結核病實驗室檢查的臨床意義

關于結核病實驗室檢查的臨床意義第1頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五主要內容一、結核桿菌的病原學基礎

二、結合分支桿菌全球的流行情況三、結核桿菌的實驗室檢測方法及臨床應用第2頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五一、結核病的病原學基礎結核桿菌屬：一類細長略帶彎曲，有時呈分枝狀的桿菌，本屬細菌多具有抗酸性，又稱抗酸桿菌（acid-fastbacillus），細菌體內含有分枝菌酸，細胞壁含有大量脂類，這與分枝桿菌的染色性、抵抗力和致病性等密切相關。本屬細菌已經被鑒定的有70多種，可分為三大類：結核分枝桿菌、非典型分枝桿菌、麻風分枝桿菌；按生長速度可分為三類，即緩慢生長菌、迅速生長菌和不能培養(yǎng)菌三種類型第3頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五結核分枝桿菌群結核分枝桿菌，是人和動物結核病的病原體，包括人結核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis）、牛分支桿菌（M.bovis）、非洲分支桿菌（M.africanum）和田鼠分枝桿菌（M.microti），前三種對人類治病，其中人型結核分枝桿菌感染發(fā)病率最高。結核分枝桿菌屬于緩慢生長分支桿菌第4頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五第5頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五及時準確的診斷結核病，有效地控制傳染源，對預防結核病至關重要。第6頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五結核病實驗室檢查細菌學檢查免疫學檢查分子生物學檢查涂片染色鏡檢分枝桿菌分離培養(yǎng)分支桿菌藥敏試驗分枝桿菌菌種鑒定第7頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五最原始最基礎的檢測方法涂片染色鏡檢第8頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五抗酸染色的原理分枝桿菌的細胞壁內含有大量的脂質。包圍在肽聚糖的外面，所以分支桿菌一般不易著色，需要經過加熱或是延長染色時間來促使其著色。但分支桿菌中的分支菌酸與染料結合后，就很難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色。第9頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五涂片染色鏡檢臨床價值

適用于多種標本；操作簡便，價格低廉。第10頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五涂片鏡檢的臨床應用

一、確診涂陽結核病及開放性結核2份痰標本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性；1份痰標本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性+影像學檢查符合活動性肺結核表現。第11頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五涂片鏡檢的臨床應用二、肺結核治療評估的主要依據之一治愈：涂陽肺結核患者完成規(guī)定療程，連續(xù)2次涂片結果陰性，其中1次是治療末的涂片。治療失?。盒峦筷柣颊咧委煹?個月末或療程結束時，痰涂片檢查陽性，涂陰肺結核患者治療過程中任何1次痰菌檢查陽性，均為治療失敗。第12頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五缺點：不能區(qū)別結核分枝桿菌和非結核分支桿菌不能區(qū)別死菌跟活菌。結核桿菌暴露于異煙肼時，某些條件會失去抗酸性，出現假陰性。檢測靈敏度較低（104-105

個細菌/毫升）。第13頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五分枝桿菌分離培養(yǎng)結核菌培養(yǎng)仍是目前診斷結核病的金標準．尤其是藥敏試驗結果在指導臨床用藥及耐藥性檢測等方面具有重要作用,是鑒定是否為活菌的可靠方法．傳統的固態(tài)培養(yǎng)法

需要4～6周才能檢測到結核菌的生長．而且陽性率也只有30％-40％；特異性差．各種分枝桿菌均可生長。要確定是否為結核菌．需結合分枝桿菌菌種鑒定和藥物敏感性試驗。快速培養(yǎng)法:檢測細菌生長過程中代謝產生的CO2或消耗的O2，顯微鏡直接觀察、變色液體培養(yǎng)基等?？焖倥囵B(yǎng)法陽性的報告時間大概是1—3周左右，比傳統的固態(tài)培養(yǎng)法快，但是儀器價格太昂貴。第14頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五確診結核病1份痰標本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性+1份痰標本結核分枝桿菌培養(yǎng)陽性即可確診。痰涂片陰性，肺部影像學檢查符合活動性肺結核影像學表現+1份痰標本結核分枝桿菌培養(yǎng)陽性結核菌培養(yǎng)臨床價值第15頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五用于耐多藥結核療效判定治愈：（1）患者完成療程，且在療程的后12個月，至少最后5次痰培養(yǎng)（每次間隔至少30天）連續(xù)陰性。（2）如出現1次痰培養(yǎng)陽性，其后痰培養(yǎng)（間隔至少30天）最少連續(xù)3次陰性。失?。褐委煹淖詈?2個月，5次痰培養(yǎng)中有兩次或兩次以上陽性；或者在最后的3次，培養(yǎng)中有任何一次是陽性。第16頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五分離培養(yǎng)的優(yōu)點敏感性較直接涂片法高，理論上10-100條菌/毫升可檢出陽性；特異性較直接涂片法高，可以從菌落生長速度、色素產生初步判斷非結核分枝桿菌；分離出具有活力的純培養(yǎng)物，為進一步藥敏試驗提供基礎。第17頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五分離培養(yǎng)的缺點需時長，根據接種量的大小，一般2-8周才能得到肉眼可見菌落。結果受標本保存運送時間、培養(yǎng)基成分和質量、前處理方法等影響，操作較直接涂片法復雜，需經嚴格培訓，對實驗室要求也是較高。成本是直接涂片法的7-8倍。第18頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五結核病實驗室檢查細菌學檢查免疫學檢查分子生物學檢查涂片染色鏡檢分枝桿菌分離培養(yǎng)分支桿菌藥敏試驗分枝桿菌菌種鑒定體液免疫學檢查細胞免疫學檢查第19頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五體液免疫學檢查（血清學檢查）結核抗體測定結核抗原測定循環(huán)免疫復合物測定

第20頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五血清學診斷血清學診斷技術優(yōu)勢：是一種對疾病進行早期診斷的理想方法。無需活細胞培養(yǎng)和特殊儀器設備操作簡便結果顯示快速目前用于血清學診斷的主要方法:酶聯免疫吸附試驗(ELlSA)斑點金免疫滲濾法(DIGFA)免疫印跡法(WesternBlotting)等等第21頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五2011年WHO正式公告：由于目前的商業(yè)血清學試劑在結核檢測中存在較大差異，且檢測結果很高比例的假陽性和假陰性，因此不建議使用血清學方法作為結核桿菌的診斷實驗1。1WHOCommercialSerodiagnosticTestsforDiagnosisofTuberculosis./publications/2011/9789241502054_eng.pdf血清學檢測的評價原因：由于所用的測定方法、使用的試劑種類或抗原、抗體的不同等，導致測定結果差異較大，并且缺乏可比性。WHO對來自不同國家的19種試劑盒產品進行評估，結果表明：與痰培養(yǎng)相比，這些試劑盒檢測的靈敏度為1%~60%，特異度為53~99%1

。第22頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五結核病細胞免疫學檢查結核菌素皮膚實驗蛋白水平分子診斷:γ-干擾素釋放實驗（IGRA)第23頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五遲發(fā)型細胞超敏反應1）方法：1:2000OT或PPD液0.1毫升(5單位)，左前臂屈側中部皮內注射，48～72h測量皮膚硬結的直徑。結核菌素實驗（PPD試驗）第24頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五2）判斷標準：陰性≤4mm弱陽性5-9mm陽性10-19mm，強陽性≥20mm或局部出現水泡與壞死第25頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五3)結核菌素試驗的意義陰性：無結核菌感染；不能排除結核感染。陽性：曾有結核感染，并不一定現在患病。強陽性：活動性結核病可能

A、變態(tài)反應尚未建立；

B、免疫抑制如應用皮質激素或營養(yǎng)不良等

第26頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五

PPD所含抗原為致病性分枝桿菌、環(huán)境分枝桿菌及卡介苗菌株所共有，其結果受到卡介苗接種及其他分枝桿菌感染的影響，特異性較差。當出現免疫功能低下時可出現假陰性結果，敏感性低。

免疫力正常的陰性有一定意義。強陽性有一定意義。有結核變態(tài)反應、淋巴結核強陽性多。

經濟、簡便，可以用于流行病學大規(guī)模的篩查和普查，但存在著明顯的缺陷。PPD試驗臨床價值第27頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五結核感染者體內存在特異的效應T淋巴細胞，效應T淋巴細胞再次受到結核抗原刺激時會分泌多種細胞因子（IFN-γ）。因此，檢測效應T淋巴細胞可用于結核病或結核潛伏感染者的診斷。由于效應T細胞存活時間很短，而且具有特異性，因此可以作為機體是否正處于被感染的指標，無論是否有臨床癥狀?；贗GRA原理的產品目前已被美國、加拿大、英國、德國、意大利、瑞士、法國、荷蘭、日本等二十余個國家寫入本國的結核診療指南中。目前應用的進口IGRA主要有兩種商品化的試劑：1）澳大利亞Cellestis公司的QuantiFERON-TBGOLDInTube（QFT-GIT）2）英國OxfordImmunotec公司的T-SPOT.TB蛋白水平分子診斷:γ-干擾素釋放實驗（IGRA)第28頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五T-SPOT?.TB原理T-SPOT?.TB是以擁有專利的特異抗原（ESAT-6/CFP-10），通過酶聯免疫斑點技術（ELISPOT）檢測受試者體內是否存在結核效應T淋巴細胞，從而判斷目前該受試者是否感染結核桿菌（現癥感染）的新方法。結核桿菌特異抗原：早期分泌抗原靶6（EarlySecretedAntigenicRarget6，ESAT-6）培養(yǎng)濾液蛋白10（CultureFiltrateProtein10，CFP10）第29頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五T-SPOT?.TB臨床性能指標特異性只針對結核分枝桿菌復合群敏感，與絕大多數環(huán)境分枝桿菌和卡介苗（BCG）無交叉反應

美國FDA數據：特異性97.1%(297/306)國內臨床數據：特異性94.1%(478/508)靈敏度基本不受免疫力低下/受抑制影響，在肺外結核患者中有很高的檢出率美國FDA數據：靈敏度95.6%(175/183)國內臨床數據：靈敏度95.3%(624/655)第30頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五實驗結果的解釋陰性結果提示患者體內不存在針對結核桿菌特異的效應T細胞。假陰性結果：①感染階段不同；②少數免疫系統功能不全患者陽性結果提示患者體內存在針對結核桿菌特異的效應T細胞，患者存在結核感染。但是否是活動性結核病，需結合臨床癥狀和其它檢測指標綜合判斷。假陽性結果：①4種環(huán)境分枝桿菌感染時：M.kansasii（堪薩斯）、M.szulgai（蘇氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）第31頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五方法學的優(yōu)點檢測特異性的提高幫助臨床區(qū)分卡介苗接種和環(huán)境分枝桿菌感染引起的“假陽性”，避免了臨床的無效用藥檢測靈敏度的提高有利于臨床對結核病的早發(fā)現、早治療，避免了疾病的傳播與擴散快速48小時出結果第32頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五方法學的局限不能區(qū)分活動性TB與潛伏感染不能夠提示臨床患者的病變部位，需要結合臨床的判斷目前還不能夠根據斑點數量的多少來判斷患者是活動性結核病或是潛伏感染者不適合用于結核病患者治療的療效監(jiān)測檢測收費高（600-700元/次）第33頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五體外r-干擾素釋放試驗

活動性結核病通過有效的抗結核治療后，結核桿菌載量下降，效應T細胞數量會隨之減少，所以理論上IGRA結果應從陽性轉變?yōu)殛幮?，但臨床實踐中發(fā)現IGRA結果轉陰率非常低。2012年發(fā)表的一篇meta分析中指出，T-SPOT.TB在結核病患者抗結核治療后轉陰率為5.71%-13.93%，說明IGRA在評價抗結核治療方面作用是有限的。

ChiappiniE,FossiF,BonsignoriF,etal.Utilityofinterferon-γreleaseassayresultstomonitoranti-tuberculartreatmentinadultsandchildren.ClinTher,2012,34:1041-1048.

IGRA在評價抗結核治療中的作用是有限的第34頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五結核病實驗室檢查細菌學檢查免疫學檢查分子生物學檢查涂片染色鏡檢分枝桿菌分離培養(yǎng)分支桿菌藥敏試驗分枝桿菌菌種鑒定體液免疫學診斷細胞免疫學診斷聚合酶鏈反應（PCR）DNA測序DNA探針技術基因芯片技術第35頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五分子生物學檢測方法近年來核酸擴增技術和雜交分析技術的發(fā)展，為分枝桿菌的檢測、鑒定和藥敏實驗提供了極大的方便，可將診斷時間從幾周降低到幾天甚至是幾個小時。研究、應用報道較多的結核病基因診斷技術主要包括聚合酶鏈反應(PCR)、核酸探針雜交、DNA序列測定、基因芯片、基因分型等。第36頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五實時熒光PCR技術本實驗室所使用的結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）采用單管單人份的分裝技術，操作過程非常簡便；并引入熒光檢測技術，簡化了檢測步驟，并且整個擴增及擴增后檢測都無需打開擴增管蓋，從根本上克服了PCR遺留污染。熒光探針PCR檢測技術綜合了PCR擴增的高敏感性、探針雜交的高特異性及熒光能量轉移的實時跟蹤特性，使檢測的準確性大大提高，并可充分保證檢測的穩(wěn)定性及重復性。第37頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五結核桿菌PCR檢測的臨床意義1.在痰菌陰性結核快速診斷有重要臨床應用價值。在臨床工作中，痰菌陰性，經臨床綜合分析后診斷為肺結核的患者，約占肺結核患者的60%-70%。有報道指出痰菌陰性的肺結核患者，如果未經抗結核治療，經過1-3年的隨訪，將有40%-60%的患者發(fā)展為菌陽甚至更典型的肺結核。所以獲得病原學的診斷至關重要第38頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五結核桿菌PCR檢測的臨床意義2012年發(fā)表在中國防癆雜志中的一篇文章的研究指出在476例菌陰肺結核病患者中，PCR法檢出116例陽性，檢測的靈敏度為24.4%而菌陽肺結核患者的檢測靈敏度為97.0%第39頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五結核桿菌PCR檢測的臨床意義2、PCR法可以作為臨床痰涂片和痰培養(yǎng)的補充，為臨床診斷和治療提供幫助涂片陽性并不能區(qū)分是結核分枝桿菌還是非結核分枝桿菌，這兩者的治療是有很大的差異的，NTM對于常用的抗結核藥經常都是無效的，所以對于涂片陽性的標本，很有必要在在做MTB-DNA的檢測，進一步確認是否是真的MTB的感染。第40頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五結核桿菌PCR檢測的臨床意義3.可作為結核性關節(jié)炎和泌尿系統結核早期診斷的一個可靠指標。118例疑似結核病患者,其中關節(jié)炎患者52例,泌尿系感染患者66例,應用FQ-PCR技術分別檢測患者關節(jié)腔積液和尿液中的TB-DNA,并與抗酸染色法的檢出率比較。結果52例關節(jié)炎患者中,確診結核性關節(jié)炎患者36例,TB-DNA陽性22例,22例全部為確診病例,陽性率61.1%?？顾崛旧年栃灾挥?例,陽性率5.6%;66例泌尿系統疾病患者中,確診泌尿系結核患者52例,TB-DNA陽性32例,32例全部為確診病例,陽性率為61.5%,抗酸染色的陽性只有4例,陽性率7.7%。結論應用FQ-PCR技術檢測患者關節(jié)腔積液和尿液中的TB-DNA,具有高度敏感性和特異性,可作為結核性關節(jié)炎和泌尿系統結核早期診斷的一個可靠指標?！?010年發(fā)表在中國防癆》雜志第41頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五結核桿菌PCR檢測的臨床意義4、PCR用于臨床療效觀察比涂片、培養(yǎng)實用，對估計有可能復發(fā)的病例有一定的幫助有些耐藥菌或患者經化療后痰排菌可能轉化為Ｌ型結核分枝桿菌，抗酸染色不能有效檢測，而ＰＣＲ檢測細菌ＤＮＡ，不受其表型變化影響，所以ＰＣＲ較抗酸染色法對Ｍｔｂ有更強的檢出能力，能更有效地發(fā)現傳染源、降低漏診率，是早期診斷肺結核比較好的指標。L型的結核分支桿菌是形成慢性傳染源的主要原因,也是結核病惡化、復發(fā)的細菌學根源。所以對年老體弱、合并有其它機體疾病、痰中含菌量多、肺部結核病變廣泛、有空洞存在、化療期滿、微生物學檢查(涂片加培養(yǎng))陰轉但

PCR仍持續(xù)陽性的患者,應采取繼續(xù)密切觀察,或同時考慮更改治療方案或延長治療時間及隨訪時間等做法。第42頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五第43頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五美國CDC建議：在同時獲得核酸檢測和涂片結果后，

根據其結果不同可分為4種情況1.對于核酸檢測和抗酸桿菌涂片結果均為陽性的患者，需高度懷疑結核病，在等待培養(yǎng)結果的同時，可以開始抗結核治療。2.對于核酸檢測陽性，而涂片