血液樣品預(yù)處理的標(biāo)準(zhǔn)操作

血液樣品預(yù)處理的標(biāo)準(zhǔn)操作血液樣品預(yù)處理的標(biāo)準(zhǔn)操作血液樣品預(yù)處理的標(biāo)準(zhǔn)操作血液樣品預(yù)處理的標(biāo)準(zhǔn)操作編制僅供參考審核批準(zhǔn)生效日期地址：電話：傳真:郵編:血液樣品預(yù)處理的標(biāo)準(zhǔn)操作一、目的

規(guī)范色譜分析中血液樣品預(yù)處理的操作。

二、職責(zé)

1.實(shí)驗(yàn)室分析測(cè)試人員對(duì)本規(guī)程的實(shí)施負(fù)責(zé)。

2.對(duì)于每一項(xiàng)具體的研究課題，具體的操作步驟應(yīng)由實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé)制定，并由實(shí)驗(yàn)室分析測(cè)試人員嚴(yán)格實(shí)施。

3.實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé)對(duì)本規(guī)程的修訂。

三、血液樣品預(yù)處理的標(biāo)準(zhǔn)操作

1.實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備的準(zhǔn)備

試管一般采用有蓋子和刻度的尖底試管，要求密封性好，編號(hào)清楚準(zhǔn)確，并擺放整齊。

EP管一般采用的規(guī)格有1ml、、2ml。要求密封性好，編號(hào)清楚準(zhǔn)確，并擺放整齊。

移液器要求定量準(zhǔn)確，重復(fù)性好。

其它渦流混合器、離心機(jī)、真空泵、燒杯、量筒、記號(hào)筆、試管架、標(biāo)簽紙等。

2.樣品的均勻化

將裝有血漿（血清）樣品的EP管放置在冰箱冷藏室內(nèi)，緩慢解凍為血漿（血清）溶液。

然后取出放置至室溫，置渦流混合器上混勻或往復(fù)振搖亦可到達(dá)均勻的目的。

3.液－液提取

提取溶劑的準(zhǔn)備

常用的溶劑有乙酸乙酯，乙醚，環(huán)己烷等。

提取溶劑可以是一種也可以是幾種溶劑的混合溶液，目的是調(diào)整提取溶液的劑性，既保證待測(cè)樣品被充分萃取進(jìn)入提取溶劑，同時(shí)又有很好的選擇性。

根據(jù)待測(cè)樣品的需要用移液器（移液槍）定量吸取血漿（血清）至試管中。

必要時(shí)調(diào)整血漿（血清）溶液的pH值，根據(jù)待測(cè)樣品的性質(zhì)加入酸、堿或緩沖溶液，然后渦旋混勻。

用移液器定量吸取提取溶液至裝有血漿（血清）的試管中，蓋好試管塞。

溶液的混勻

渦流混勻?qū)⒃嚬苤糜跍u流混合器上進(jìn)行旋渦，并保證樣品溶液旋渦充分混勻，旋渦時(shí)間一般為2-3分鐘。

樣品的離心將試管置于離心機(jī)中，分離過(guò)程中一般采用4000r/min。離心之前注意要平衡，加速時(shí)應(yīng)注意緩慢逐步加速，以防加速過(guò)快試管炸裂，離心時(shí)間一般為10分鐘。

離心分離后試管中樣品分為上下兩層，用移液器吸取上層有機(jī)相，轉(zhuǎn)移至另一試管中。

溶劑的揮發(fā)

自然揮發(fā)將樣品溶液放置在室溫下?lián)]發(fā)，有時(shí)還可適當(dāng)加熱，加速溶液揮發(fā)。

氮?dú)獯蹈傻獨(dú)饬髂芊乐拱l(fā)生氧化，為了加快揮散速度，將樣品溶液置于氮?dú)饬飨麓蹈伞?/p>

減壓蒸發(fā)在密閉容器內(nèi)，通過(guò)抽真空以降低液體表面的壓力，使其沸點(diǎn)降低，樣品溶液很快揮發(fā)，減少了蒸發(fā)過(guò)程中樣品與空氣的接觸，避免由此引起的分解等副反應(yīng)，適于熱不穩(wěn)定的樣品。

樣品的復(fù)溶用于樣品溶液殘?jiān)鼜?fù)溶的溶液通常采用流動(dòng)相或其它有機(jī)溶劑。用移液器準(zhǔn)確定量吸取，并且復(fù)溶樣品應(yīng)充分混合均勻。

預(yù)處理樣品的儲(chǔ)存預(yù)處理后的樣品應(yīng)保存在冰箱冷藏室，樣品應(yīng)豎直放置、排列整齊、編號(hào)準(zhǔn)確清楚。待樣品進(jìn)樣分析以前取出，以保證樣品的穩(wěn)定。

乳化現(xiàn)象

防止乳化可增加有機(jī)溶劑的體積，避免猛烈振搖或加入適當(dāng)?shù)脑噭└淖兤浔砻鎻埩Φ确椒ǚ乐谷榛?/p>

破乳若已發(fā)生嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象，應(yīng)采取適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ榛?/p>

離心可將試管置于離心機(jī)中離心消除乳化。

冷凍可將試管置于冰箱中冷凍消除乳化。

加入電解質(zhì)。

加入適當(dāng)?shù)南♂屢合♂尅?/p>

4.去蛋白處理

有機(jī)溶劑的準(zhǔn)備甲醇與乙腈是反相液相色譜法中常用的蛋白沉淀劑，因?yàn)樗鼈兣c流動(dòng)相的組成相同。甲醇沉淀蛋白的優(yōu)點(diǎn)是上清液清澈，沉淀為絮狀易于分離；乙腈與之相反，產(chǎn)生細(xì)的蛋白沉淀，但沉淀效率較甲醇高。

根據(jù)待測(cè)樣品的需要用移液器定量吸取血漿（血清）至試管中，蓋好試管塞。

必要時(shí)調(diào)整血漿（血清）溶液的pH值，根據(jù)待測(cè)樣品的性質(zhì)加入酸、堿或緩沖溶液。

用移液器定量吸取有機(jī)溶液至裝有血漿（血清）的試管中，蓋好試管塞。

溶液的混勻有機(jī)溶劑使蛋白質(zhì)變性而析出沉淀，從而把與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物解離出來(lái)。與此同時(shí)待測(cè)樣品大部分被萃取進(jìn)入有機(jī)溶劑。

渦流混勻?qū)⒃嚬苤糜跍u流混合器上進(jìn)行旋渦，并保證樣品溶液旋渦充分混勻，旋渦時(shí)間一般為2-3分鐘。

搖床混勻?qū)⒃嚬苤糜趽u床上往復(fù)振搖，振搖時(shí)間一般為5-10分鐘。

離心去除蛋白將試管置于離心機(jī)中，分離過(guò)程中一般采用3000-4000r/min。離心之前注意要平衡，加速時(shí)應(yīng)注意緩慢逐步加速，以防加速過(guò)快試管炸裂，離心時(shí)間一般為15-20分鐘。

離心分離后變性蛋白質(zhì)沉淀于試管底部，用移液器吸取上層有機(jī)溶液，轉(zhuǎn)移至另一試管中。

過(guò)濾經(jīng)過(guò)去蛋白處理后的樣品溶液用μm的濾膜過(guò)濾。

高速離心將過(guò)濾后的樣品溶液轉(zhuǎn)移至EP管中，采用25000-30000r/min。離心之前注意要平衡，加速時(shí)應(yīng)注意緩慢逐步加速，以防加速過(guò)快試管炸裂，離心時(shí)間一般為5-10分鐘。

經(jīng)過(guò)以上處理后得到的樣品溶液，如果待測(cè)物的濃度在定量限以上，而且溶劑對(duì)HPLC系統(tǒng)沒(méi)有干擾，就可以直接進(jìn)樣分析。如果需要除去溶劑，即濃縮甚至干燥樣品，方法同。

預(yù)處理樣品的儲(chǔ)存預(yù)處理后的樣品應(yīng)保存在冰箱冷藏室，樣品應(yīng)豎直放置、排列整齊、編號(hào)準(zhǔn)確清楚。待樣品進(jìn)樣分析以前取出，以保證樣品的穩(wěn)定。

5.固相萃取固相萃取柱的準(zhǔn)備柱管由血清級(jí)的聚丙烯制成（也有由玻璃制成的），一般為注射器性狀。柱管下斷有一突出的頭，尺寸已標(biāo)準(zhǔn)化。燒結(jié)墊聚乙烯是常見(jiàn)的燒結(jié)墊材料，對(duì)于特殊要求也可采用特氟隆或不銹鋼片。SPE固定相根據(jù)樣品溶液的性質(zhì)和組成選擇不同類型和重量的固定相。SPE固定相最常見(jiàn)的是鍵合的硅膠材料，一般采用孔徑60A不規(guī)則形狀的40μ硅膠微粒作為原材料，然后將各種官能團(tuán)鍵合上去。正相CN、DIOL、Si、NH2等可作為正相固定相，用來(lái)保留極性物質(zhì)。反相C18、C8、C2、CH、PH等可作為反相固定相，用來(lái)保留非極性物質(zhì)。離子交換固定相活化凈化固定相將第一溶液加入到固定相，真空抽濾，倒掉洗脫液。用量約為1-2ml/100mg固定相。將終溶劑加入固定相，真空抽濾，倒掉洗脫液。用量約為1-2ml/100mg固定相,終溶劑應(yīng)該與樣品溶劑性質(zhì)相似。在活化的過(guò)程中和結(jié)束時(shí)，固定相都不能抽干,因?yàn)檫@將導(dǎo)致填料床出現(xiàn)干裂，如果在活化步驟中出現(xiàn)干裂，所有活化步驟都要重做。根據(jù)待測(cè)樣品的性質(zhì)將酸、堿或緩沖溶液加入到血漿（血清）溶液中，溶解稀釋血漿（血清）溶液并且調(diào)整pH值。上樣將樣品溶液加入到固相萃取柱，然后真空抽濾，使樣品進(jìn)入固定相，倒掉洗脫液。淋洗樣品中分析物得到保留后，將淋洗液加入到固相萃取柱進(jìn)行淋洗，真空抽濾，倒掉淋洗液，以洗掉干擾組分。溶液體積可為－100mg固定相。洗脫將洗脫液加入到固相萃取柱進(jìn)行洗脫，真空抽濾，并收集洗脫液。洗脫液一般為固定相。經(jīng)過(guò)以上處理后得到的洗脫液可以直接進(jìn)樣分析。如果需要除去溶劑，即濃縮甚至干燥樣品，方法同。預(yù)處理樣品的儲(chǔ)存預(yù)處理后的樣品應(yīng)保存在冰箱冷藏室，樣品應(yīng)豎直放置、排列整齊、編號(hào)準(zhǔn)確清楚。待樣品進(jìn)樣分析以前取出，以保