結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義

關(guān)于結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第1頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五主要內(nèi)容一、結(jié)核桿菌的病原學(xué)基礎(chǔ)

二、結(jié)合分支桿菌全球的流行情況三、結(jié)核桿菌的實驗室檢測方法及臨床應(yīng)用第2頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五一、結(jié)核病的病原學(xué)基礎(chǔ)結(jié)核桿菌屬：一類細(xì)長略帶彎曲，有時呈分枝狀的桿菌，本屬細(xì)菌多具有抗酸性，又稱抗酸桿菌（acid-fastbacillus），細(xì)菌體內(nèi)含有分枝菌酸，細(xì)胞壁含有大量脂類，這與分枝桿菌的染色性、抵抗力和致病性等密切相關(guān)。本屬細(xì)菌已經(jīng)被鑒定的有70多種，可分為三大類：結(jié)核分枝桿菌、非典型分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌；按生長速度可分為三類，即緩慢生長菌、迅速生長菌和不能培養(yǎng)菌三種類型第3頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五結(jié)核分枝桿菌群結(jié)核分枝桿菌，是人和動物結(jié)核病的病原體，包括人結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis）、牛分支桿菌（M.bovis）、非洲分支桿菌（M.africanum）和田鼠分枝桿菌（M.microti），前三種對人類治病，其中人型結(jié)核分枝桿菌感染發(fā)病率最高。結(jié)核分枝桿菌屬于緩慢生長分支桿菌第4頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五第5頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五及時準(zhǔn)確的診斷結(jié)核病，有效地控制傳染源，對預(yù)防結(jié)核病至關(guān)重要。第6頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五結(jié)核病實驗室檢查細(xì)菌學(xué)檢查免疫學(xué)檢查分子生物學(xué)檢查涂片染色鏡檢分枝桿菌分離培養(yǎng)分支桿菌藥敏試驗分枝桿菌菌種鑒定第7頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五最原始最基礎(chǔ)的檢測方法涂片染色鏡檢第8頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五抗酸染色的原理分枝桿菌的細(xì)胞壁內(nèi)含有大量的脂質(zhì)。包圍在肽聚糖的外面，所以分支桿菌一般不易著色，需要經(jīng)過加熱或是延長染色時間來促使其著色。但分支桿菌中的分支菌酸與染料結(jié)合后，就很難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色。第9頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五涂片染色鏡檢臨床價值

適用于多種標(biāo)本；操作簡便，價格低廉。第10頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五涂片鏡檢的臨床應(yīng)用

一、確診涂陽結(jié)核病及開放性結(jié)核2份痰標(biāo)本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性；1份痰標(biāo)本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性+影像學(xué)檢查符合活動性肺結(jié)核表現(xiàn)。第11頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五涂片鏡檢的臨床應(yīng)用二、肺結(jié)核治療評估的主要依據(jù)之一治愈：涂陽肺結(jié)核患者完成規(guī)定療程，連續(xù)2次涂片結(jié)果陰性，其中1次是治療末的涂片。治療失敗：新涂陽患者治療第5個月末或療程結(jié)束時，痰涂片檢查陽性，涂陰肺結(jié)核患者治療過程中任何1次痰菌檢查陽性，均為治療失敗。第12頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五缺點：不能區(qū)別結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分支桿菌不能區(qū)別死菌跟活菌。結(jié)核桿菌暴露于異煙肼時，某些條件會失去抗酸性，出現(xiàn)假陰性。檢測靈敏度較低（104-105

個細(xì)菌/毫升）。第13頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五分枝桿菌分離培養(yǎng)結(jié)核菌培養(yǎng)仍是目前診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)．尤其是藥敏試驗結(jié)果在指導(dǎo)臨床用藥及耐藥性檢測等方面具有重要作用,是鑒定是否為活菌的可靠方法．傳統(tǒng)的固態(tài)培養(yǎng)法

需要4～6周才能檢測到結(jié)核菌的生長．而且陽性率也只有30％-40％；特異性差．各種分枝桿菌均可生長。要確定是否為結(jié)核菌．需結(jié)合分枝桿菌菌種鑒定和藥物敏感性試驗?？焖倥囵B(yǎng)法:檢測細(xì)菌生長過程中代謝產(chǎn)生的CO2或消耗的O2，顯微鏡直接觀察、變色液體培養(yǎng)基等?？焖倥囵B(yǎng)法陽性的報告時間大概是1—3周左右，比傳統(tǒng)的固態(tài)培養(yǎng)法快，但是儀器價格太昂貴。第14頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五確診結(jié)核病1份痰標(biāo)本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性+1份痰標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性即可確診。痰涂片陰性，肺部影像學(xué)檢查符合活動性肺結(jié)核影像學(xué)表現(xiàn)+1份痰標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性結(jié)核菌培養(yǎng)臨床價值第15頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五用于耐多藥結(jié)核療效判定治愈：（1）患者完成療程，且在療程的后12個月，至少最后5次痰培養(yǎng)（每次間隔至少30天）連續(xù)陰性。（2）如出現(xiàn)1次痰培養(yǎng)陽性，其后痰培養(yǎng)（間隔至少30天）最少連續(xù)3次陰性。失?。褐委煹淖詈?2個月，5次痰培養(yǎng)中有兩次或兩次以上陽性；或者在最后的3次，培養(yǎng)中有任何一次是陽性。第16頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五分離培養(yǎng)的優(yōu)點敏感性較直接涂片法高，理論上10-100條菌/毫升可檢出陽性；特異性較直接涂片法高，可以從菌落生長速度、色素產(chǎn)生初步判斷非結(jié)核分枝桿菌；分離出具有活力的純培養(yǎng)物，為進(jìn)一步藥敏試驗提供基礎(chǔ)。第17頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五分離培養(yǎng)的缺點需時長，根據(jù)接種量的大小，一般2-8周才能得到肉眼可見菌落。結(jié)果受標(biāo)本保存運送時間、培養(yǎng)基成分和質(zhì)量、前處理方法等影響，操作較直接涂片法復(fù)雜，需經(jīng)嚴(yán)格培訓(xùn)，對實驗室要求也是較高。成本是直接涂片法的7-8倍。第18頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五結(jié)核病實驗室檢查細(xì)菌學(xué)檢查免疫學(xué)檢查分子生物學(xué)檢查涂片染色鏡檢分枝桿菌分離培養(yǎng)分支桿菌藥敏試驗分枝桿菌菌種鑒定體液免疫學(xué)檢查細(xì)胞免疫學(xué)檢查第19頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五體液免疫學(xué)檢查（血清學(xué)檢查）結(jié)核抗體測定結(jié)核抗原測定循環(huán)免疫復(fù)合物測定

第20頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五血清學(xué)診斷血清學(xué)診斷技術(shù)優(yōu)勢：是一種對疾病進(jìn)行早期診斷的理想方法。無需活細(xì)胞培養(yǎng)和特殊儀器設(shè)備操作簡便結(jié)果顯示快速目前用于血清學(xué)診斷的主要方法:酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELlSA)斑點金免疫滲濾法(DIGFA)免疫印跡法(WesternBlotting)等等第21頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五2011年WHO正式公告：由于目前的商業(yè)血清學(xué)試劑在結(jié)核檢測中存在較大差異，且檢測結(jié)果很高比例的假陽性和假陰性，因此不建議使用血清學(xué)方法作為結(jié)核桿菌的診斷實驗1。1WHOCommercialSerodiagnosticTestsforDiagnosisofTuberculosis./publications/2011/9789241502054_eng.pdf血清學(xué)檢測的評價原因：由于所用的測定方法、使用的試劑種類或抗原、抗體的不同等，導(dǎo)致測定結(jié)果差異較大，并且缺乏可比性。WHO對來自不同國家的19種試劑盒產(chǎn)品進(jìn)行評估，結(jié)果表明：與痰培養(yǎng)相比，這些試劑盒檢測的靈敏度為1%~60%，特異度為53~99%1

。第22頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五結(jié)核病細(xì)胞免疫學(xué)檢查結(jié)核菌素皮膚實驗蛋白水平分子診斷:γ-干擾素釋放實驗（IGRA)第23頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五遲發(fā)型細(xì)胞超敏反應(yīng)1）方法：1:2000OT或PPD液0.1毫升(5單位)，左前臂屈側(cè)中部皮內(nèi)注射，48～72h測量皮膚硬結(jié)的直徑。結(jié)核菌素實驗（PPD試驗）第24頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五2）判斷標(biāo)準(zhǔn)：陰性≤4mm弱陽性5-9mm陽性10-19mm，強陽性≥20mm或局部出現(xiàn)水泡與壞死第25頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五3)結(jié)核菌素試驗的意義陰性：無結(jié)核菌感染；不能排除結(jié)核感染。陽性：曾有結(jié)核感染，并不一定現(xiàn)在患病。強陽性：活動性結(jié)核病可能

A、變態(tài)反應(yīng)尚未建立；

B、免疫抑制如應(yīng)用皮質(zhì)激素或營養(yǎng)不良等

第26頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五

PPD所含抗原為致病性分枝桿菌、環(huán)境分枝桿菌及卡介苗菌株所共有，其結(jié)果受到卡介苗接種及其他分枝桿菌感染的影響，特異性較差。當(dāng)出現(xiàn)免疫功能低下時可出現(xiàn)假陰性結(jié)果，敏感性低。

免疫力正常的陰性有一定意義。強陽性有一定意義。有結(jié)核變態(tài)反應(yīng)、淋巴結(jié)核強陽性多。

經(jīng)濟、簡便，可以用于流行病學(xué)大規(guī)模的篩查和普查，但存在著明顯的缺陷。PPD試驗臨床價值第27頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五結(jié)核感染者體內(nèi)存在特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞再次受到結(jié)核抗原刺激時會分泌多種細(xì)胞因子（IFN-γ）。因此，檢測效應(yīng)T淋巴細(xì)胞可用于結(jié)核病或結(jié)核潛伏感染者的診斷。由于效應(yīng)T細(xì)胞存活時間很短，而且具有特異性，因此可以作為機體是否正處于被感染的指標(biāo)，無論是否有臨床癥狀。基于IGRA原理的產(chǎn)品目前已被美國、加拿大、英國、德國、意大利、瑞士、法國、荷蘭、日本等二十余個國家寫入本國的結(jié)核診療指南中。目前應(yīng)用的進(jìn)口IGRA主要有兩種商品化的試劑：1）澳大利亞Cellestis公司的QuantiFERON-TBGOLDInTube（QFT-GIT）2）英國OxfordImmunotec公司的T-SPOT.TB蛋白水平分子診斷:γ-干擾素釋放實驗（IGRA)第28頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五T-SPOT?.TB原理T-SPOT?.TB是以擁有專利的特異抗原（ESAT-6/CFP-10），通過酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)（ELISPOT）檢測受試者體內(nèi)是否存在結(jié)核效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，從而判斷目前該受試者是否感染結(jié)核桿菌（現(xiàn)癥感染）的新方法。結(jié)核桿菌特異抗原：早期分泌抗原靶6（EarlySecretedAntigenicRarget6，ESAT-6）培養(yǎng)濾液蛋白10（CultureFiltrateProtein10，CFP10）第29頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五T-SPOT?.TB臨床性能指標(biāo)特異性只針對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群敏感，與絕大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌和卡介苗（BCG）無交叉反應(yīng)

美國FDA數(shù)據(jù)：特異性97.1%(297/306)國內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：特異性94.1%(478/508)靈敏度基本不受免疫力低下/受抑制影響，在肺外結(jié)核患者中有很高的檢出率美國FDA數(shù)據(jù)：靈敏度95.6%(175/183)國內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：靈敏度95.3%(624/655)第30頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五實驗結(jié)果的解釋陰性結(jié)果提示患者體內(nèi)不存在針對結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T細(xì)胞。假陰性結(jié)果：①感染階段不同；②少數(shù)免疫系統(tǒng)功能不全患者陽性結(jié)果提示患者體內(nèi)存在針對結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T細(xì)胞，患者存在結(jié)核感染。但是否是活動性結(jié)核病，需結(jié)合臨床癥狀和其它檢測指標(biāo)綜合判斷。假陽性結(jié)果：①4種環(huán)境分枝桿菌感染時：M.kansasii（堪薩斯）、M.szulgai（蘇氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）第31頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五方法學(xué)的優(yōu)點檢測特異性的提高幫助臨床區(qū)分卡介苗接種和環(huán)境分枝桿菌感染引起的“假陽性”，避免了臨床的無效用藥檢測靈敏度的提高有利于臨床對結(jié)核病的早發(fā)現(xiàn)、早治療，避免了疾病的傳播與擴散快速48小時出結(jié)果第32頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五方法學(xué)的局限不能區(qū)分活動性TB與潛伏感染不能夠提示臨床患者的病變部位，需要結(jié)合臨床的判斷目前還不能夠根據(jù)斑點數(shù)量的多少來判斷患者是活動性結(jié)核病或是潛伏感染者不適合用于結(jié)核病患者治療的療效監(jiān)測檢測收費高（600-700元/次）第33頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五體外r-干擾素釋放試驗

活動性結(jié)核病通過有效的抗結(jié)核治療后，結(jié)核桿菌載量下降，效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量會隨之減少，所以理論上IGRA結(jié)果應(yīng)從陽性轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮?，但臨床實踐中發(fā)現(xiàn)IGRA結(jié)果轉(zhuǎn)陰率非常低。2012年發(fā)表的一篇meta分析中指出，T-SPOT.TB在結(jié)核病患者抗結(jié)核治療后轉(zhuǎn)陰率為5.71%-13.93%，說明IGRA在評價抗結(jié)核治療方面作用是有限的。

ChiappiniE,FossiF,BonsignoriF,etal.Utilityofinterferon-γreleaseassayresultstomonitoranti-tuberculartreatmentinadultsandchildren.ClinTher,2012,34:1041-1048.

IGRA在評價抗結(jié)核治療中的作用是有限的第34頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五結(jié)核病實驗室檢查細(xì)菌學(xué)檢查免疫學(xué)檢查分子生物學(xué)檢查涂片染色鏡檢分枝桿菌分離培養(yǎng)分支桿菌藥敏試驗分枝桿菌菌種鑒定體液免疫學(xué)診斷細(xì)胞免疫學(xué)診斷聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）DNA測序DNA探針技術(shù)基因芯片技術(shù)第35頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五分子生物學(xué)檢測方法近年來核酸擴增技術(shù)和雜交分析技術(shù)的發(fā)展，為分枝桿菌的檢測、鑒定和藥敏實驗提供了極大的方便，可將診斷時間從幾周降低到幾天甚至是幾個小時。研究、應(yīng)用報道較多的結(jié)核病基因診斷技術(shù)主要包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、核酸探針雜交、DNA序列測定、基因芯片、基因分型等。第36頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五實時熒光PCR技術(shù)本實驗室所使用的結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）采用單管單人份的分裝技術(shù)，操作過程非常簡便；并引入熒光檢測技術(shù)，簡化了檢測步驟，并且整個擴增及擴增后檢測都無需打開擴增管蓋，從根本上克服了PCR遺留污染。熒光探針PCR檢測技術(shù)綜合了PCR擴增的高敏感性、探針雜交的高特異性及熒光能量轉(zhuǎn)移的實時跟蹤特性，使檢測的準(zhǔn)確性大大提高，并可充分保證檢測的穩(wěn)定性及重復(fù)性。第37頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五結(jié)核桿菌PCR檢測的臨床意義1.在痰菌陰性結(jié)核快速診斷有重要臨床應(yīng)用價值。在臨床工作中，痰菌陰性，經(jīng)臨床綜合分析后診斷為肺結(jié)核的患者，約占肺結(jié)核患者的60%-70%。有報道指出痰菌陰性的肺結(jié)核患者，如果未經(jīng)抗結(jié)核治療，經(jīng)過1-3年的隨訪，將有40%-60%的患者發(fā)展為菌陽甚至更典型的肺結(jié)核。所以獲得病原學(xué)的診斷至關(guān)重要第38頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五結(jié)核桿菌PCR檢測的臨床意義2012年發(fā)表在中國防癆雜志中的一篇文章的研究指出在476例菌陰肺結(jié)核病患者中，PCR法檢出116例陽性，檢測的靈敏度為24.4%而菌陽肺結(jié)核患者的檢測靈敏度為97.0%第39頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五結(jié)核桿菌PCR檢測的臨床意義2、PCR法可以作為臨床痰涂片和痰培養(yǎng)的補充，為臨床診斷和治療提供幫助涂片陽性并不能區(qū)分是結(jié)核分枝桿菌還是非結(jié)核分枝桿菌，這兩者的治療是有很大的差異的，NTM對于常用的抗結(jié)核藥經(jīng)常都是無效的，所以對于涂片陽性的標(biāo)本，很有必要在在做MTB-DNA的檢測，進(jìn)一步確認(rèn)是否是真的MTB的感染。第40頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五結(jié)核桿菌PCR檢測的臨床意義3.可作為結(jié)核性關(guān)節(jié)炎和泌尿系統(tǒng)結(jié)核早期診斷的一個可靠指標(biāo)。118例疑似結(jié)核病患者,其中關(guān)節(jié)炎患者52例,泌尿系感染患者66例,應(yīng)用FQ-PCR技術(shù)分別檢測患者關(guān)節(jié)腔積液和尿液中的TB-DNA,并與抗酸染色法的檢出率比較。結(jié)果52例關(guān)節(jié)炎患者中,確診結(jié)核性關(guān)節(jié)炎患者36例,TB-DNA陽性22例,22例全部為確診病例,陽性率61.1%?？顾崛旧年栃灾挥?例,陽性率5.6%;66例泌尿系統(tǒng)疾病患者中,確診泌尿系結(jié)核患者52例,TB-DNA陽性32例,32例全部為確診病例,陽性率為61.5%,抗酸染色的陽性只有4例,陽性率7.7%。結(jié)論應(yīng)用FQ-PCR技術(shù)檢測患者關(guān)節(jié)腔積液和尿液中的TB-DNA,具有高度敏感性和特異性,可作為結(jié)核性關(guān)節(jié)炎和泌尿系統(tǒng)結(jié)核早期診斷的一個可靠指標(biāo)?！?010年發(fā)表在中國防癆》雜志第41頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五結(jié)核桿菌PCR檢測的臨床意義4、PCR用于臨床療效觀察比涂片、培養(yǎng)實用，對估計有可能復(fù)發(fā)的病例有一定的幫助有些耐藥菌或患者經(jīng)化療后痰排菌可能轉(zhuǎn)化為Ｌ型結(jié)核分枝桿菌，抗酸染色不能有效檢測，而ＰＣＲ檢測細(xì)菌ＤＮＡ，不受其表型變化影響，所以ＰＣＲ較抗酸染色法對Ｍｔｂ有更強的檢出能力，能更有效地發(fā)現(xiàn)傳染源、降低漏診率，是早期診斷肺結(jié)核比較好的指標(biāo)。L型的結(jié)核分支桿菌是形成慢性傳染源的主要原因,也是結(jié)核病惡化、復(fù)發(fā)的細(xì)菌學(xué)根源。所以對年老體弱、合并有其它機體疾病、痰中含菌量多、肺部結(jié)核病變廣泛、有空洞存在、化療期滿、微生物學(xué)檢查(涂片加培養(yǎng))陰轉(zhuǎn)但

PCR仍持續(xù)陽性的患者,應(yīng)采取繼續(xù)密切觀察,或同時考慮更改治療方案或延長治療時間及隨訪時間等做法。第42頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五第43頁，共50頁，2022年，5月20日，19點36分，星期五美國CDC建議：在同時獲得核酸檢測和涂片結(jié)果后，

根據(jù)其結(jié)果不同可分為4種情況1.對于核酸檢測和抗酸桿菌涂片結(jié)果均為陽性的患者，需高度懷疑結(jié)核病，在等待培養(yǎng)結(jié)果的同時，可以開始抗結(jié)核治療。2.對于核酸檢測陽性，而涂片