氨基酸LDH納米復(fù)合物新型藥物劑型的研究分析

PAGEPAGE16氨基酸/LDH納米復(fù)合物新型藥物劑型的研究分析摘要：本實(shí)驗(yàn)為克服氨基酸藥物在體內(nèi)生物利用度低，無法發(fā)揮應(yīng)有作用的缺點(diǎn)，利用LDH納米材料，使用納米插層技術(shù)，制備出氨基酸/LDH納米復(fù)合體，從而得到一種新型藥物劑型。本實(shí)驗(yàn)利用了離子交換法將纈氨酸（Val）和組氨酸（His）兩種氨基酸插入到LDH中，并對得到的復(fù)合體進(jìn)行了進(jìn)一步的表征。X射線衍射、紅外圖譜、熱重分析以及透射電鏡的結(jié)果都表明，Val能插入到LDH中，而His則無法插入，并且插層的Val可利用Na2CO3從Val/LDH復(fù)合體中洗脫了下來,因此，我們可以將Val/LDH復(fù)合體作為制備氨基酸/LDH納米復(fù)合體等以及其它納米復(fù)合體藥物的前驅(qū)體。同時(shí)，利用Val和His不同的插層能力,可利用此方法將Val和His這兩種氨基酸進(jìn)行分離，從而得到了一種新的氨基酸分離方法。關(guān)鍵詞：層狀雙氫氧化物（LDH），納米復(fù)合體，纈氨酸，組氨酸前言：醫(yī)藥是氨基酸相對用量不大但品種最多的一個(gè)部門，目前世界上用于藥物的氨基酸及氨基酸衍生物的品種達(dá)100多種。洛斯氮平衡理論的確立與人類發(fā)現(xiàn)在正常代謝組織蛋白中缺乏某一種即會導(dǎo)致整個(gè)有機(jī)體代謝紊亂，使氨基酸成為維持人體營養(yǎng)和治療很多疾病的醫(yī)療藥物。氨基酸在醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用包括氨基酸作為蛋白質(zhì)的基本組成單位，直接參與生物體內(nèi)的新陳代謝和其他生理活動，可用作營養(yǎng)劑、代謝改善劑、抗?jié)?、防輻射、抗菌、治癌、催眠、?zhèn)痛、以及為特殊病人配制人工合成膳食等。氨基酸藥物世界年總量現(xiàn)已達(dá)4至5萬噸，作為專門療效的氨基酸及其衍生物產(chǎn)品有數(shù)十種，如治療氨中毒、肝昏迷的谷氨酸、精氨酸；治療消化道潰瘍的組氨酸、谷氨酰胺；治療肝臟疾病的天冬氨酸、精氨酸、蛋氨酸；治療心臟疾病的?；撬帷⒔M氨酸、天冬氨酸；治療支氣管炎及肺氣腫的半胱氨酸；可增強(qiáng)免疫能力的苯丙氨酸、異亮氨酸、色氨酸等等。另外氨基酸衍生物作為治療藥用于臨床目前相當(dāng)活躍，無論在治療肝性疾病、心血管疾病，還是潰瘍病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、消炎等方面都已廣泛使用，用于治療的氨基酸衍生物不下數(shù)百種。如4-羥基脯氨酸在治療慢性肝炎、防止肝硬化方面都很有效。氨基酸衍生物還可作為抗生素和抗菌增效劑，廣泛用作活性劑和防腐劑；而且氨基酸衍生物也已廣泛用作抗腫瘤藥物，如苯丙氨酸芥子氣，L-纈氨酸、L-谷氨酸、L-賴氨酸與苯二胺氮芥共結(jié)合物等以氨基酸作為載體的抗腫瘤藥物；N-磷酸乙酰-L-天門冬氨酸是一個(gè)天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酚基酶的過渡狀況抑制劑，利用這個(gè)抑制劑可中斷嘧啶核苷酸的合成途徑達(dá)到抗腫瘤目的。然而，氨基酸藥物具有它的局限性,在體內(nèi)穩(wěn)定性差、吸收不佳、半衰期短等.為解決氨基酸藥物的缺陷，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了氨基酸/LDH納米復(fù)合體,可提高此類藥物的生物利用度。層狀雙氫氧化物L(fēng)DH是由帶正電荷的金屬氫氧化物層和層間填充帶負(fù)電荷的陰離子構(gòu)成的層狀化合物.LDH具有特殊的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),是一種在吸附、離子交換、催化和功能助劑等方面具有巨大潛力的新型無機(jī)功能材料。由于其具有獨(dú)特的層狀微孔結(jié)構(gòu)和陰離子的可交換性,且它在催化、吸附、醫(yī)藥等方面的應(yīng)用,故一直受到人們的關(guān)注.特別是近年來,以LDH為先軀體,使用同多或雜多含氧陰離子與其交換而嵌入層間,可獲得大層間距的高活性、高選擇性的新型層柱狀催化材料,這一研究已成為催化領(lǐng)域的熱門課題.近年來,更深層次的研究主要集中在層間插入特定的無機(jī)、有機(jī)離子或聚合物而制備具有優(yōu)良性能夾層納米復(fù)合材料.如研究發(fā)現(xiàn)ＤＮＡ類生物分子能穩(wěn)定存在于聚合物/ＭｇＡｌＮＯ3ＬＤＨ納米復(fù)合材料中,而制成基因的貯存庫。在醫(yī)藥方面對于納米材料的研究，目前主要研究方向在于設(shè)計(jì)特殊的藥物遞送系統(tǒng)，以期增加藥物對于標(biāo)的細(xì)胞的專一性，并減少藥物本身所引起的副作用。Choy等(2004)利用層狀雙氫氧化物(layereddoublehydroxides,LDH)作為載體，遞送抗癌藥物methotrexate至人類骨肉瘤細(xì)胞(SaOS-2)中，可明顯觀察到藥物所引發(fā)的細(xì)胞凋亡(apoptosis)現(xiàn)象由于LDH對細(xì)胞無毒害作用，本實(shí)驗(yàn)利用它做為一種無機(jī)生物納米載體，用以包埋功能性生物分子——氨基酸，從而得到一種新型藥物劑型，使氨基酸的生物功能可以更加充分的發(fā)揮，克服普通氨基酸藥物的易降解轉(zhuǎn)化、所需劑量大、成本高等問題。目前國內(nèi)該方面的研究還并不充分，本實(shí)驗(yàn)的研究方法在一定程度上開拓了提高藥物作用效用的研究思路，具有一定的創(chuàng)新性，特別是對于聚合物氨基酸/LDH納米復(fù)合體的研究與應(yīng)用，前景非常廣闊。該新型藥物劑型研究成熟，成為一種臨床藥物后，不僅可以提高藥效，節(jié)省資源，降低成本，取得高的收益，更可以拓寬相關(guān)研究思路，有利于相似相關(guān)類藥物制劑的研究與開發(fā)，有助于更快更高效地緩解病痛，甚至可以通過納米材料（如LDH）的保護(hù)，使一些本來因會被消化降解等原因而不能或微弱作用于靶細(xì)胞的高效藥物制劑（如蟲草素）得以發(fā)揮或增強(qiáng)其藥效，從而提高很多疑難雜癥（如腫瘤）的治愈幾率，從這一意義上講氨基酸/LDH納米復(fù)合物也可作為制備其它高效藥物制劑（如蟲草素/LDH納米復(fù)合體）的前驅(qū)體。聚合物納米顆粒用于藥物傳遞是現(xiàn)代藥劑學(xué)發(fā)展的重要方向之一，納米顆粒制劑具有普通制劑無法比擬的優(yōu)點(diǎn)：緩釋藥物，延長藥物作用時(shí)間；靶向輸送藥物；減少給藥劑量，減輕或避免不良反應(yīng)；提高藥物的穩(wěn)定性；保護(hù)藥物，防止被體內(nèi)酶降解；輔助核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞等；有利于患者吸收，減少藥物在其他健康細(xì)胞上的毒副作用，提高藥物的療效，降低制藥成本等，上述優(yōu)點(diǎn)也正是現(xiàn)代藥劑學(xué)的主要目的。同時(shí)，納米顆粒也為體內(nèi)局部給藥、黏膜給藥和多肽類藥物的口服傳遞等奠定了基礎(chǔ)。納米顆粒是一類極具開發(fā)潛力的新型藥物載體。因此納米技術(shù)運(yùn)用在藥物的運(yùn)載體系上是現(xiàn)在制藥界十分熱點(diǎn)的課題，如果能夠取得重大成果，對整個(gè)制藥行業(yè)是一個(gè)革命性突破。隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，納米顆粒技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用到臨床疾病的診斷和治療中，如利用腫瘤、炎癥或感染部位的特殊病理特點(diǎn)及某些組織的生理特點(diǎn)，可以用納米顆粒診斷劑對多種疾病進(jìn)行前期診斷和治療。實(shí)驗(yàn)試劑及儀器：1、試劑：硝酸鎂Mg(NO3)2.6H2O硝酸鋁Al(NO3)3.9H2O硝酸鈉NaNO3氨水NH3.H2O（含量為25-28%）纈氨酸組氨酸2、儀器：D/max-rAX型X-射線衍射儀（日本理學(xué)）Nicolet50X型紅外光譜儀（美國Nicolet公司）TEM-100Ⅶ型透射電子顯微鏡（日本Jeol）Perkin-ElmerDC/2C型差熱分析儀（美國Perkin-Elmer公司）SHZ-3型循環(huán)水真空泵（河南省鞏義市英峪儀器廠）MP200A型電子天平（上海第二天平儀器廠）電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（湖北黃石市醫(yī)療器械廠）JJ-1精密增力電動攪拌器（江蘇金壇市江南儀器廠）QXJ超聲分散儀（沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司）實(shí)驗(yàn)方法：1復(fù)合體的制備（1）Mg-Al-LDH的制備穩(wěn)態(tài)法將去離子水煮沸30分鐘，N2保護(hù)下冷卻到室溫，作為實(shí)驗(yàn)用水。將32gMg(NO3)2.6H2O（0.125mol）和23gAl(NO3)3.9H2O（0.0625mol）溶于125ml煮沸后的去離子水中，得到溶液a。將12gNaOH（0.30mol）和17gNaNO3（0.20mol）溶于145ml煮沸后的去離子水中，得到溶液b。將b溶液置于500ml的錐形瓶中，在N2保護(hù)下攪拌15分鐘，在N2保護(hù)和攪拌下，將溶液a滴加到溶液b中，在滴加過程中，不時(shí)檢測混合液的pH值，并用2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)混合液，使pH值始終等于10，1小時(shí)滴加完，然后繼續(xù)攪拌3小時(shí)，80℃老化三天。非穩(wěn)態(tài)法將去離子水煮沸30分鐘，N2保護(hù)下冷卻到室溫，作為實(shí)驗(yàn)用水。將30.77gMg(NO3)2.6H2O（0.12mol）和22.51gAl(NO3)3.9H2O（0.06mol）溶于360ml煮沸后的去離子水中，配成混合鹽溶液。再加入17gNaNO3（0.20mol），混勻。在N2保護(hù)和攪拌下，滴加共沉淀劑6%的氨水至pH值為10。攪拌均勻后老化1h，抽濾，用5L煮沸后的去離子水洗滌。將抽濾好的膠在80℃下進(jìn)行膠溶8h。由于非穩(wěn)態(tài)法操作簡單，本實(shí)驗(yàn)選擇了非穩(wěn)態(tài)法來制備Mg-Al-LDH。圖SEQ圖表\*ARABIC1制備的LDH圖SEQ圖表\*ARABIC2制備的LDH（2）氨基酸插層選擇離子交換法將氨基酸插層到LDH中。測得制備好的Mg-Al-LDH溶膠的固含量為8.5%。取溶膠1.475g，加水至25g，得到0.5%的分散體系，然后超聲5分鐘，使溶液混勻。分別將0.921gHis和0.937gVal加入到上述25g膠溶液中，使得生物分子的摩爾濃度為膠的1.5倍。溶解后，再超聲5分鐘，使溶液混勻。60℃下放置4天。4天后，將溶液在9000r/min下離心10分鐘，倒掉上清液，下層用蒸餾水洗滌兩次。60℃下烘干，得到氨基酸/LDH納米復(fù)合體。圖SEQ圖表\*ARABIC3制備的L-Val-LDH復(fù)合物2.脫層將氨基酸插層的LDH粉末溶解在100ml的25mmol/l的Na2CO3水溶液中，放置4天。4天后，將溶液在9000r/min下離心10分鐘，倒掉上清液，下層用蒸餾水洗滌一次。60℃下烘干，得到脫層后的LDH。3.表征測量LDH、氨基酸插層復(fù)合物及脫層后的LDH的粉末X射線衍射（XRD）圖；測量LDH及氨基酸插層復(fù)合物的紅外光譜（IR）圖；做LDH及氨基酸插層復(fù)合物的熱重分析（DTA/TG）圖；做LDH及氨基酸插層復(fù)合物的透射電鏡（TEM）分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論：1.XRD分析圖2.a).LDH;b).His-LDH;c).Val/LDH;d).Val/LDH脫層的XRD圖。Fig.2XRDpatternsfora).LDH;b).His/LDH;c).Val/LDH;d).deintercalationofVal/LDH.LDH、LDH與His和Val的反應(yīng)物以及Val/LDH脫層的XRD分析見圖2。由圖可以看出，Val插層進(jìn)入了LDH層間，使得LDH層間距由0.83nm增加到1.22nm，增加了0.39nm。而His沒有插層到LDH層間，LDH層間距沒有發(fā)生變化。Val/LDH用Na2CO3脫層后，LDH層間距又從1.22nm變?yōu)?.83nm，說明Na2CO3能將Val從Val/LDH復(fù)合體中洗脫下來。2.紅外分析圖3a).Val;b).Val/LDH;c)His;d).His/LDH的紅外圖。Fig.3IRspectraofa).Val;b).Val/LDH;c)His;d).His/LDH.Val、Val/LDH、His及His/LDH的紅外圖譜見圖3。Val的紅外圖譜中，在2949和2877cm－1處有C-H伸縮振動峰，在1564cm－1處為水的振動峰，在1506cm－1處為C-O伸縮振動峰（圖3a）。Val/LDH的紅外圖譜中，在3471cm－1處為-OH的振動峰,在2970cm－1處為C-H振動峰，在1587cm－1處為水的振動峰，在1509cm－1處為C-O伸縮振動峰,在1359cm－1處為C-N伸縮振動峰，與Val的紅外圖譜有相對應(yīng)的峰（圖3b），表明氨基酸已經(jīng)插層到了LDH中，這與XRD結(jié)論相一致。His的紅外圖譜中，在3014和2867cm－1處有C-N伸縮振動峰，在1630cm－1處為雜環(huán)振動峰，在1587cm－1處為水的振動峰，在1498cm－1處為C-O伸縮振動峰（圖3c）。His/LDH的紅外圖譜中，在3468cm－1處為-OH的振動峰,在1636cm－1處為水的振動峰，而1365cm－1處為NO3-的伸縮振動峰，與His的紅外圖譜沒有相對應(yīng)的峰，與純LDH圖完全相同，說明氨基酸沒有插層進(jìn)入LDH層間。3.熱重分析His和Val與LDH插層納米復(fù)合體TG/DTA曲線見圖4。當(dāng)插入氨基酸后，吸熱峰向低溫度移動，表明所得插層物的熱穩(wěn)定性降低。對于Val/LDH納米復(fù)合體，其DTA曲線中出現(xiàn)3個(gè)吸熱峰，相應(yīng)熱重曲線也出現(xiàn)三個(gè)失重臺階。第一個(gè)失重臺階在200~220℃附近，是由LDH層片物理吸附水的去除而引起的。第二個(gè)失重臺階在240~260℃左右，是LDH分子中脫羥基及氨基酸的降解過程，第三個(gè)失重臺階在310~400℃附近，LDH分子中的剩余羥基的脫除過程(圖4a)。對于His/LDH，其DTA曲線中出現(xiàn)2個(gè)吸熱峰，相應(yīng)熱重曲線也出現(xiàn)兩個(gè)失重臺階。第一個(gè)失重臺階在200~220℃附近，是由LDH層片物理吸附水的去除而引起的，但降解率遠(yuǎn)小于Val/LDH。第二個(gè)失重臺階在240~260℃附近，是LDH分子中脫羥基的過程(圖4b)。Val/LDH的熱重曲線中，三個(gè)失重臺階的總失重為46%，而在His/LDH的熱重曲線中，兩個(gè)失重臺階的總失重為37.8%，比Val/LDH少8.2%。這是因?yàn)閂al/LDH中有氨基酸插入，而His/LDH中沒有氨基酸插層。圖4a).Val-LDH;b)His-LDH的熱重分析圖。Fig.4TGAdatafora).Val/LDH;b)His/LDH.4.透射電鏡分析Val/LDH的透射電鏡圖如圖5所示。LDH納米粒子是邊長為100-120nm的正六邊形，Val與LDH作用后，層間距增大表明發(fā)生了插層反應(yīng)，所得納米粒子為不規(guī)則球體，球徑在200~350nm。說明Val插層到了LDH層間，修飾了LDH片層，但所得復(fù)合物仍保持片層結(jié)構(gòu)。His與LDH作用后，納米粒子的形狀沒有發(fā)生改變，仍是正六邊形，說明His沒有插層到LDH層間。圖5Val/LDH的透射電鏡圖。Fig.5TEMphotographsforVal/LDH.5.層間結(jié)構(gòu)討論LDH、Val/LDH及Val脫層的層間結(jié)構(gòu)圖見圖6。Val插層后，LDH的層間距增大到1.22nm，而LDH層片的寬度為0.48nm，所以Val在LDH層間的寬度為0.74nm。已知C-C鍵的長度為0.17nm，而Val的長度大約為4個(gè)C-C鍵的長度，約為0.68nm。由此可以認(rèn)為Val在LDH層間是垂直排列的（圖6b）。(b)1.22nm0.83nmNO3-(a)1.22nm0.83nmNO3-CO3CO3-(c)0.830.83nm.96nmM圖6a).LDH;b).Val/LDH;c)Val脫層的層間結(jié)構(gòu)圖。Fig.6schematicillustrationofa).LDH;b).Val/LDH;c)deintercalationofVal/LDH.實(shí)驗(yàn)結(jié)論:在實(shí)驗(yàn)中，我們選用了纈氨酸（Val）和組氨酸（His）兩種氨基酸，利用離子交換法將其插入到LDH中，并對得到的復(fù)合體進(jìn)行了進(jìn)一步的表征。X射線衍射結(jié)果表明，LDH層間距由0.83nm增加到1.22nm，增加了0.39nm，說明Val插層進(jìn)入了LDH層間，且是豎直排列的。而His沒有插層到LDH層間，LDH層間距沒有發(fā)生變化。Val/LDH的紅外圖譜與Val的紅外圖譜有相對應(yīng)的峰，表明氨基酸已經(jīng)插層到了LDH中，His/LDH的紅外圖譜與His的紅外圖譜沒有相對應(yīng)的峰，與純LDH圖完全相同，說明氨基酸沒有插層進(jìn)入LDH層間，這與XRD結(jié)論相一致。Val/LDH的熱重曲線，三個(gè)失重臺階的總失重為46%，而在His/LDH的熱重曲線，兩個(gè)失重臺階的總失重為37.8%，比Val/LDH少8.2%。這是說明Val/LDH中有氨基酸插入，而