感染性疾病診斷技術(shù)新進展

感染性疾病診斷技術(shù)新進展感染性疾病：全球共同的挑戰(zhàn)2016年，5歲以下兒童死亡的三大主要原因是呼吸道感染、新生兒早產(chǎn)并發(fā)癥以及新生兒因出生窒息和創(chuàng)傷而導(dǎo)致的新生兒腦病，總共導(dǎo)致了1億8千萬人死亡在全球范圍內(nèi)，2016年死亡率的前五大原因主要是心血管疾病;腹瀉、下呼吸道感染和其他常見感染性疾病;腫瘤;新生兒疾病;HIV/艾滋病和肺結(jié)核血流感染發(fā)展迅速，死亡率高院內(nèi)死亡率達16%，比其他診斷的死亡率高8倍以上住院時間延長，住院費用高1990年-2003年間，敗血癥相關(guān)住院時間增長了153%，年均增長6%感染性疾病—嚴重感染導(dǎo)致住院時間延長感染性疾病—增加耐藥菌感染的抗菌藥物治療花費傳統(tǒng)臨床微生物檢測傳統(tǒng)微生物檢測方法：分離培養(yǎng)+抗原抗體檢測+普通PCR檢測缺點：細菌無法生長（應(yīng)用抗生素后）病毒、真菌、寄生蟲難以培養(yǎng)多種細菌混合很難分離鑒定厭氧菌經(jīng)常被忽略無法準確定量局限性微生物實驗室的挑戰(zhàn)硬件設(shè)施和人員的技術(shù)水平、診斷水平等參差不齊微生物專家需多年的經(jīng)驗培養(yǎng)

傳統(tǒng)鑒定能力有限

人力資源普遍不足平均每1000床位<5位臨床微生物專家

<2012上海國際醫(yī)院感染控制論壇>臨床要求更快檢驗時效更高的工作強度臨床微生物專家與臨床醫(yī)師對稱、溝通有障礙較少涉略臨床用藥指引政策,評鑒需求增多抗菌藥物臨床應(yīng)用管理辦法（衛(wèi)生部令第84號)三級綜合醫(yī)院評審標準實施細則耐藥菌株逐年上升更多藥物敏感性報告需求微生物實驗室如何面對挑戰(zhàn)?更加標準化更高效率更主動的信息交流更高質(zhì)量微生物檢測新技術(shù)的發(fā)展趨勢敏感快速特異準確多種病原體同時檢測（multiplex）高通量型別的鑒定MALDI-TOFGeneXpertFilmArray基因芯片檢測高通量測序技術(shù)（NGS）有應(yīng)用前景的微生物檢測技術(shù)FilmarrayMALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOFMS）是最新開發(fā)的鑒定固體培養(yǎng)基上分離的病原菌的方法原理：是在高真空系統(tǒng)中將樣本分子離解成帶電的離子，并通過對生成離子的質(zhì)量和強度的測定，而進行樣品成分和結(jié)構(gòu)分析的方法BrukerABI島津MALDI-TOFMS-基本原理激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電高過程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過程X軸：M/ZY軸：相對強度很直觀的看到整個分子的質(zhì)譜全貌質(zhì)譜信號：分子離子峰、碎片離子峰、亞穩(wěn)離子峰、重排離子峰等MALDI-TOFMS蛋白質(zhì)指紋特征基于譜圖模式比對的細菌鑒定2022/11/17MALDI-TOF鑒定流程MALDI-TOFvsVITEK2微生物培養(yǎng)（withoutMALDI)微生物培養(yǎng)（withMALDI)Day1接種平板培養(yǎng)；PCT接種平板培養(yǎng)，PCTDay2革蘭染色，直接鏡檢；配置鑒定藥敏菌懸液上機；及藥敏試驗MS檢測1~3分鐘鑒定出細菌報告臨床；同時有選擇做藥敏Day3ID&AST臨床報告藥敏報告縮短報告TAT（24h）TAT時間——將數(shù)天數(shù)小時降低至數(shù)分鐘傳統(tǒng)VSMALDI-TOFMALDI-TOF用于血培養(yǎng)檢測應(yīng)用MALDI-TOFMS降低治療成本將快速識別和易感技術(shù)與抗菌管理結(jié)合起來，大大改善了最佳治療的時間，并降低了住院時間和總成本MALDITOF-MS優(yōu)缺點優(yōu)勢：操作簡單、快速一個樣品從獲得單克隆開始，到樣本處理、譜圖采集和獲得鑒定結(jié)果可以在幾分鐘之內(nèi)完成，操作簡單、快速、通量高靈敏度高使用經(jīng)久耐用且性能可靠的布魯克?道爾頓的MALDI-TOF系列質(zhì)譜儀，可以實現(xiàn)高重現(xiàn)性的快速可靠的檢測準確度好MALDI-TOF獲得的蛋白指紋圖譜用作模式匹配，匹配分值用作鑒定結(jié)果的分級和歸類，軟件對所得的圖譜進行歸一化分析，其精巧的算法保證了鑒定的精確性缺點：MALDI-TOFMS檢測的次代培養(yǎng)物，從血培養(yǎng)陽性到鑒定還需要24-36hr無法提供AST實時熒光定量PCR技術(shù)檢測方法：SYBRGreenI

TaqMan

MolecularBeacon優(yōu)勢：擴增、檢測在一個實時PCR反應(yīng)系統(tǒng)中即時完成，快速、特異、敏感，最有發(fā)展前景檢測對象：真菌、結(jié)核分枝桿菌、淋病奈瑟氏菌、HBV、HCV、HIV、解脲支原體、巨細胞病毒、EB病毒等20GeneXpert檢測原理：應(yīng)用microfluidiccartridges（微流樣品管）中的超聲裝置破碎原始樣品釋放內(nèi)含的DNA，并在各小室間轉(zhuǎn)移并洗滌、純化和濃縮DNA，在定量PCR反應(yīng)管中進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，同時進行擴增和檢測GeneXpert技術(shù)整合的微流控技術(shù)儀器平臺試劑盒運行程序和對照GeneXpert檢測流程2010年12月世界衛(wèi)生組織宣布認可并向全球推薦使用XpertMTB/RIF技術(shù)用于結(jié)核病及利福平耐藥的檢測在2個小時之內(nèi)直接檢出病人痰標本中是否有結(jié)核分枝桿菌以及利福平耐藥性GeneXpert技術(shù)GeneXpert可檢測的其他項目檢測難辨梭菌毒素用于抗生素相關(guān)性腹瀉診斷耐藥菌株的檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌mecA基因、碳青霉烯類耐藥基因、萬古霉素耐藥腸球菌基因病毒及載量EV、Flu、H1N1、HIV-1、HCV等GeneXpert優(yōu)點：全自動的工作流程整合了裂解、提取、擴增和實時檢測的過程快速獲得結(jié)果整合的超聲裂解裝置以快速獲得核酸特殊的PCR反應(yīng)管設(shè)計大大縮短PCR循環(huán)時間自動解讀結(jié)果即時檢測無需批次檢測隨時進行任意檢測即插即用無需日常維護通過整合LIS系統(tǒng)即時獲得結(jié)果Filmarray基本原理兩種具有獨特擴增產(chǎn)物序列的不同靶標的熔解曲線樣本裂解、提純、擴增、檢測一步到位節(jié)省培養(yǎng)時間，縮短TAT48小時1小時報告覆蓋80%常見病原微生物提供萬古霉素等抗生素耐藥基因情況Filmarray檢測統(tǒng)一平臺下的多種檢測解決方案測試面廣廣泛的臨床研究FilmarrayMEPanel與培養(yǎng)或PCR對比，F(xiàn)A對于腦脊液標本的檢測9種病原體敏感性達100%；2種病原體一致性達85%以上

我院2017年Filmarray與DFA檢查FilmarrayDFA法陽性率：58.02%陽性率：16.33%多重PCR用于微生物檢測大多數(shù)呼吸道感染的臨床表現(xiàn)是非特異的，可能由分枝桿菌、病毒、嗜肺軍團菌、衣原體和支原體等病原微生物中的一種或幾種感染引起。多重PCR在一個反應(yīng)管中加入了多對引物來擴增不同靶基因的核苷酸片斷，從而篩選臨床標本中可能存在的多種病原菌。34高通量基因芯片用于微生物檢測35基因芯片用于多種耐藥基因的檢測可以檢測革蘭陽性菌常見的90種耐藥基因此平臺可用于基礎(chǔ)研究、食品安全和耐藥監(jiān)測高通量測序（NGS）邊合成邊測序，通過捕捉新生成的末端的標記來確定DNA的序列DNA文庫的制備連接接頭測序數(shù)據(jù)分析應(yīng)用：基因組/宏基因組測序新一代高通量測序技術(shù)使得微生物基因組學(xué)獲得長足發(fā)展高通量測序（NGS）NGS在臨床領(lǐng)域的應(yīng)用進展高通量測序（NGS）NGS檢測病原體的優(yōu)勢當前應(yīng)用的能快速診斷感