基因工程的操作程序培訓(xùn)課件

復(fù)習(xí)回顧1、基因工程又稱為？基因工程的原理是?2、基因工程中用到的工具中，“分子手術(shù)刀”是？來源是？其作用是？體現(xiàn)了酶的什么特性？作用部位是什么鍵？3、限制酶切割之后的結(jié)果是產(chǎn)生？從中軸線兩側(cè)切割得到的是什么末端？從中軸線處切開呢？4、獲得目的基因需要切幾個(gè)切口？產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？切割質(zhì)粒呢？5、“分子縫合針”是？根據(jù)什么分為兩大類？哪兩大類？這兩類酶的區(qū)別是？6、DNA連接酶連接的是？DNA聚合酶連接的是？7、DNA連接酶作用于什么鍵？復(fù)習(xí)回顧1、基因工程又稱為？基因工程的原理是?18、載體主要有哪幾類？其中，最常用的是？它的本質(zhì)是？9、載體必須具備的四個(gè)條件是？10、寫出限制酶切割后的黏性末端。8、載體主要有哪幾類？其中，最常用的是？它的本質(zhì)是？2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序3原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(補(bǔ)充內(nèi)容）非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子①不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì),連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)②調(diào)控遺傳信息表達(dá),上游有啟動(dòng)子，下游有終止子原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(補(bǔ)充內(nèi)容）非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上4真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用,上游有啟動(dòng)子，下游有終止子非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA5

基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個(gè)步驟？1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定問題1基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個(gè)步驟？1、6一：目的基因的獲取

如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗?。共《尽⒖辜?xì)菌）基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。

1.目的基因主要是指___________________編碼蛋白質(zhì)的基因目的基因指的是：？也可以是具有調(diào)控作用的因子一：目的基因的獲取如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因7獲取目的基因的常用方法有哪些?1、從基因文庫中獲取目的基因2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因3、人工合成目的基因反轉(zhuǎn)錄法化學(xué)合成法獲取目的基因的常用方法有哪些?1、從基因文庫中獲取目的基因反8(一)從基因文庫中獲取目的基因?qū)⒑心撤N生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫1.基因文庫概念2.基因文庫類型基因組文庫部分基因文庫（包含一種生物的所有基因）（包含一種生物的一部分基因）(一)從基因文庫中獲取目的基因?qū)⒑心撤N生物9(一)從基因文庫中獲取目的基因3.基因組文庫的構(gòu)建提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼敢欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存基因組文庫(一)從基因文庫中獲取目的基因3.基因組文庫的構(gòu)建提取某種生104.cDNA文庫的構(gòu)建提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時(shí)期的mRNA單鏈DNA雙鏈cDNA片段重組載體與載體連接cDNA文庫反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存4.cDNA文庫的構(gòu)建提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時(shí)期的m11兩種基因文庫的主要區(qū)別如下表（課本P10）文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小小大基因中啟動(dòng)子無有基因中內(nèi)含子無有基因多少部分基因全部基因物種間的基因交流可以部分基因可以總結(jié)兩種基因文庫的主要區(qū)別如下表（課本P10）文庫類型cDNA文121、概念：PCR全稱為________________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制_____________的核酸合成技術(shù)3、條件：2、原理：__________多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA雙鏈復(fù)制(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因模板（目的基因）原料(脫氧核苷酸)引物（一小段單鏈DNA）耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）溫度控制4、操作前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。1、概念：PCR全稱為________________，是一136、結(jié)果：

5、擴(kuò)增形式：指數(shù)形式（2n）在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因7、過程：a、變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、復(fù)性（55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物開始進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈6、結(jié)果：5、擴(kuò)增形式：指14基因工程的操作程序培訓(xùn)課件15(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因動(dòng)畫演示(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因動(dòng)畫演示16（三）人工合成目的基因反轉(zhuǎn)錄法：以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。（三）人工合成目的基因反轉(zhuǎn)錄法：17化學(xué)合成法DNA合成儀推測(cè)推測(cè)合成前提：基因比較小、核苷酸序列已知蛋白質(zhì)的氨基酸順序mRNA核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因化學(xué)合成法DNA合成儀推測(cè)推測(cè)合成前提：基因比較小、核18問題43、如果不知道目的基因的核苷酸序列，可采用_________________獲取目的基因的三種方法應(yīng)用1、如果有目的基因的核苷酸序列，而且基因比較大，可采用____________

2、如果知道目的基因的序列，而且基因比較小，可采用________________PCR技術(shù)擴(kuò)增化學(xué)合成法從基因文庫獲取的方法問題43、如果不知道目的基因的核苷酸序列，可采用______19復(fù)習(xí)回顧1、基因工程的基本操作程序的四個(gè)步驟是？核心是？2、目的基因指的是什么基因？3、獲取目的基因常用的三種方法是？其中人工合成法又包括哪兩種?4、基因文庫包括哪兩類？5、PCR的原理是？PCR全稱是？PCR擴(kuò)增過程中的解旋方式是？PCR需要的條件有？6、基因表達(dá)載體的構(gòu)建的目的是？7、一個(gè)基因表達(dá)載體的組成包括哪幾部分？8、標(biāo)記基因的作用是？9、啟動(dòng)子，終止子的位置，作用？起始密碼子，終止密碼子呢？復(fù)習(xí)回顧1、基因工程的基本操作程序的四個(gè)步驟是？核心是？20二：基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心1目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2組成：目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因等二：基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心1目的：2組成：21啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄（與終止密碼子區(qū)別）標(biāo)記基因：鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，RNA聚合酶識(shí)223.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個(gè)切口四個(gè)黏性末端DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個(gè)切口D23三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1轉(zhuǎn)化概念：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。2轉(zhuǎn)化的實(shí)質(zhì)：目的基因整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1轉(zhuǎn)化概念：2轉(zhuǎn)化的實(shí)質(zhì)：24生物種類植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射法Ca2＋處理法受體細(xì)胞一般是體細(xì)胞受精卵-------------4、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法生物種類植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注251、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

①農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力②原理：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：易感染雙子葉植物和裸子植物26三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞構(gòu)建基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌植物細(xì)胞導(dǎo)入穩(wěn)定維持和表達(dá)③過程：三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞構(gòu)建基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌植物細(xì)胞導(dǎo)27（2）基因槍法：目的基因?qū)雴巫尤~植物細(xì)胞（2）基因槍法：目的基因?qū)雴巫尤~植物細(xì)胞28基因槍法基因槍法29（3）花粉管通道法：將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞①操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管還末愈合前期，剪去柱頭，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞②特點(diǎn):十分簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)。

③例：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉（我國(guó)）（3）花粉管通道法：將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞①操作方法：在植物30（4）、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞方法：顯微注射法目的基因表達(dá)載體提純

取卵（受精卵）顯微注射受精卵新性狀動(dòng)物為什么動(dòng)物細(xì)胞要用受精卵做受體細(xì)胞？全能性受限制（4）、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞方法：顯微注射法目的基因表達(dá)載31（5）、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞①微生物作受體細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少②常用菌：大腸桿菌③常用法：Ca2+處理獲得感受態(tài)細(xì)胞（改變細(xì)胞壁的通透性）④過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合（5）、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞①微生物作受體細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：Ca32導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝入重組DNA分子嗎？真正能攝入重組DNA分子的受體細(xì)胞很少，且有的會(huì)攝入載體-載體，目的基因-目的基因類型目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達(dá)？不一定，需要檢測(cè)問題4問題5導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝入重組DNA分子嗎？33——檢查是否成功分子水平個(gè)體水平：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法、工具：方法、工具：方法、工具：DNA分子雜交、DNA探針分子雜交、DNA探針抗原-抗體雜交、抗體

四、目的基因的檢測(cè)與鑒定方法：接種實(shí)驗(yàn)——檢查是否成功分子個(gè)體水平：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA34轉(zhuǎn)基因生物的DNA探針15N15N14N14N（1）檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因基因探針：放射性同位素等標(biāo)記的含有目的基因DNA片段方法——DNA分子雜交技術(shù)變性變性轉(zhuǎn)基因生探針15N15N14N14N（1）檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色35知識(shí)延伸——DNA分子雜交技術(shù)該方法是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，把互補(bǔ)的雙鏈DNA解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測(cè)的DNA中的同源互補(bǔ)序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。知識(shí)延伸——DNA分子雜交技術(shù)該方法是根據(jù)36變性方法——分子雜交技術(shù)（2）檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA探針15N15N轉(zhuǎn)基因生物的mRNA14N14N變性方法——分子雜交技術(shù)（2）檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRN37提?。?）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法——抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質(zhì)

出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)提?。?）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法——抗原-抗體雜交38（4）除上述分子檢測(cè)外，有時(shí)還需進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定：如抗性特性（4）除上述分子檢測(cè)外，有時(shí)還需進(jìn)行39——檢查是否成功分子水平個(gè)體水平：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法、工具：方法、工具：方法、工具：DNA分子雜交、DNA探針分子雜交、DNA探針抗原-抗體雜交、抗體

四、目的基因的檢測(cè)與鑒定方法：接種實(shí)驗(yàn)——檢查是否成功分子個(gè)體水平：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA40歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯鑒定：歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因41【資料】cDNA合成過程是：第一步，反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步，核酸酶使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子?！举Y料】cDNA合成過程是：42復(fù)習(xí)回顧1、基因工程又稱為？基因工程的原理是?2、基因工程中用到的工具中，“分子手術(shù)刀”是？來源是？其作用是？體現(xiàn)了酶的什么特性？作用部位是什么鍵？3、限制酶切割之后的結(jié)果是產(chǎn)生？從中軸線兩側(cè)切割得到的是什么末端？從中軸線處切開呢？4、獲得目的基因需要切幾個(gè)切口？產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？切割質(zhì)粒呢？5、“分子縫合針”是？根據(jù)什么分為兩大類？哪兩大類？這兩類酶的區(qū)別是？6、DNA連接酶連接的是？DNA聚合酶連接的是？7、DNA連接酶作用于什么鍵？復(fù)習(xí)回顧1、基因工程又稱為？基因工程的原理是?438、載體主要有哪幾類？其中，最常用的是？它的本質(zhì)是？9、載體必須具備的四個(gè)條件是？10、寫出限制酶切割后的黏性末端。8、載體主要有哪幾類？其中，最常用的是？它的本質(zhì)是？44基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序45原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(補(bǔ)充內(nèi)容）非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子①不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì),連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)②調(diào)控遺傳信息表達(dá),上游有啟動(dòng)子，下游有終止子原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(補(bǔ)充內(nèi)容）非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上46真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用,上游有啟動(dòng)子，下游有終止子非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA47

基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個(gè)步驟？1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定問題1基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個(gè)步驟？1、48一：目的基因的獲取

如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗?。共《?、抗細(xì)菌）基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。

1.目的基因主要是指___________________編碼蛋白質(zhì)的基因目的基因指的是：？也可以是具有調(diào)控作用的因子一：目的基因的獲取如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因49獲取目的基因的常用方法有哪些?1、從基因文庫中獲取目的基因2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因3、人工合成目的基因反轉(zhuǎn)錄法化學(xué)合成法獲取目的基因的常用方法有哪些?1、從基因文庫中獲取目的基因反50(一)從基因文庫中獲取目的基因?qū)⒑心撤N生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫1.基因文庫概念2.基因文庫類型基因組文庫部分基因文庫（包含一種生物的所有基因）（包含一種生物的一部分基因）(一)從基因文庫中獲取目的基因?qū)⒑心撤N生物51(一)從基因文庫中獲取目的基因3.基因組文庫的構(gòu)建提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼敢欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存基因組文庫(一)從基因文庫中獲取目的基因3.基因組文庫的構(gòu)建提取某種生524.cDNA文庫的構(gòu)建提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時(shí)期的mRNA單鏈DNA雙鏈cDNA片段重組載體與載體連接cDNA文庫反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存4.cDNA文庫的構(gòu)建提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時(shí)期的m53兩種基因文庫的主要區(qū)別如下表（課本P10）文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小小大基因中啟動(dòng)子無有基因中內(nèi)含子無有基因多少部分基因全部基因物種間的基因交流可以部分基因可以總結(jié)兩種基因文庫的主要區(qū)別如下表（課本P10）文庫類型cDNA文541、概念：PCR全稱為________________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制_____________的核酸合成技術(shù)3、條件：2、原理：__________多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA雙鏈復(fù)制(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因模板（目的基因）原料(脫氧核苷酸)引物（一小段單鏈DNA）耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）溫度控制4、操作前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。1、概念：PCR全稱為________________，是一556、結(jié)果：

5、擴(kuò)增形式：指數(shù)形式（2n）在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因7、過程：a、變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、復(fù)性（55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物開始進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈6、結(jié)果：5、擴(kuò)增形式：指56基因工程的操作程序培訓(xùn)課件57(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因動(dòng)畫演示(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因動(dòng)畫演示58（三）人工合成目的基因反轉(zhuǎn)錄法：以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。（三）人工合成目的基因反轉(zhuǎn)錄法：59化學(xué)合成法DNA合成儀推測(cè)推測(cè)合成前提：基因比較小、核苷酸序列已知蛋白質(zhì)的氨基酸順序mRNA核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因化學(xué)合成法DNA合成儀推測(cè)推測(cè)合成前提：基因比較小、核60問題43、如果不知道目的基因的核苷酸序列，可采用_________________獲取目的基因的三種方法應(yīng)用1、如果有目的基因的核苷酸序列，而且基因比較大，可采用____________

2、如果知道目的基因的序列，而且基因比較小，可采用________________PCR技術(shù)擴(kuò)增化學(xué)合成法從基因文庫獲取的方法問題43、如果不知道目的基因的核苷酸序列，可采用______61復(fù)習(xí)回顧1、基因工程的基本操作程序的四個(gè)步驟是？核心是？2、目的基因指的是什么基因？3、獲取目的基因常用的三種方法是？其中人工合成法又包括哪兩種?4、基因文庫包括哪兩類？5、PCR的原理是？PCR全稱是？PCR擴(kuò)增過程中的解旋方式是？PCR需要的條件有？6、基因表達(dá)載體的構(gòu)建的目的是？7、一個(gè)基因表達(dá)載體的組成包括哪幾部分？8、標(biāo)記基因的作用是？9、啟動(dòng)子，終止子的位置，作用？起始密碼子，終止密碼子呢？復(fù)習(xí)回顧1、基因工程的基本操作程序的四個(gè)步驟是？核心是？62二：基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心1目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2組成：目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因等二：基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心1目的：2組成：63啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄（與終止密碼子區(qū)別）標(biāo)記基因：鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，RNA聚合酶識(shí)643.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個(gè)切口四個(gè)黏性末端DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個(gè)切口D65三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1轉(zhuǎn)化概念：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。2轉(zhuǎn)化的實(shí)質(zhì)：目的基因整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1轉(zhuǎn)化概念：2轉(zhuǎn)化的實(shí)質(zhì)：66生物種類植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射法Ca2＋處理法受體細(xì)胞一般是體細(xì)胞受精卵-------------4、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法生物種類植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注671、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

①農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力②原理：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：易感染雙子葉植物和裸子植物68三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞構(gòu)建基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌植物細(xì)胞導(dǎo)入穩(wěn)定維持和表達(dá)③過程：三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞構(gòu)建基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌植物細(xì)胞導(dǎo)69（2）基因槍法：目的基因?qū)雴巫尤~植物細(xì)胞（2）基因槍法：目的基因?qū)雴巫尤~植物細(xì)胞70基因槍法基因槍法71（3）花粉管通道法：將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞①操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管還末愈合前期，剪去柱頭，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞②特點(diǎn):十分簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)。

③例：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉（我國(guó)）（3）花粉管通道法：將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞①操作方法：在植物72（4）、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞方法：顯微注射法目的基因表達(dá)載體提純

取卵（受精卵）顯微注射受精卵新性狀動(dòng)物為什么動(dòng)物細(xì)胞要用受精卵做受體細(xì)胞？全能性受限制（4）、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞方法：顯微注射法目的基因表達(dá)載73（5）、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞①微生物作受體細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少②常用菌：大腸桿菌③常用法：Ca2+處理獲得感受態(tài)細(xì)胞（改變細(xì)胞壁的通透性）④過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合（5）、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞①微生物作受體細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：Ca74導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝入重組DNA分子嗎？真正能攝入重組DNA分子的受體細(xì)胞很少，且有的會(huì)攝入載體-載體，目的基因-目的基因類型目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達(dá)？不一定，需要檢測(cè)問題4問題5導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝入重組DNA分子嗎？75——檢查是否成功分子水平個(gè)體水平：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法、工具：方法、工具：方法、工具：DNA分子雜交、DNA探針分子雜交、DNA探針抗原-抗體雜交、抗體

四、目的基因的檢測(cè)與鑒定方法