糖的核磁共振性質(zhì)課件

第五節(jié)糖的核磁共振性質(zhì)一、糖的1HNMR性質(zhì)1、糖的端基質(zhì)子信號(hào)在δ5.0ppm附近，多數(shù)呈現(xiàn)特征性的雙峰，少數(shù)呈現(xiàn)寬單峰。2、糖環(huán)質(zhì)子信號(hào)在δ3.5—δ4.5ppm之間。3、甲基五碳糖（如鼠李糖）的甲基質(zhì)子信號(hào)在δ1.0ppm附近.第五節(jié)糖的核磁共振性質(zhì)一、糖的1HNMR性質(zhì)14、糖的C1-H與C2-H的偶合常數(shù)，廣泛應(yīng)用于吡喃糖環(huán)端基碳原子構(gòu)型的判斷。※原理：絕大多數(shù)的D-吡喃糖(如葡萄糖),當(dāng)C1-OH處于橫鍵上(代表β-苷鍵),C1-H與C2-H的偶合常數(shù)J=6-8Hz;當(dāng)C1-OH處于豎鍵上(代表α-苷鍵),C1-H與C2-H的偶合常數(shù)J=2-4Hz。※原因：質(zhì)子間的偶合常數(shù)與兩面角有關(guān)。4、糖的C1-H與C2-H的偶合常數(shù)，廣泛應(yīng)用于2※C2-H始終處于豎鍵上是判斷的前提。※甘露糖與鼠李糖，雖然具有吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)，但其C2-H都處于橫鍵上，故無法判斷其苷鍵構(gòu)型。22※C2-H始終處于豎鍵上是判斷的前提。223

◆鼠李糖優(yōu)勢(shì)構(gòu)象是1C式1212112233◆鼠李糖優(yōu)勢(shì)構(gòu)象是1C式12121122334α-L-鼠李糖苷β-L-鼠李糖苷φ=600φ=600C1α-L-鼠李糖苷β-L-鼠李糖苷φ=600φ=600C15二、糖的13CNMR性質(zhì)（一）化學(xué)位移與偶合常數(shù)1、D-吡喃糖的化學(xué)位移值C1:α-型97～101ppmβ-型103～106ppmCH-OH(C2、C3、C4)70～78ppmCH2-OH(C6)62ppm左右CH3（糖的甲基C）18ppm左右二、糖的13CNMR性質(zhì)6※一般在13C-NMR譜中2、D-呋喃糖的化學(xué)位移值CH2-OH(C1)64ppm左右CH-OH（C3、C5）>80ppm（偏大）※一般在13C-NMR譜中2、D-呋喃糖的化學(xué)位移值73、13C譜化學(xué)位移數(shù)據(jù)的應(yīng)用①依據(jù)97～106ppm區(qū)域13C信號(hào)的個(gè)數(shù)可判斷低聚糖及其苷中所含糖基的個(gè)數(shù).②如果端基13C信號(hào)出現(xiàn)在大于100ppm的區(qū)域，則苷鍵構(gòu)型為β-D或α-L；如果端基13C信號(hào)出現(xiàn)在小于100ppm的區(qū)域，則苷鍵構(gòu)型為α-D或β-L。3、13C譜化學(xué)位移數(shù)據(jù)的應(yīng)用8③依據(jù)13C譜數(shù)據(jù)尚可判斷氧環(huán)的大小。◆對(duì)于呋喃氧環(huán)CH-OH（C3、C5）>80ppm◆對(duì)于吡喃氧環(huán)CH-OH（C3、C5）<78ppm③依據(jù)13C譜數(shù)據(jù)尚可判斷氧環(huán)的大小。94、吡喃糖中端基碳的C-H偶合常數(shù)(1JC1-H1)可用于苷鍵構(gòu)型的確定.①

對(duì)于D-吡喃糖甲苷：α-苷鍵JC1-H1≈165~170Hzβ-苷鍵JC1-H1≈155~160Hz例如：α-D-甘露糖甲苷1JC1-H1=166ppm;β-D-甘露糖甲苷1JC1-H1=156ppm。

4、吡喃糖中端基碳的C-H偶合常數(shù)(1JC1-H1)10②

對(duì)于L-鼠李糖甲苷：α-苷鍵JC1-H1≈165~170Hzβ-苷鍵JC1-H1≈155~160Hz例如：α-L-鼠李糖甲苷1JC1-H1=168ppm;β-L-鼠李糖甲苷1JC1-H1=158ppm。5、呋喃型糖苷無法用端基碳與端基質(zhì)子的偶合常數(shù)來判斷其苷鍵構(gòu)型。②

對(duì)于L-鼠李糖甲苷：11（二）苷化位移（glycosydationshift）1、概念：糖成苷后，糖的端基碳和苷元α-C、β-C的化學(xué)位移值均發(fā)生改變，這種苷化前后化學(xué)位移的變化現(xiàn)象，稱為苷化位移。端基碳苷元碳（二）苷化位移（glycosydationshift）端基122、苷化位移一般規(guī)律①端基碳、苷元α-碳的化學(xué)位移值向低場(chǎng)方向移動(dòng)5～6ppm（+5～+6）單位；②苷元β-碳的化學(xué)位移值向高場(chǎng)方向移動(dòng)3～4ppm（-3～-4）單位；③糖分子其他碳原子化學(xué)位移值變化不大。④苷元β-位有取代基時(shí)的苷化位移規(guī)律：2、苷化位移一般規(guī)律13◆苷元α-碳和糖端基碳絕對(duì)構(gòu)型都為R（或S）時(shí)，苷化位移規(guī)律同①、②。端基碳α-碳β-碳◆苷元α-碳和糖端基碳絕對(duì)構(gòu)型都為R端基碳α-碳β-碳14

◆苷元α-碳和糖端基碳絕對(duì)構(gòu)型不同時(shí)，端基碳和α-碳的苷化位移值比苷元β-位無取代基者大約高3.5ppm單位。端基碳α-碳◆苷元α-碳和糖端基碳絕對(duì)構(gòu)型不同時(shí)，端基碳α-碳153、酯苷、酚苷的苷化位移規(guī)律：

苷化位移值較特殊，端基碳與羰基碳（即苷元α-碳）均向高場(chǎng)方向位移，β-C向低場(chǎng)方向位移。例如：齊墩果酸在成苷后，其分子結(jié)構(gòu)中既含醇苷、也有酯苷結(jié)構(gòu)?？捎糜趯?duì)比有關(guān)碳原子化學(xué)位移值的變化情況。3、酯苷、酚苷的苷化位移規(guī)律：16端基碳端基碳α-Cα-Cβ-Cβ-C端基碳端基碳α-Cα-Cβ-Cβ-C17α-Cβ-Cβ-Cα-Cα-Cβ-Cβ-Cα-C184、苷化位移有關(guān)說明：①苷化位移值與苷元的結(jié)構(gòu)有關(guān)，與糖的種類無關(guān)。β-D-葡萄吡喃甲苷13C1=104.0ppmβ-D-甘露吡喃甲苷13C1=104.5ppm4、苷化位移有關(guān)說明：β-D-葡萄吡喃甲苷β-D-甘露吡喃甲19②如果苷元為鏈狀結(jié)構(gòu)，則糖端基碳的苷化位移值隨著苷元為伯、仲、叔基而遞減。例如：與糖的甲苷化學(xué)位移比較，苷元分別為伯、仲、叔基時(shí)，糖端基碳的苷化位移值的變化情況如下，②如果苷元為鏈狀結(jié)構(gòu)，則糖端基碳的苷化20端基碳化學(xué)位移值下降-2-4-7端基碳化學(xué)位移值下降-2-4-721③在被苷化的糖分子結(jié)構(gòu)中，通常與端基碳直接相連的α-C的化學(xué)位移變化較大些，β-C稍受影響，其他碳原子受到的影響則較少。④在確定了苷中糖的種類以后，將苷的13C譜數(shù)據(jù)與相應(yīng)單糖的13C譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，利用苷化位移規(guī)律可確定苷中糖的連接位置。③在被苷化的糖分子結(jié)構(gòu)中，通常與端基碳直接相連的α-C的化22例如：判斷雙糖苷中兩單糖的連接位置◆將雙糖苷的13C譜數(shù)據(jù)與相應(yīng)單糖的13C譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比較；◆如果內(nèi)側(cè)糖的某個(gè)碳原子的化學(xué)位移向低場(chǎng)方向移動(dòng)了（通常是4~7ppm),而與其相鄰的兩個(gè)碳原子之化學(xué)位移值又略向高場(chǎng)方向移動(dòng)（約1~2ppm),則內(nèi)側(cè)糖的這個(gè)碳原子就是糖的連接位置。例如：判斷雙糖苷中兩單糖的連接位置23三、紅外光譜IR1.3700～3100cm-1間有明顯O-H吸收峰。2.如糖分子中含羧基、酰基等，則相應(yīng)官能團(tuán)的IR吸收峰可見。3.多糖在1500～960cm-1有許多吸收峰，其中970～730cm-1間的峰可用作端基碳構(gòu)型判斷。例如：840cm-1吸收峰——α-L-吡喃糖苷890cm-1吸收峰——β-D-吡喃糖苷三、紅外光譜IR1.3700～3100cm-1間有明顯O-24四、質(zhì)譜1、糖類難揮發(fā)，且熱不穩(wěn)定，需要制成揮發(fā)性的衍生物才能進(jìn)行質(zhì)譜分析。2、糖的立體異構(gòu)體往往出現(xiàn)幾乎相同的質(zhì)譜，僅在碎片豐度上稍有區(qū)別（不能用質(zhì)譜來區(qū)別糖的構(gòu)型！）。3、糖和苷的分子量：可用CI(化學(xué)電離),FD-MS、FAB-MS等方法獲得分子離子峰后測(cè)出。四、質(zhì)譜1、糖類難揮發(fā)，且熱不穩(wěn)定，需要制成揮發(fā)254、軟電離方式得到的碎片峰很少，但有可能獲得從分子離子峰按順序失去一個(gè)個(gè)糖基后的碎片離子峰。如果事先測(cè)定了多糖的組成，則可根據(jù)質(zhì)譜的碎片離子峰信息來推斷原糖鏈的連接順序。4、軟電離方式得到的碎片峰很少，但有可能獲得從分子離子峰按順26第六節(jié)糖鏈的結(jié)構(gòu)測(cè)定※主要解決四個(gè)問題①單糖的組成；②糖的氧環(huán)大?。虎厶桥c糖之間的連接位置和順序；④苷鍵構(gòu)型。第六節(jié)糖鏈的結(jié)構(gòu)測(cè)定※主要解決四個(gè)問題27（一）純度測(cè)定方法1、高壓電泳法※原理：由于中性多糖導(dǎo)電性差、分子量大、在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度慢，常將其制成硼酸絡(luò)合物進(jìn)行高壓電泳?！娪局С煮w：玻璃纖維絲、純絲綢布等?！彌_液：pH=9-12的硼砂溶液。※電壓：30-50V/cm（一）純度測(cè)定方法28※

時(shí)間：30-120min※

顯色劑：p-甲氧基苯胺-硫酸?！⒁猓罕仨毷褂美鋮s系統(tǒng)，將溫度維持在0℃,以免燒壞支持體?！痉ǔＳ?、超離心法※原理：由于微粒在離心力場(chǎng)中移動(dòng)的速度與微粒的密度、大小與形狀有關(guān)，故將多糖※

時(shí)間：30-120min29溶液進(jìn)行密度梯度超離心時(shí)，如果是組成均一的多糖，則應(yīng)呈現(xiàn)單峰。※具體做法：將多糖樣品制成1%-5%的氯化鈉或tris-鹽溶液，接著進(jìn)行密度梯度超離心，待轉(zhuǎn)速達(dá)到恒定后（6000轉(zhuǎn)/min），采用間隔照明法檢測(cè)其是否為單峰。溶液進(jìn)行密度梯度超離心時(shí)，如果是組成均一303、旋光光度法在多糖水溶液中加入乙醇使其濃度達(dá)到10%左右，離心得沉淀。上清液再用乙醇使其濃度達(dá)到20%-25%左右，離心得到第二次沉淀。比較兩次沉淀的比旋光度，如果比旋光度相同則為純品，否則為混合物。4、其他方法如凝膠柱色譜、官能團(tuán)摩爾比恒定法等。3、旋光光度法31（二）分子量測(cè)定1、測(cè)定多糖分子量物理方法：沉降法、光散射法、黏度法和滲透壓法等。2、凝膠過濾法簡(jiǎn)介：在凝膠柱上不同分子量的多糖與洗脫體積成一定的關(guān)系。采用一系列結(jié)構(gòu)相似的已知分子量的多糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而測(cè)定樣品多糖的分子量?！粼摲ㄓ昧啃?、操作較簡(jiǎn)便。（二）分子量測(cè)定323、單糖、低聚糖及其苷分子量的測(cè)定※最常用FD-MS、FAB-MS與電噴霧-MS4、多糖分子量的測(cè)定方法①基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜（MALDI-MS）②基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS).3、單糖、低聚糖及其苷分子量的測(cè)定33（三）單糖的鑒定

1．紙層析①展開系統(tǒng)：常用水飽和的有機(jī)溶劑如：正丁醇：醋酸：水（4：1：5上層）BAW正丁醇：乙醇：水（4：1：2.2）BEW②展開方式：上行、下行等③顯色劑：可利用糖的還原性或形成糠醛后引起的一些呈色反應(yīng)。例如，（三）單糖的鑒定34※鄰苯二甲酸苯胺※硝酸銀試劑（使還原糖顯棕黑色）※三苯四氮唑鹽試劑（單糖和還原性低聚糖呈紅色）※3,5-二羥基甲苯-鹽酸試劑（酮糖呈紅色）※過碘酸-聯(lián)苯胺（糖、苷和多元醇中有鄰二-OH結(jié)構(gòu)顯蘭底白斑）?！彵蕉姿岜桨?52．薄層層析①采用（硼酸液/無機(jī)鹽）+硅膠→制板②吸附劑：硅膠③顯色劑：除紙層析應(yīng)用以外，還有H2SO4/H2O或乙醇液、茴香醛-硫酸試劑、苯胺-二苯胺磷酸試劑等。2．薄層層析363．氣相層析①將糖制備成三甲基硅醚②醛糖用NaBH4還原成多元醇，制成乙?；锘蛉阴；铩?．離子交換層析①原理：糖的硼酸絡(luò)合物可進(jìn)行離子交換層析3．氣相層析37②優(yōu)點(diǎn)：不必制成衍生物，而直接用水溶液進(jìn)行分離（與氣相比較）③需要儀器—糖自動(dòng)分析儀5．液相色譜①填充材料——化學(xué)修飾的硅膠②優(yōu)點(diǎn)：不必制備成衍生物。適合分析對(duì)熱不穩(wěn)定的、不揮發(fā)的低聚糖和多糖。③缺點(diǎn)：靈敏度不及氣相層析高。②優(yōu)點(diǎn)：不必制成衍生物，而直接用水溶液38◆多糖組成的鑒定1、必要性：低聚糖、多糖的結(jié)構(gòu)分析，首先要了解由哪些單糖所組成、各種單糖之間的比例等。2、多糖組成鑒定過程：將苷鍵全水解，用PC檢出單糖的種類，經(jīng)顯色后用薄層掃描儀求得各種糖的分子比（也可用GC或HPLC對(duì)各單糖定性定量分析）?！舳嗵墙M成的鑒定39（四）糖連接位置的測(cè)定1、化學(xué)方法：多采用甲基化法①過程：將糖鏈全甲基化，然后水解所有的苷鍵，用氣相色譜法對(duì)水解產(chǎn)物—甲基化單糖—進(jìn)行定性和定量分析。②甲基化過程：常用箱守法(Hakomori)③水解過程：通常先用90%甲酸全水解，然后用0.05mol/LH2SO4或三氟乙酸水解。（四）糖連接位置的測(cè)定40④氣相色譜法定性和定量分析：選擇各種單糖的標(biāo)準(zhǔn)品，分別與水解后得到的各種甲基化單糖進(jìn)行比較，具有游離-OH的部位就是糖的連接位置，而全甲基化的單糖即為末端糖。⑤計(jì)算過程：算出所得各甲基化產(chǎn)物相互之間的比例，據(jù)此可推測(cè)出糖鏈重復(fù)單位中各種單糖的數(shù)目。④氣相色譜法定性和定量分析：41①全甲基化②水解游離羥基游離羥基①全甲基化游離羥基游離羥基422、NMR譜法（了解內(nèi)容）

①13CNMR譜法：目前用來確定糖的連接位置的常用方法※該法是在歸屬各碳信號(hào)的基礎(chǔ)上，以游離苷元和甲基糖苷作為參考化合物，確定產(chǎn)生苷化位移的碳，然后利用苷化位移規(guī)則，即可方便地獲知各單糖的連接位置。2、NMR譜法（了解內(nèi)容）43②1HNMR譜法：※先使糖與苷乙?；俦容^不同類型質(zhì)子的化學(xué)位移。

例如：CHOAc中CH質(zhì)子的化學(xué)位移為4.75~5.4ppm;而CH2OAc、CH2OR中質(zhì)子在3.0~4.3ppm；端基質(zhì)子介于這兩者之間?！ㄟ^2D-NMR判定質(zhì)子的歸屬，從而得出糖的連接位點(diǎn)。②1HNMR譜法：44第五節(jié)糖的核磁共振性質(zhì)一、糖的1HNMR性質(zhì)1、糖的端基質(zhì)子信號(hào)在δ5.0ppm附近，多數(shù)呈現(xiàn)特征性的雙峰，少數(shù)呈現(xiàn)寬單峰。2、糖環(huán)質(zhì)子信號(hào)在δ3.5—δ4.5ppm之間。3、甲基五碳糖（如鼠李糖）的甲基質(zhì)子信號(hào)在δ1.0ppm附近.第五節(jié)糖的核磁共振性質(zhì)一、糖的1HNMR性質(zhì)454、糖的C1-H與C2-H的偶合常數(shù)，廣泛應(yīng)用于吡喃糖環(huán)端基碳原子構(gòu)型的判斷?！恚航^大多數(shù)的D-吡喃糖(如葡萄糖),當(dāng)C1-OH處于橫鍵上(代表β-苷鍵),C1-H與C2-H的偶合常數(shù)J=6-8Hz;當(dāng)C1-OH處于豎鍵上(代表α-苷鍵),C1-H與C2-H的偶合常數(shù)J=2-4Hz?！颍嘿|(zhì)子間的偶合常數(shù)與兩面角有關(guān)。4、糖的C1-H與C2-H的偶合常數(shù)，廣泛應(yīng)用于46※C2-H始終處于豎鍵上是判斷的前提?！事短桥c鼠李糖，雖然具有吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)，但其C2-H都處于橫鍵上，故無法判斷其苷鍵構(gòu)型。22※C2-H始終處于豎鍵上是判斷的前提。2247

◆鼠李糖優(yōu)勢(shì)構(gòu)象是1C式1212112233◆鼠李糖優(yōu)勢(shì)構(gòu)象是1C式121211223348α-L-鼠李糖苷β-L-鼠李糖苷φ=600φ=600C1α-L-鼠李糖苷β-L-鼠李糖苷φ=600φ=600C149二、糖的13CNMR性質(zhì)（一）化學(xué)位移與偶合常數(shù)1、D-吡喃糖的化學(xué)位移值C1:α-型97～101ppmβ-型103～106ppmCH-OH(C2、C3、C4)70～78ppmCH2-OH(C6)62ppm左右CH3（糖的甲基C）18ppm左右二、糖的13CNMR性質(zhì)50※一般在13C-NMR譜中2、D-呋喃糖的化學(xué)位移值CH2-OH(C1)64ppm左右CH-OH（C3、C5）>80ppm（偏大）※一般在13C-NMR譜中2、D-呋喃糖的化學(xué)位移值513、13C譜化學(xué)位移數(shù)據(jù)的應(yīng)用①依據(jù)97～106ppm區(qū)域13C信號(hào)的個(gè)數(shù)可判斷低聚糖及其苷中所含糖基的個(gè)數(shù).②如果端基13C信號(hào)出現(xiàn)在大于100ppm的區(qū)域，則苷鍵構(gòu)型為β-D或α-L；如果端基13C信號(hào)出現(xiàn)在小于100ppm的區(qū)域，則苷鍵構(gòu)型為α-D或β-L。3、13C譜化學(xué)位移數(shù)據(jù)的應(yīng)用52③依據(jù)13C譜數(shù)據(jù)尚可判斷氧環(huán)的大小。◆對(duì)于呋喃氧環(huán)CH-OH（C3、C5）>80ppm◆對(duì)于吡喃氧環(huán)CH-OH（C3、C5）<78ppm③依據(jù)13C譜數(shù)據(jù)尚可判斷氧環(huán)的大小。534、吡喃糖中端基碳的C-H偶合常數(shù)(1JC1-H1)可用于苷鍵構(gòu)型的確定.①

對(duì)于D-吡喃糖甲苷：α-苷鍵JC1-H1≈165~170Hzβ-苷鍵JC1-H1≈155~160Hz例如：α-D-甘露糖甲苷1JC1-H1=166ppm;β-D-甘露糖甲苷1JC1-H1=156ppm。

4、吡喃糖中端基碳的C-H偶合常數(shù)(1JC1-H1)54②

對(duì)于L-鼠李糖甲苷：α-苷鍵JC1-H1≈165~170Hzβ-苷鍵JC1-H1≈155~160Hz例如：α-L-鼠李糖甲苷1JC1-H1=168ppm;β-L-鼠李糖甲苷1JC1-H1=158ppm。5、呋喃型糖苷無法用端基碳與端基質(zhì)子的偶合常數(shù)來判斷其苷鍵構(gòu)型。②

對(duì)于L-鼠李糖甲苷：55（二）苷化位移（glycosydationshift）1、概念：糖成苷后，糖的端基碳和苷元α-C、β-C的化學(xué)位移值均發(fā)生改變，這種苷化前后化學(xué)位移的變化現(xiàn)象，稱為苷化位移。端基碳苷元碳（二）苷化位移（glycosydationshift）端基562、苷化位移一般規(guī)律①端基碳、苷元α-碳的化學(xué)位移值向低場(chǎng)方向移動(dòng)5～6ppm（+5～+6）單位；②苷元β-碳的化學(xué)位移值向高場(chǎng)方向移動(dòng)3～4ppm（-3～-4）單位；③糖分子其他碳原子化學(xué)位移值變化不大。④苷元β-位有取代基時(shí)的苷化位移規(guī)律：2、苷化位移一般規(guī)律57◆苷元α-碳和糖端基碳絕對(duì)構(gòu)型都為R（或S）時(shí)，苷化位移規(guī)律同①、②。端基碳α-碳β-碳◆苷元α-碳和糖端基碳絕對(duì)構(gòu)型都為R端基碳α-碳β-碳58

◆苷元α-碳和糖端基碳絕對(duì)構(gòu)型不同時(shí)，端基碳和α-碳的苷化位移值比苷元β-位無取代基者大約高3.5ppm單位。端基碳α-碳◆苷元α-碳和糖端基碳絕對(duì)構(gòu)型不同時(shí)，端基碳α-碳593、酯苷、酚苷的苷化位移規(guī)律：

苷化位移值較特殊，端基碳與羰基碳（即苷元α-碳）均向高場(chǎng)方向位移，β-C向低場(chǎng)方向位移。例如：齊墩果酸在成苷后，其分子結(jié)構(gòu)中既含醇苷、也有酯苷結(jié)構(gòu)?？捎糜趯?duì)比有關(guān)碳原子化學(xué)位移值的變化情況。3、酯苷、酚苷的苷化位移規(guī)律：60端基碳端基碳α-Cα-Cβ-Cβ-C端基碳端基碳α-Cα-Cβ-Cβ-C61α-Cβ-Cβ-Cα-Cα-Cβ-Cβ-Cα-C624、苷化位移有關(guān)說明：①苷化位移值與苷元的結(jié)構(gòu)有關(guān)，與糖的種類無關(guān)。β-D-葡萄吡喃甲苷13C1=104.0ppmβ-D-甘露吡喃甲苷13C1=104.5ppm4、苷化位移有關(guān)說明：β-D-葡萄吡喃甲苷β-D-甘露吡喃甲63②如果苷元為鏈狀結(jié)構(gòu)，則糖端基碳的苷化位移值隨著苷元為伯、仲、叔基而遞減。例如：與糖的甲苷化學(xué)位移比較，苷元分別為伯、仲、叔基時(shí)，糖端基碳的苷化位移值的變化情況如下，②如果苷元為鏈狀結(jié)構(gòu)，則糖端基碳的苷化64端基碳化學(xué)位移值下降-2-4-7端基碳化學(xué)位移值下降-2-4-765③在被苷化的糖分子結(jié)構(gòu)中，通常與端基碳直接相連的α-C的化學(xué)位移變化較大些，β-C稍受影響，其他碳原子受到的影響則較少。④在確定了苷中糖的種類以后，將苷的13C譜數(shù)據(jù)與相應(yīng)單糖的13C譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，利用苷化位移規(guī)律可確定苷中糖的連接位置。③在被苷化的糖分子結(jié)構(gòu)中，通常與端基碳直接相連的α-C的化66例如：判斷雙糖苷中兩單糖的連接位置◆將雙糖苷的13C譜數(shù)據(jù)與相應(yīng)單糖的13C譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比較；◆如果內(nèi)側(cè)糖的某個(gè)碳原子的化學(xué)位移向低場(chǎng)方向移動(dòng)了（通常是4~7ppm),而與其相鄰的兩個(gè)碳原子之化學(xué)位移值又略向高場(chǎng)方向移動(dòng)（約1~2ppm),則內(nèi)側(cè)糖的這個(gè)碳原子就是糖的連接位置。例如：判斷雙糖苷中兩單糖的連接位置67三、紅外光譜IR1.3700～3100cm-1間有明顯O-H吸收峰。2.如糖分子中含羧基、?；?，則相應(yīng)官能團(tuán)的IR吸收峰可見。3.多糖在1500～960cm-1有許多吸收峰，其中970～730cm-1間的峰可用作端基碳構(gòu)型判斷。例如：840cm-1吸收峰——α-L-吡喃糖苷890cm-1吸收峰——β-D-吡喃糖苷三、紅外光譜IR1.3700～3100cm-1間有明顯O-68四、質(zhì)譜1、糖類難揮發(fā)，且熱不穩(wěn)定，需要制成揮發(fā)性的衍生物才能進(jìn)行質(zhì)譜分析。2、糖的立體異構(gòu)體往往出現(xiàn)幾乎相同的質(zhì)譜，僅在碎片豐度上稍有區(qū)別（不能用質(zhì)譜來區(qū)別糖的構(gòu)型！）。3、糖和苷的分子量：可用CI(化學(xué)電離),FD-MS、FAB-MS等方法獲得分子離子峰后測(cè)出。四、質(zhì)譜1、糖類難揮發(fā)，且熱不穩(wěn)定，需要制成揮發(fā)694、軟電離方式得到的碎片峰很少，但有可能獲得從分子離子峰按順序失去一個(gè)個(gè)糖基后的碎片離子峰。如果事先測(cè)定了多糖的組成，則可根據(jù)質(zhì)譜的碎片離子峰信息來推斷原糖鏈的連接順序。4、軟電離方式得到的碎片峰很少，但有可能獲得從分子離子峰按順70第六節(jié)糖鏈的結(jié)構(gòu)測(cè)定※主要解決四個(gè)問題①單糖的組成；②糖的氧環(huán)大??；③糖與糖之間的連接位置和順序；④苷鍵構(gòu)型。第六節(jié)糖鏈的結(jié)構(gòu)測(cè)定※主要解決四個(gè)問題71（一）純度測(cè)定方法1、高壓電泳法※原理：由于中性多糖導(dǎo)電性差、分子量大、在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度慢，常將其制成硼酸絡(luò)合物進(jìn)行高壓電泳?！娪局С煮w：玻璃纖維絲、純絲綢布等?！彌_液：pH=9-12的硼砂溶液?！妷海?0-50V/cm（一）純度測(cè)定方法72※

時(shí)間：30-120min※

顯色劑：p-甲氧基苯胺-硫酸?！⒁猓罕仨毷褂美鋮s系統(tǒng)，將溫度維持在0℃,以免燒壞支持體。※本法常用2、超離心法※原理：由于微粒在離心力場(chǎng)中移動(dòng)的速度與微粒的密度、大小與形狀有關(guān)，故將多糖※

時(shí)間：30-120min73溶液進(jìn)行密度梯度超離心時(shí)，如果是組成均一的多糖，則應(yīng)呈現(xiàn)單峰?！唧w做法：將多糖樣品制成1%-5%的氯化鈉或tris-鹽溶液，接著進(jìn)行密度梯度超離心，待轉(zhuǎn)速達(dá)到恒定后（6000轉(zhuǎn)/min），采用間隔照明法檢測(cè)其是否為單峰。溶液進(jìn)行密度梯度超離心時(shí)，如果是組成均一743、旋光光度法在多糖水溶液中加入乙醇使其濃度達(dá)到10%左右，離心得沉淀。上清液再用乙醇使其濃度達(dá)到20%-25%左右，離心得到第二次沉淀。比較兩次沉淀的比旋光度，如果比旋光度相同則為純品，否則為混合物。4、其他方法如凝膠柱色譜、官能團(tuán)摩爾比恒定法等。3、旋光光度法75（二）分子量測(cè)定1、測(cè)定多糖分子量物理方法：沉降法、光散射法、黏度法和滲透壓法等。2、凝膠過濾法簡(jiǎn)介：在凝膠柱上不同分子量的多糖與洗脫體積成一定的關(guān)系。采用一系列結(jié)構(gòu)相似的已知分子量的多糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而測(cè)定樣品多糖的分子量?！粼摲ㄓ昧啃?、操作較簡(jiǎn)便。（二）分子量測(cè)定763、單糖、低聚糖及其苷分子量的測(cè)定※最常用FD-MS、FAB-MS與電噴霧-MS4、多糖分子量的測(cè)定方法①基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜（MALDI-MS）②基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS).3、單糖、低聚糖及其苷分子量的測(cè)定77（三）單糖的鑒定

1．紙層析①展開系統(tǒng)：常用水飽和的有機(jī)溶劑如：正丁醇：醋酸：水（4：1：5上層）BAW正丁醇：乙醇：水（4：1：2.2）BEW②展開方式：上行、下行等③顯色劑：可利用糖的還原性或形成糠醛后引起的一些呈色反應(yīng)。例如，（三）單糖的鑒定78※鄰苯二甲酸苯胺※硝酸銀試劑（使還原糖顯棕黑色）※三苯四氮唑鹽試劑（單糖和還原性低聚糖呈紅色）※3,5-二羥基甲苯-鹽酸試劑（酮糖呈紅色）※過碘酸-聯(lián)苯胺（糖、苷和多元醇中有鄰二-OH結(jié)構(gòu)顯蘭底白斑）。※鄰苯二甲酸