分壓紅外氣體分析儀補(bǔ)料速度轉(zhuǎn)速傳感器，測力傳感器培養(yǎng)液濁度或菌體濃度光導(dǎo)纖維（光電池法），等效電容法pH復(fù)合玻璃電極pH復(fù)膜氧電極，膜管傳感器發(fā)酵過程控制：代謝變化與控制參數(shù)目前常用的生物化工參數(shù)及其傳感器2發(fā)酵工程簡介-中游工程2發(fā)酵工程簡介-中游工程發(fā)酵過程控制：溫度的影響及控制溫度對發(fā)酵的影響影響各種酶反應(yīng)的速率，改變菌體代謝產(chǎn)物的

方向，影響微生物的代謝調(diào)控機(jī)制，影響發(fā)酵液的理化性質(zhì)。影響發(fā)酵液的黏度、基質(zhì)和氧在發(fā)酵液中的溶解度和傳遞速率、某些基質(zhì)的分解吸收速率等。2發(fā)酵工程簡介-中游工程41最適生長溫度與最適生產(chǎn)溫度往往是不一致的，可采用變溫發(fā)酵發(fā)酵過程控制：pH的影響及控制1.pH值對發(fā)酵的影響影響酶的活性影響微生物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)影響微生物對基質(zhì)的利用速率影響代謝方向檸檬酸，當(dāng)在pH2.5-6.5范圍內(nèi)時(shí)以菌體生長草酸為主。谷氨酸：中性或微堿產(chǎn)谷氨黑曲霉菌在pH2-2.5為主，而在pH7.0時(shí)，則以酸/酸性產(chǎn)谷氨酰胺2發(fā)酵工程簡介-中游工程發(fā)酵過程控制：pH的影響及控制2發(fā)酵pH值的確定同一菌種，生長最適pH可能與產(chǎn)物

最適pH不用。最適pH是根據(jù)實(shí)驗(yàn)來確定的，即配制不同初始pH的培養(yǎng)基，搖瓶

發(fā)酵情況。2發(fā)酵工程簡介-中游工程431.溶解氧（dissolved

oxygen,

DO）的影響最適氧濃度（optimal

oxygen

concentration）臨界氧濃度（critical

value

of

dissolved

oxygen

concentration）指不影響菌的呼吸所允許的最低氧濃度溶氧大小與產(chǎn)物的生物

途徑有關(guān)，如氨基酸

；發(fā)酵過程控制：DO的影響及控制2發(fā)酵工程簡介-中游工程2.溶氧濃度決定因素：供氧和需氧兩方面（一）供氧方面：（二）需氧方面：控制方法：通過控制基質(zhì)濃度，通氣量，純氧，攪拌DO-stat控制44基質(zhì)對發(fā)酵影響碳源對發(fā)酵的影響氮源對發(fā)酵的影響無機(jī)氮源和有機(jī)氮源兩類磷酸鹽對發(fā)酵的影響微量元素如Cu2+，生物素，Mn2+等發(fā)酵過程控制：基質(zhì)濃度及補(bǔ)料的控制2發(fā)酵工程簡介-中游工程補(bǔ)料方式分批培養(yǎng)（batchculture

）補(bǔ)料分批培養(yǎng)（fed-batchculture）連續(xù)培養(yǎng)（continuous

culture）（1）分批發(fā)酵法

（2）補(bǔ)料分批發(fā)酵法中游工程：補(bǔ)料方式2發(fā)酵工程簡介-中游工程46（3）連續(xù)培養(yǎng)法發(fā)酵體積不變發(fā)酵體積變大體積基本不變發(fā)酵過程控制：基質(zhì)濃度及補(bǔ)料的控制菌體生長階段菌體生長期、發(fā)酵前期產(chǎn)物生成階段產(chǎn)物生產(chǎn)期、發(fā)酵中期菌體自溶階段菌體自溶期、發(fā)酵后期。遲滯期 對數(shù)生長期

穩(wěn) 定

期

期2發(fā)酵工程簡介-中游工程代謝曲線的研究有利于掌握發(fā)酵代謝變化的規(guī)律和發(fā)現(xiàn)工藝控制中存在的問題，有助于改進(jìn)工藝，提高產(chǎn)物的產(chǎn)量發(fā)酵過程控制：發(fā)酵終點(diǎn)的確定菌體濃度、補(bǔ)料、溫度、pH值溶氧、染菌、CO2、中游工程：發(fā)酵工程影響因素小結(jié)2發(fā)酵工程簡介-中游工程發(fā)酵過程參數(shù)：發(fā)酵工程技術(shù)要求：明確的代謝路線：代謝途徑優(yōu)化，代謝調(diào)節(jié)條件明確，產(chǎn)物代謝流通暢。嚴(yán)格的生長條件：溫度、pH、DO、營養(yǎng)等條件適宜、基質(zhì)成分及反應(yīng)器結(jié)構(gòu)配置合理；純種培養(yǎng)條件：

規(guī)程操作、純種狀態(tài)；恰當(dāng)?shù)目刂茥l件：靈巧的參數(shù)調(diào)節(jié)、合理的時(shí)段設(shè)置、經(jīng)濟(jì)的成本消耗；合理的操作方式：

培養(yǎng)方式（營養(yǎng)細(xì)胞/

孢子）、發(fā)酵操作方式（分批、補(bǔ)料or連續(xù)）。2發(fā)酵工程簡介-中游工程502發(fā)酵工程簡介Part3：下游工程-產(chǎn)物純化過程對于

工程藥物需要注意：最終獲得產(chǎn)品是高度純化、成分確定的物質(zhì)；轉(zhuǎn)

食物是什么成分呢？Downstream

processing,

what

and

whyDownstream

processing

is

any

treatment

of

culture

broth

after

fermentationto

concentrate

and

purify

products.

It

follows

a

general

sequence

of

steps:Clarification,

(cell

removal

by

centrifugation&filtration)Primary

isolation

(Large

volume)Purification

(Highly

selective)Quality

ControlDownstream

processing

mostly

contributes

40-90

%

of

total

cost252發(fā)酵工程簡介-下游工程×0.8=12000

g1.Centrifugation（離心）:2.Filtration（過濾）

:Clarification(樣品澄清)Thetypes

of

filtration

usedin

biotechnology

include:Microfiltration（微濾）Ultrafiltration

（超濾）Reverse

Osmosis(反向滲透，not

discussed

here)254發(fā)酵工程簡介-下游工程Types

of

Microfiltration255發(fā)酵工程簡介-下游工程What’s

the

difference

of

these

materials?How

select

proper

size

for

microfiltrationTypes

of

Ultrafiltration257發(fā)酵工程簡介-下游工程258發(fā)酵工程簡介-下游工程Microfiltration

vs.

UltrafiltrationMicrofiltration:Proteins

apermeatetheUltrafiltrationProteins

aretentatetheHowever,processes

arebasically

identical59Purification(蛋白純化)Chromatographic

techniques

usually

employed

for

high

value

products.These

methods,

normally

involving

columns

of

chromatographic

media(stationary

phase),

are

used

for

desalting,

concentration

and

purificationof

protein

preparations.

Several

important

aspects

are

molecular

weight,isoelectric

point,hydrophobicity

and

biological

affinity.

Methods

are:Size

exclusion

chromatography分子篩（分子排阻）層析Ion

exchange

chromatography離子交換層析Hydrophobic

chromatography疏水層析Affinity

chromatography親和層析260發(fā)酵工程簡介-下游工程2發(fā)酵工程簡介-下游工程質(zhì)量控制（QC）SDS-PAGE、HPLC、CE、Western

blot、MS、N-端

、糖基分析等檢測項(xiàng)目：1.

含量測定

2.

質(zhì)譜測定3.

純度測定

4.紫外吸收光譜分析5.

肽譜分析

6.

穩(wěn)定性試驗(yàn)7.

酵母宿主殘留測定

8.

內(nèi)毒素含量測定9.純化介質(zhì)膠殘留量測定等技術(shù)方法：盡可能確保成分明單一、明確！61200420082014

2015

20162018

<2020Ernst

&

Young發(fā)酵工程處于的

研究階段2發(fā)酵工程簡介-下游工程盡可能確保安全有效！生物技術(shù)藥物開發(fā)步驟發(fā)酵工程的應(yīng)用領(lǐng)域363生物質(zhì)原料化學(xué)品－精細(xì)化學(xué)品－大宗化學(xué)品－生物塑料－溶劑生物能源－生物－生物柴油－甲醇－氫氣－沼氣食品與藥品－氨基酸－食品添加劑－食品強(qiáng)化劑－維生素－抗生素發(fā)酵工程的應(yīng)用領(lǐng)域364一、

和健康領(lǐng)域–常規(guī)發(fā)酵產(chǎn)品：抗生素、維生素、激素的生產(chǎn)；–

工程菌發(fā)酵產(chǎn)品：免疫調(diào)節(jié)劑和

品、新型藥物（人干擾素、胰島素、生長激素、

、抗體等）；2015/5/5

65發(fā)酵工程的應(yīng)用領(lǐng)域3β-內(nèi)酰胺類抗生素，作用機(jī)理相似，抑制細(xì)菌細(xì)胞壁形成66二、食品釀造領(lǐng)域醋、醬油、面包、乳酪、酸乳、腐乳、酒等2015/5/567發(fā)酵工程的應(yīng)用領(lǐng)域3發(fā)酵工程的應(yīng)用領(lǐng)域368發(fā)酵工程的應(yīng)用領(lǐng)域369一是釀造工藝、二是儲藏工藝、三是勾兌工藝你相信這些年份是真的嗎？白葡萄酒紅葡萄酒發(fā)酵工程的應(yīng)用領(lǐng)域370自釀葡萄酒好不好？發(fā)酵工程的應(yīng)用領(lǐng)域3例：自釀葡萄酒最有可能含有以下哪種物質(zhì)，不易長期飲用。（

）A.

甲醇；

B.乙醇；C.

；

D.乙醛；71Q:我要問的問題是：在發(fā)酵工程那一節(jié)，自釀葡萄酒產(chǎn)生的

物質(zhì)為

甲醇？發(fā)生的反應(yīng)過程是什么？A：葡萄皮中的果膠在果膠酶或加熱的作用下，可能分解出甲醇，霉變也會產(chǎn)生大量甲醇，發(fā)酵越徹底，甲醇含量會越高。除甲醇外，還有可能含有雜醇油等有害成分。發(fā)酵工程的應(yīng)用領(lǐng)域3食品安全發(fā)酵工程的應(yīng)用領(lǐng)域3732015/5/574三、生物能源與資源–微生物可再生的生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化。–微生物提

細(xì)化工和高分子聚合物的原料。–微生物富集貧礦和微量金屬元素；發(fā)酵工程的應(yīng)用領(lǐng)域375發(fā)酵工程的應(yīng)用領(lǐng)域3生物能源76Consolidated

bioprocessing

(CBP)聯(lián)合生物加工77Efficient

CBP

microbe

wantedThere

is

no

single

microbe

available

for ng

CBP

efficiently.the

best

ethanol

producercellulolyticenzymesPoor

secretionHigh

glycosyl