人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會

48/48國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會ICH協(xié)調(diào)指導原則生物分析方法驗證及樣品分析M10終稿2022年5月24日采納在ICH進程第2階段，ICH大會將相應ICH專家工作組已達成共識的文本或指導原則草案遞交給ICH區(qū)域監(jiān)管機構(gòu)，用以按照相應國家或地區(qū)的程序-征求內(nèi)部和外部意見。

M10指導原則進程編碼進程日期M10ICH大會成員第二階段發(fā)布征求意見稿（2019年1月15日版）2019年2月26日M10ICH大會監(jiān)管機構(gòu)成員第四階段采納2022年5月24日法律聲明：本指導原則受版權(quán)保護，在ICH版權(quán)已得到認可的情況下，除ICH標識外，基于公共許可可以使用、復制、引用、改編、修改、翻譯或傳播，在任何情形下需在文件中承認ICH版權(quán)。如需要改編、修改或翻譯，必須進行合理的處理，明確注明或以其他方式標注對原文或基于原文進行的更改。必須避免任何暗示ICH授權(quán)或支持對原版文件改編、調(diào)整或翻譯的行為。本文件按現(xiàn)有狀態(tài)提供，不做任何形式的保證。任何情況下，ICH或原版文件作者不會對任何由使用本文件造成的索賠、傷害或其他責任負責。上述許可不適用于第三方提供的內(nèi)容。因此，對版權(quán)歸屬第三方的文件，必須從該版權(quán)持有者處獲得復制許可。ICH協(xié)調(diào)指導原則生物分析方法驗證及樣品分析M10ICH共識指導原則目錄TOC\o"1-3"\h\u213871.引言 6292971.1目的 6278371.2背景 6128201.3范圍 6229912.一般原則 7322672.1方法開發(fā) 7304642.2方法驗證 7295282.2.1完整驗證 7164092.2.2部分驗證 8281992.2.3交叉驗證 8230363.色譜法 8234703.1對照標準品 9208553.2方法驗證 9246193.2.1選擇性 94673.2.2特異性 1065933.2.3基質(zhì)效應 10268083.2.4校準曲線和范圍 11202863.2.5準確度和精密度 1267513.2.6殘留 1346253.2.7稀釋可靠性 13217563.2.8穩(wěn)定性 1374493.2.9進樣重現(xiàn)性 16177333.3研究樣品分析 16119463.3.1分析批 16251983.3.2分析批接受標準 17302653.3.3校正范圍 18288663.3.4研究樣品重分析 19219753.3.5研究樣品重進樣 2013373.3.6色譜圖積分 2013114.配體結(jié)合分析 2075484.1主要試劑 2014464.1.1對照標準品 2033494.1.2關鍵試劑 20317304.2方法驗證 2143644.2.1特異性 2164284.2.2選擇性 2296014.2.3校準曲線和范圍 22252234.2.4準確度和精密度 23217644.2.5殘留 24205664.2.6稀釋線性和鉤狀效應 24142624.2.7穩(wěn)定性 25165164.3研究樣品分析 26185594.3.1分析批 26275964.3.2分析批接受標準 26104574.3.3校正范圍 27129974.3.4研究樣品重分析 27286685.已測樣品再分析（ISR） 2832876.部分驗證和交叉驗證 30185486.1部分驗證 30286706.2交叉驗證 31305727.相關考慮 31326257.1待測物同為內(nèi)源性物質(zhì)的分析方法 318077.1.1待測物同為內(nèi)源性物質(zhì)分析方法的質(zhì)控樣品 331627.1.2待測物同為內(nèi)源性物質(zhì)分析方法的選擇性、回收率和基質(zhì)效應 3367937.1.3待測物同為內(nèi)源性物質(zhì)分析方法的平行性 34207967.1.4待測物同為內(nèi)源性物質(zhì)分析方法的準確度和精密度 34116757.1.5待測物同為內(nèi)源性物質(zhì)分析方法的穩(wěn)定性 34117807.2平行性 34264747.3回收率 35229837.4最低需求稀釋度 35316727.5商品化與診斷試劑盒 3539247.6新技術(shù)或備選技術(shù) 3661567.6.1干基質(zhì)方法 37307448.文檔資料 37179978.1摘要信息 37148048.2驗證和生物分析報告的文件 3823659.專業(yè)術(shù)語 43

1.引言1.1目的本指導原則旨在為化學藥物和生物藥物生物分析方法驗證及其在研究樣品分析中的應用提供建議，以確保用于支持化學藥物和生物藥物研發(fā)及注冊申請中生物分析結(jié)果的質(zhì)量和一致性。生物分析方法驗證旨在證明所采用的生物分析方法適用于預期目的。也可采用本指導原則建議以外的方法進行驗證，但需要提供適當?shù)目茖W依據(jù)。采用或擬采用不同方法驗證時，建議申請人就驗證方法的重大變更咨詢監(jiān)管機構(gòu)。1.2背景生物基質(zhì)中化學藥物和生物藥物及其代謝物的濃度測定是藥物開發(fā)過程中的重要內(nèi)容，研究結(jié)果有助于支持藥物安全性和有效性相關監(jiān)管決策。因此，所使用的生物分析方法必須經(jīng)過充分表征、適當驗證和記錄，以確保獲得可靠數(shù)據(jù)以支持監(jiān)管決策。某些情況下，本指南還可促進藥物研發(fā)過程中依據(jù)3Rs（減少、優(yōu)化、替代）原則進行動物研究。1.3范圍本指導原則描述了用于支持監(jiān)管決策的生物樣品（例如血液、血漿、血清、其他體液或組織）分析方法驗證及研究樣品分析。本指導原則適用于測定生物樣品（如全血、血漿、血清、其他體液或組織）中化藥和生物藥及其代謝產(chǎn)物濃度的檢測方法，上述生物樣品來自于：根據(jù)GLP原則進行的非臨床毒代動力學（TK）研究、可替代臨床研究的非臨床藥代動力學（PK）研究以及各期臨床試驗，包括向監(jiān)管機構(gòu)提交的生物利用度比較和生物等效性（BA/BE）研究。對擬提交注冊申請的研究中涉及的主要基質(zhì)，應進行完整的方法驗證，必要時，還應對其他基質(zhì)進行部分驗證。對不用于注冊申請、藥物安全有效性評估或說明書內(nèi)容的試驗（如探索性研究），申請人可根據(jù)其支持內(nèi)部決策的強度水平自行決定分析方法驗證的程度。本指導原則適用于配體結(jié)合分析法（LBAs）和色譜分析法[例如通常與質(zhì)譜檢測器聯(lián)用的液相色譜（LC）或氣相色譜（GC）]的定量分析。對于必須遵循藥物非臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范（GLP）或藥物臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范（GCP）的研究，研究樣品的生物分析也應符合其相關要求。本指導原則不適用于生物標志物和免疫原性分析方法。2.一般原則2.1方法開發(fā)生物分析方法開發(fā)的目的是確定方法的設計、操作條件、局限性和適用性以達到預期目的，并確保分析方法可用于驗證。在生物分析方法開發(fā)之前或進行中，如果可行，申請人應充分了解目標待測物（例如藥物的理化性質(zhì)、體內(nèi)外代謝、紅細胞/血漿分布以及蛋白結(jié)合情況），并考慮可能適用的任何現(xiàn)有分析方法的各個方面。方法開發(fā)涉及明確待測物定量檢測相關的過程和條件，包括以下要素的充分表征：標準品/對照品關鍵試劑校準曲線質(zhì)控樣品（QCs）選擇性和特異性靈敏度準確度精密度回收率待測物穩(wěn)定性最低需求稀釋度（MRD）生物分析方法開發(fā)不需要保存大量的記錄或注釋。方法開發(fā)一旦完成，需經(jīng)過方法驗證，證明該方法適用于研究樣品分析。如果在分析非臨床或臨床研究樣品期間遇到需要停止分析的問題，則應記錄檢測方法的任何變更及其理由。2.2方法驗證2.2.1完整驗證為確保分析性能的可接受性和分析結(jié)果的可靠性，必須對生物分析方法進行驗證。生物分析方法是用于測定生物樣品中待測物濃度的一系列操作步驟。在建立用于臨床和關鍵非臨床研究中待測物定量分析方法時，應對生物分析方法進行全面驗證。藥物研發(fā)過程中采用文獻報道的分析方法和商品試劑盒用于生物樣品分析時，也應進行完整驗證。通常情況下僅需測定一個待測物，但有時需檢測多個待測物，可能涉及兩種不同的藥物、原形藥物及其代謝物、或藥物的對映體或異構(gòu)體。此時，所有目標待測物的方法學驗證和樣品分析都應符合本指導原則。除另有說明外，色譜分析法的完整方法驗證應包括以下內(nèi)容：選擇性、特異性、基質(zhì)效應、校準曲線（響應函數(shù)）、范圍（定量下限（LLOQ）至定量上限（ULOQ））、準確度、精密度、殘留、稀釋可靠性、穩(wěn)定性和進樣重現(xiàn)性。除另有說明外，LBA的方法驗證應包括以下內(nèi)容：特異性、選擇性、校準曲線（響應函數(shù)）、范圍（LLOQ至ULOQ）、準確度、精密度、殘留、稀釋線性和穩(wěn)定性。必要時，如可獲得合適的研究樣品，還應進行平行性考察。方法學驗證期間開展的各項評估應與研究樣品的分析工作流程相關。用于分析方法驗證的基質(zhì)（包括抗凝劑和添加劑）應與研究樣品相同。在難以獲得與研究樣品相同基質(zhì)（例如，組織、腦脊液、膽汁等稀有基質(zhì)）或檢測游離藥物的情況下，可采用替代基質(zhì)開展分析方法驗證。替代基質(zhì)的選擇應科學合理。通常認為，同一物種內(nèi)不同基質(zhì)間的差異（如年齡、種族、性別）不會影響方法驗證。應事先建立詳細具體描述生物分析方法及驗證過程的書面文件，可采用研究方案、研究計劃、報告、記錄或標準操作規(guī)程（SOP）的形式。2.2.2部分驗證對經(jīng)完全驗證的分析方法的修改可以通過部分驗證進行評估。部分驗證的內(nèi)容應根據(jù)方法變更的范圍和性質(zhì)來確定，驗證內(nèi)容可從僅一項準確度和精密度驗證到幾乎完整驗證（參見第6.1節(jié)）。2.2.3交叉驗證當涉及多種分析方法和/或多個生物分析實驗室時，需采用交叉驗證評估報告數(shù)據(jù)間的相關性（參見第6.2節(jié)）。3.色譜法3.1對照標準品分析方法驗證和研究樣品分析時，需將含有目標待測物的對照標準品溶液加入空白基質(zhì)中，以制備校正標樣和質(zhì)控樣品。校正標樣和質(zhì)控樣品應采用不同的儲備液配制。但是，如果儲備液的準確度和穩(wěn)定性已得到驗證，校正標樣和質(zhì)控樣品可采用相同的儲備液配制。應在所有校正標樣、質(zhì)控樣品和研究樣品處理過程中加入適宜的內(nèi)標（IS）。若不加內(nèi)標，應提供相應的支持性證據(jù)。對照標準品具有良好性質(zhì)至關重要，其質(zhì)量會影響分析結(jié)果，從而影響研究數(shù)據(jù)，因此要確保其質(zhì)量（純度、鑒別）和內(nèi)標的適用性。方法驗證和研究樣品分析過程中使用的對照標準品的來源應可靠并可追溯，并且其化學形式應與待測物相同。如果無法獲得與待測物相同的對照標準品，也可以使用質(zhì)量可控的其他化學形式的物質(zhì)（例如鹽或水合物）。適宜的對照標準品包括藥典標準品、商業(yè)化標準品或經(jīng)充分驗證的內(nèi)部或外部組織制備的標準品。應提供分析證書（CoA）或同等的其他材料來證明對照標準品的質(zhì)量，應包含有關純度、儲存條件、重新標定/失效日期和批號的相關信息。內(nèi)標不需要提供分析證書，只要證明其適用性即可，例如能夠證明該物質(zhì)本身或其相關的任何雜質(zhì)對于待測物的檢測不會產(chǎn)生干擾。使用質(zhì)譜檢測時，建議盡可能使用穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)標。同位素內(nèi)標必須具有足夠高的同位素純度，并且不會發(fā)生同位素交換反應。應檢查是否存在未標記待測物，如果檢測到未標記待測物，則應在方法驗證期間評估其潛在影響。儲備液和工作液應當使用分析證書所標明的穩(wěn)定期內(nèi)（即有效期或重新標定日期）的對照標準品制備。3.2方法驗證3.2.1選擇性選擇性是分析方法在空白生物基質(zhì)中存在潛在干擾物質(zhì)的情況下區(qū)分和測定待測物的能力。應使用至少6個不同個體來源/批次（非溶血和非高脂）的空白基質(zhì)（不含待測物或內(nèi)標的基質(zhì)樣品）證明選擇性。在不同來源的基質(zhì)難以獲得的情況下，可以使用更少來源的基質(zhì)。還應評估內(nèi)標的選擇性。選擇性的評估應證明空白樣品中待測物或內(nèi)標的保留時間處沒有干擾組分引起的顯著響應。每個基質(zhì)中，干擾組分的響應不應高于待測物定量下限響應的20%，并且不高于定量下限樣品中內(nèi)標響應的5％。高脂基質(zhì)選擇性的評價應使用至少一種來源的高脂基質(zhì)。為保證科學目的，用于驗證的基質(zhì)應盡可能代表預期研究樣品。應盡量從甘油三酯水平異常高的受試者中獲得。如果難以獲得，也可以使用加入甘油三酯的基質(zhì)，雖然其并不能完全代表實際研究樣品。如果藥物影響脂質(zhì)代謝或預期的患者是高脂血癥群體，則不建議使用加入甘油三酯制備的高脂基質(zhì)。高脂基質(zhì)的選擇性驗證對于臨床前研究來說不是必需的，除非藥物影響脂質(zhì)代謝或者在特定的高脂血癥動物中應用。溶血基質(zhì)選擇性的評價應使用至少一種來源的溶血基質(zhì)，可通過向基質(zhì)中加入溶血全血（至少2%V/V）獲得，以形成明顯可見的溶血樣品。3.2.2特異性特異性是生物分析方法檢測和區(qū)分待測物與其他物質(zhì)的能力，包括相關物質(zhì)（例如與待測物結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)、代謝物、異構(gòu)體、雜質(zhì)、樣品制備過程中形成的降解產(chǎn)物，或預期目標適應癥患者的合并用藥）。如果生物基質(zhì)中預計存在相關物質(zhì)，則應在方法驗證期間或者在給藥前研究樣品中評估其影響。當采用LC-MS方法時，特異性的考察包括比較待測物與潛在相關干擾物質(zhì)的分子量以及將相關物質(zhì)與待測物色譜分離。干擾組分的響應不應超過待測物定量下限響應的20%，并不高于定量下限樣品中內(nèi)標響應的5%。在分析檢測過程中（包括提取過程或進入離子源以后），還應評估代謝物回復轉(zhuǎn)化為母體待測物的可能性（即潛在不穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物，如酯待測物到醇/酸代謝物、不穩(wěn)定的N-氧化物或葡萄糖苷酸代謝物、內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)）。在新化學實體藥物開發(fā)的早期階段尚未對代謝物進行研究時，這種評估通常無法實現(xiàn)。但建議考慮以上情形，并在必要時進行部分驗證。如存在上述情況，則應該在生物樣品分析報告中評估回復轉(zhuǎn)化程度，并討論對研究結(jié)果的影響。3.2.3基質(zhì)效應基質(zhì)效應是指由于生物基質(zhì)中的干擾物質(zhì)和通常未識別的成分引起的待測物響應的改變。在方法驗證過程中，需要考察不同來源/批次間的基質(zhì)效應?；|(zhì)效應應通過分析至少3個重復的低和高濃度質(zhì)控樣品進行評估，每個重復使用至少6個不同來源/批次的基質(zhì)制備。對于每一個來源/批次的基質(zhì)，準確度應在標示濃度的±15％以內(nèi)，并且精密度（變異系數(shù)百分比，％CV）不應大于15％。如果基質(zhì)難以獲得，可以允許使用更少來源/批次的基質(zhì)。如有可能，基質(zhì)效應也應在相關的患者群體或特殊人群（例如肝功能不全或腎功能不全患者）中評估。當預計試驗中會出現(xiàn)溶血或高脂基質(zhì)時，建議在方法驗證期間根據(jù)具體情況使用溶血或高脂基質(zhì)進行額外的基質(zhì)效應考察。3.2.4校準曲線和范圍校準曲線用于描述待測物的標示濃度與分析響應之間的關系。通過在空白基質(zhì)中加入已知濃度待測物制備校正標樣，涵蓋相應的濃度范圍并組成校準曲線。配制校正標樣的基質(zhì)應與研究樣品基質(zhì)相同。校準曲線的濃度范圍由定量下限（LLOQ，校正標樣的最低濃度）和定量上限（ULOQ，校正標樣的最高濃度）來決定。在方法驗證和每一分析批中，每個待測物都應隨行一條校準曲線。校準曲線應包括空白樣品、零濃度樣品（僅加入內(nèi)標的空白樣品）和至少6個濃度水平的校正標樣（包括定量下限和定量上限）。應使用簡單的回歸模型來充分描述濃度-響應關系?；貧w模型的選擇應該有書面的操作規(guī)程指導。應在方法驗證期間確定回歸模型、數(shù)據(jù)加權(quán)和轉(zhuǎn)換方案?？瞻讟悠泛土銤舛葮悠凡粦摪谛是€回歸方程當中。校正標樣可以重復分析，在這種情況下，所有可接受的重復數(shù)據(jù)都應納入校準曲線回歸分析。報告中應包括校準曲線參數(shù)（例如線性擬合時的斜率和截距）、校正標樣的回算濃度和計算的平均準確度、精密度。應提交在驗證過程中所有可接受的校準曲線，其中包括不同天內(nèi)考察的至少3個獨立分析批的校準曲線。在定量下限水平，校正標樣的回算濃度應在標示濃度的±20％以內(nèi)，其他水平應在標示值的±15％以內(nèi)。至少有75％的校正標樣且至少6個濃度水平應符合上述標準。在使用重復測定的情況下，對于每個濃度水平，至少50％的校正標樣應滿足接受標準（LLOQ±20％，其他濃度±15％）。如果不符合接受標準，則應拒絕該校正標樣，并重新擬合去除該點后的校準曲線，包括回歸分析。對于準確度和精密度考察的批次，如果分析批定量下限或定量上限校正標樣的所有重復數(shù)據(jù)都不合格，則應拒絕該批次結(jié)果，確定分析批失敗的可能原因，并在必要時修改方法。如果下一個驗證批次也失敗，則應在重新啟動驗證之前修改該方法。應至少在一次評估中采用新鮮配制的校正標樣制備校準曲線。隨后，可在規(guī)定的穩(wěn)定期內(nèi)使用冷凍的校正標樣。3.2.5準確度和精密度3.2.5.1質(zhì)控樣品配制質(zhì)控樣品旨在模擬研究樣品，通過將已知濃度的待測物加入到空白基質(zhì)中來配制，并在與研究樣品相同預期條件下儲存和檢測，以評估分析方法的有效性。校正標樣和質(zhì)控樣品應采用不同的儲備液配制，以避免出現(xiàn)與分析方法性能無關的偏差。如果儲備液的準確度和穩(wěn)定性已得到驗證，則可使用相同的儲備液配制校正標樣和質(zhì)控樣品。如果不存在干擾或基質(zhì)效應，也可以使用單一來源的空白基質(zhì)，詳見第3.2.3節(jié)。在方法驗證過程中，應配制在校準曲線范圍內(nèi)至少4個濃度水平的質(zhì)控樣品：LLOQ、在LLOQ濃度三倍以內(nèi)（低濃度質(zhì)控）、約為校準曲線范圍的30-50％（中濃度質(zhì)控）和至少ULOQ的75％（高濃度質(zhì)控）。對于非準確度和精密度驗證的分析批，可重復分析低、中和高濃度QC樣品。這些QC樣品連同校正標樣將為接受或拒絕分析批提供依據(jù)。3.2.5.2準確度和精密度評估準確度和精密度應通過分析每一個分析批（批內(nèi)）和不同分析批間（批間）的質(zhì)控樣品來確定。應使用相同批次的數(shù)據(jù)考察準確度和精密度。批內(nèi)準確度和精密度應通過在每一分析批、對每個濃度水平的質(zhì)控樣品進行至少5個樣品分析來評估。批間準確度和精密度需要通過對每個濃度水平質(zhì)控在至少兩天內(nèi)考察的至少3個分析批結(jié)果進行評價。為了能夠評估一個分析批內(nèi)隨時間變化的任何趨勢，建議至少在一個分析批中證明質(zhì)控樣品的準確度和精密度，該分析批的大小應與研究樣品預期分析批大小相當。報告的方法驗證數(shù)據(jù)以及準確度和精密度的測定應包括所有獲得的結(jié)果，包括不符合接受標準的單個質(zhì)控樣品，已被記錄的明顯錯誤情況除外。同時還要提交每個分析批的批內(nèi)準確度和精密度數(shù)據(jù)。如果不是所有分析批的批內(nèi)準確度和精密度均滿足標準，則應計算每個濃度水平質(zhì)控樣品的批內(nèi)準確度和精密度的總體估計值。批間精密度和準確度應合并所有批次的數(shù)據(jù)進行計算。用于這些考察的分析批中，至少一個分析批的校準曲線應采用新鮮配制的校正標樣制備。如果其他分析批未使用新鮮配制的校準曲線，則需證明凍存校正標樣的穩(wěn)定性。除LLOQ外，每個濃度水平質(zhì)控樣品的準確度應在標示值的±15％以內(nèi)，LLOQ的準確度應在標示值的±20％以內(nèi)。除LLOQ外，每個濃度水平質(zhì)控樣品的精密度（％CV）不應超過15％，LLOQ的精密度不應超過20％。對于非準確度和精密度驗證的分析批，至少2/3的QC樣品、每個濃度水平的至少50%應在標示值的±15%以內(nèi)。3.2.6殘留效應殘留效應是指前一個樣品保留在分析儀器上的殘余物而引起測定濃度變化。在方法開發(fā)過程中應當評估并盡量減少殘留。在驗證期間，通過在ULOQ樣品之后分析空白樣品來考察殘留效應。在ULOQ之后的空白樣品中的殘留應不超過LLOQ樣品中待測物響應的20％和內(nèi)標響應的5％。如果殘留不可避免，則研究樣品不能隨機進樣，應考慮具體措施，在方法驗證時檢驗并在研究樣品分析時應用這些措施，以確保殘留不影響準確度和精密度。包括在分析預期高濃度樣品之后，下一個研究樣品之前，進樣空白樣品。3.2.7稀釋可靠性稀釋可靠性是在必要時對樣品稀釋過程的評估，以確保不會對待測物濃度的準確度和精密度造成影響，應使用與配制質(zhì)控樣品相同物種來源的空白基質(zhì)進行樣品稀釋。稀釋質(zhì)控樣品的濃度應大于ULOQ，采用空白基質(zhì)對樣品進行稀釋，每個稀釋因子至少5個測定值，并在同一批次進行檢測，以確保檢測濃度在校準曲線范圍內(nèi)被準確、精密地測量。研究樣品分析過程中所用稀釋因子和濃度應該處于方法學驗證的稀釋因子和濃度范圍內(nèi)。稀釋質(zhì)控的平均準確度應在標示值的±15%之內(nèi)，精密度（%CV）不應超過15%。當試驗基質(zhì)難以獲得時，在證明不影響精密度和準確度的情況下可以使用替代基質(zhì)進行稀釋。3.2.8穩(wěn)定性應進行穩(wěn)定性考察，以確保樣品在制備、處理和分析過程中采取的每一步操作以及使用的儲存條件都不會影響待測物的濃度。用于穩(wěn)定性試驗的儲存和分析條件，如樣品儲存時間和溫度、樣品基質(zhì)、抗凝劑和容器材料等，都應與實際研究樣品相同。文獻報道的數(shù)據(jù)不足以證明穩(wěn)定性結(jié)果。穩(wěn)定性考察中質(zhì)控樣品的儲存時間不應比研究樣品儲存時間短。采用低濃度和高濃度穩(wěn)定性質(zhì)控樣品考察基質(zhì)中待測物的穩(wěn)定性。低濃度和高濃度穩(wěn)定性質(zhì)控樣品應分別在零時和考察條件下放置后進行評價。應在每個濃度水平下制備一批QC樣品。對于每個濃度水平，應將這批QC樣品分為至少3等份，以進行儲存、處理和分析。由新鮮制備的校正標樣獲得校準曲線，根據(jù)校準曲線分析穩(wěn)定性質(zhì)控樣品，同批次隨行檢測新鮮制備的質(zhì)控樣品或穩(wěn)定性已被證明的質(zhì)控樣品。每一濃度的均值應在標示濃度的±15%范圍內(nèi)。如果研究樣品的濃度持續(xù)高于校準曲線的ULOQ，則應調(diào)高穩(wěn)定性質(zhì)控樣品的濃度，以反映這些較高濃度樣品的穩(wěn)定性結(jié)果。由于溶解度的限制，這種情況在非臨床研究中很難出現(xiàn)。對固定復方制劑或特定藥物治療方案相關研究，應使用含所有給藥化合物的基質(zhì)進行各待測物在基質(zhì)中的凍融、前處理過程中和長期穩(wěn)定性的考察。通常應該進行下列穩(wěn)定性考察：1）基質(zhì)中的穩(wěn)定性凍融穩(wěn)定性為了評估從冷凍儲存條件中反復取出樣品的影響，應在多次冷凍和解凍循環(huán)后考察待測物的穩(wěn)定性。應采用與研究樣品相同的處理過程，對低和高濃度穩(wěn)定性質(zhì)控樣品進行解凍和分析。穩(wěn)定性質(zhì)控樣品應在解凍循環(huán)之間保持至少12小時的冷凍。用于凍融穩(wěn)定性考察的質(zhì)控樣品應使用新鮮制備的校準曲線和質(zhì)控樣品或已證明穩(wěn)定的質(zhì)控樣品進行評估。經(jīng)驗證的冷凍-解凍循環(huán)次數(shù)應不少于研究樣品所經(jīng)歷的凍融循環(huán)次數(shù)，至少應進行三次循環(huán)。前處理穩(wěn)定性（短期穩(wěn)定性）應設計考察基質(zhì)中待測物前處理過程中的穩(wěn)定性實驗，以模擬研究樣品的實驗室處理條件。低濃度和高濃度穩(wěn)定性質(zhì)控樣品應采用與研究樣品相同的方式解凍，并在前處理過程中保持與研究樣品相同的溫度和至少相同的持續(xù)時間。在前處理過程中的總時間應該是一致的；不接受額外暴露于前處理條件下的時間累加（即不包括每次凍融考察的時間累加）。長期穩(wěn)定性應考察基質(zhì)中的待測物在冰箱中儲存的長期穩(wěn)定性。低濃度和高濃度穩(wěn)定性質(zhì)控樣品應在與研究樣品相同的冰箱儲存條件下保存至少相同的持續(xù)時間。對于化學藥物，可以接受將一個溫度（例如-20℃）的穩(wěn)定性外推到較低溫度（例如-70/80℃）。對于生物藥物，可以采用括號法，例如，在-70/80°C和-20°C條件下的穩(wěn)定性已經(jīng)被證明的情況下，若研究樣品儲存溫度在此范圍之間，則不必額外考察研究樣品儲存溫度下的長期穩(wěn)定性。2）處理后樣品中的待測物穩(wěn)定性應考察處理后樣品穩(wěn)定性，包括分析完成前（在自動進樣器/儀器中）的時間。如：處理后樣品（干燥提取物或在進樣階段）在研究樣品分析時存放條件下的穩(wěn)定性。處理后樣品在儀器或自動進樣器溫度下的穩(wěn)定性。處理后樣品的總存儲時間應該是同期的（即自動進樣器存儲時間和其他存儲時間不能相加）。3）儲備液和工作液中待測物和內(nèi)標穩(wěn)定性應根據(jù)分析研究樣品期間使用的儲存條件，確定待測物和內(nèi)標的儲備液和工作液的穩(wěn)定性，采用溶液的最低和最高濃度進行考察?？紤]到檢測器的線性和檢測范圍，應通過適當稀釋，通過檢測器的響應來考察儲備液和工作液的穩(wěn)定性。如果穩(wěn)定性隨濃度而變化，則需要考察所有濃度儲備液和工作液的穩(wěn)定性。如果穩(wěn)定同位素標記內(nèi)標在與待測物相同的儲存條件下不發(fā)生同位素交換，則內(nèi)標不需要進行額外的穩(wěn)定性考察。如果對照標準品過期或已超過重新標定日期，之前使用該批對照標準品配制的儲備液的穩(wěn)定性由儲備液的有效期或重新標定日期決定。僅為了延長對照標準品的使用效期而將其配制成儲備液或工作液的做法是不被接受的。此外，如果適用，也應該進行下列考察：4）全血穩(wěn)定性樣品從受試者采集之后到儲存之前，應該充分關注樣品基質(zhì)（全血）中待測物的穩(wěn)定性，以確保通過分析方法獲得的濃度能夠反映樣品采集時受試者血液中待測物的濃度。如果使用的基質(zhì)是血漿，則應在方法開發(fā)（例如在全血中使用探索性方法）或方法驗證期間考察全血中待測物的穩(wěn)定性。其結(jié)果應在方法驗證報告中提供。3.2.9進樣重現(xiàn)性方法的重現(xiàn)性通過重復測定質(zhì)控樣品來考察，通常包含在精密度和準確度考察中。但如果樣品可以重新進樣（例如在儀器中斷或其他原因如設備故障的情況下），應評估重新進樣的重現(xiàn)性，以確定處理過的樣品的可行性，并支持它們在重新進樣前的儲存。重新進樣的重現(xiàn)性通過由儲存后的校正標樣和至少5個低濃度和高濃度QC組成的分析批重新進樣來評估，以重新進樣的QC樣品的精密度和準確度確定處理后樣品重新進樣的可行性。應當考察并將其結(jié)果納入方法驗證報告或在生物分析報告中提交。3.3研究樣品分析方法驗證完進樣重現(xiàn)性成之后可進行研究樣品分析，然而部分驗證內(nèi)容可以在后續(xù)階段完成（如長期穩(wěn)定性）。提交注冊申請時生物分析方法驗證應已全部完成。根據(jù)已驗證的分析方法處理研究樣品、質(zhì)控樣品和校正標樣。如果考察系統(tǒng)適用性，則應參照預先規(guī)定的具體研究計劃、方案或SOP進行。系統(tǒng)適用性包括設備適應和儀器性能，采用獨立于當前批次校正標樣和質(zhì)控的樣品進行考察，受試者樣品不能用于考察系統(tǒng)適用性。同時應監(jiān)測研究樣品中內(nèi)標響應，以確定是否存在系統(tǒng)性內(nèi)標變異。有關內(nèi)容請參考表1。3.3.1分析批一個分析批由1個空白樣品（不含待測物和內(nèi)標的處理后樣品）、1個零濃度樣品（含內(nèi)標的處理后基質(zhì)）、至少6個濃度水平的校正標樣、至少3個濃度水平的質(zhì)控樣品（低、中、高濃度雙樣品，或至少研究樣品總數(shù)的5％，兩者中取數(shù)目更多者）以及待分析的研究樣品。質(zhì)控樣品應該分散到整個分析批中，以保證整個分析批的準確度和精密度。質(zhì)控樣品應始終與研究樣品同樣處理。校正標樣和質(zhì)控樣品應使用單獨配制的儲備液分別配制，除非儲備液的準確度和穩(wěn)定性已得到驗證。所有樣品（校正標樣、質(zhì)控樣品和研究樣品）應按照擬分析順序在同一處理批中處理和提取。應避免在同一分析批檢測的樣品在多個單獨處理批中處理。以上情況無法避免時，例如由于前處理穩(wěn)定性限制，則每個處理批應包括低、中、高濃度質(zhì)控樣品。對于比較BA/BE研究，建議每例受試者的全部樣品在同一分析批中檢測，以減少結(jié)果的變異。應評估和報告研究樣品分析過程中發(fā)生的任何殘留影響（見第3.2.6節(jié)）。如檢測到殘留，則應減輕其對測定濃度的影響（例如研究樣品的非隨機化、在預期高濃度樣品后進樣空白樣品）或在生物樣品分析報告中證明報告濃度的有效性。3.3.2分析批接受標準應在方案、研究計劃或SOP中規(guī)定接受或拒絕分析批的標準。若一個分析批包含多個處理批，則整個分析批及單獨處理批均應滿足接受標準。即使分析批中一個處理批因不滿足接受標準被拒絕，分析批也存在滿足接受標準的可能。失敗處理批中的校正標樣不能用于支持在該分析批中接受其他處理批。除LLOQ外，校正標樣的回算濃度應在標示值的±15％以內(nèi)，LLOQ應在±20％范圍內(nèi)。至少75％且不少于6個濃度水平的校正標樣應滿足該標準。如果采用的校正標樣濃度超過6個且其中一個不滿足標準，則應該拒絕該校正標樣，重新計算不含該點的校準曲線并進行新的回歸分析。如果拒絕的校正標樣是LLOQ，則該分析批新的LLOQ是校準曲線下一個可接受的最低濃度校正標樣；新的LLOQ應滿足其原來的接受標準（即±15％）。如果最高濃度校正標樣被拒絕，則該分析批的ULOQ是校準曲線下一個可接受的最高濃度校正標樣。重新擬合后的校準曲線范圍應覆蓋至少3個濃度水平（低、中、高）的質(zhì)控樣品。對于重新擬合校準曲線范圍以外的研究樣品應重新進行分析。如果使用多樣品校正標樣，其中僅有一個LLOQ或ULOQ標樣不滿足接受標準，則校正范圍不變。至少2/3且每一濃度水平至少50%質(zhì)控樣品的準確度值應該在標示值的±15%范圍內(nèi)。若不滿足這一標準，則應拒絕該分析批。需要將失敗分析批中的所有研究樣品制備新的分析批次，以便進行后續(xù)分析。如果批次失敗是由可歸結(jié)的技術(shù)原因引起的，則樣品可以重新進樣。含有稀釋復測樣品的分析批應包含稀釋質(zhì)控，以驗證研究樣品分析過程中稀釋方法的準確度和精密度。稀釋質(zhì)控的濃度應大于需稀釋研究樣品（或ULOQ）的濃度，并采用相同的稀釋因子進行稀釋。如果在一次分析批中使用多個稀釋因子，則稀釋QC只需按最高和最低稀釋因子稀釋。稀釋質(zhì)控的批內(nèi)接受標準僅影響稀釋研究樣品的接受情況，不影響分析批的結(jié)果。在同時檢測多個待測物的情況下，每個待測物都要有一條校準曲線。如果分析批其中一個待測物的結(jié)果可以接受，而另一個待測物的結(jié)果被拒絕，則可以采用接受待測物的數(shù)據(jù)，被拒絕的待測物應重新處理和分析。只需要報告重新分析的待測物的數(shù)據(jù)。報告中應包含接受批的校正標樣和質(zhì)控樣品的回算濃度。對于所有接受的分析批，應計算每個濃度水平質(zhì)控樣品的總體（批間）準確度和精密度，并在分析報告中提交（參見第8節(jié)和表1）。若總體平均準確度和/或精密度不滿足15％的接受標準，則應進行調(diào)查以確認出現(xiàn)偏差的原因。在比較BA/BE研究中出現(xiàn)這種情況，可能會導致結(jié)果被拒絕。3.3.3校正范圍如果在研究樣品分析開始前，已知或預測研究樣品中的待測物濃度范圍較窄，則建議縮窄校準曲線范圍、調(diào)整質(zhì)控樣品濃度或適當添加不同濃度新的質(zhì)控樣品，以充分反映研究樣品的濃度。在預期的治療劑量下，如果在樣品分析開始后，出現(xiàn)研究樣品向校準曲線一端非預期聚集的情況，應停止分析，在繼續(xù)進行研究樣品分析之前，縮窄校準曲線范圍（即部分驗證）、調(diào)整現(xiàn)有質(zhì)控樣品濃度，或者在觀察到的范圍內(nèi)增加額外濃度的質(zhì)控樣品。在優(yōu)化校準曲線范圍或質(zhì)控濃度之前已分析過的樣品，沒有必要進行重新分析。以上要求同樣適用于大量研究樣品的分析濃度高于ULOQ的情況。如果可能，應調(diào)整校準曲線范圍，并增加質(zhì)控樣品或調(diào)整濃度。如無法調(diào)整校準曲線范圍或濃度超過ULOQ的樣品數(shù)量不多，則應采用經(jīng)驗證的稀釋方法對樣品進行稀釋。至少2個質(zhì)控樣品濃度水平應在研究樣品的濃度范圍內(nèi)。如果校準曲線范圍被調(diào)整，則應重新驗證生物分析方法（部分驗證），以驗證響應函數(shù)并確保準確度和精密度。3.3.4研究樣品重分析研究樣品分析開始前，應該在方案、研究計劃或SOP中預先規(guī)定重新分析研究樣品的理由、重復次數(shù)以及報告值的選擇標準。對于正在分析多種待測物的研究樣品，如果其中一種待測物不符合接受標準，不應拒絕另一種待測物的有效結(jié)果。應在生物樣品分析報告中提供并討論重分析樣品的數(shù)量（以及占樣品總數(shù)的百分比）。對于比較BA/BE研究，應使用單獨的表格報告拒絕的分析批的濃度值。研究樣品重分析可能基于下列理由：由于校正標樣的準確度和/或質(zhì)控樣品的準確度和精密度不滿足接受標準，導致分析批被拒絕；研究樣品的內(nèi)標響應與校正標樣和質(zhì)控樣品的內(nèi)標響應差異顯著（在SOP中預先規(guī)定）；測得的濃度高于ULOQ；測得的濃度低于調(diào)整后的LLOQ，而該批校準曲線中最低濃度校正標樣已被拒絕，導致LLOQ比其他分析批高；進樣不當或設備故障；稀釋后的研究樣品濃度低于LLOQ；在給藥前樣品、對照或安慰劑樣品中測得可定量的待測物；色譜圖不佳（SOP中預先規(guī)定）。對于比較BA/BE研究，通常不接受由于藥代動力學原因（例如樣品濃度與預期曲線不符）重分析研究樣品，因為這樣可能會影響研究結(jié)果。應在生物樣品分析報告中提供包含所有重分析樣品的初始值、重分析原因、重分析結(jié)果、采用結(jié)果及理由的匯總表。此外，應提供針對每種原因重新分析的樣本總數(shù)的匯總表。在首次分析結(jié)果無法報告的情況下，認為單次重分析是足夠的（例如濃度高于ULOQ或儀器故障）。在需要對檢測結(jié)果進行確認情況下（例如給藥前樣品具有可測量濃度），如果樣品體積足夠，則可以進行重復測定。受試者的安全性應優(yōu)先于試驗中的任何其他方面。因此，可能還有其他情況，需要因調(diào)查安全性而重新分析特定的研究樣品。3.3.5研究樣品重進樣如果已經(jīng)在方法驗證時證明了進樣重現(xiàn)性或在生物樣品分析報告中提供了進樣重現(xiàn)性的結(jié)果，在儀器故障的情況下，可以將已經(jīng)處理的樣品重新進樣分析。僅僅因為校正標樣或質(zhì)控樣品失敗，而沒有任何確定的分析原因，就重新進樣一個完整的分析批或個別校正標樣或質(zhì)控樣品是不可接受的。3.3.6色譜圖積分在研究計劃、方案或SOP中應規(guī)定色譜圖積分以及重積分的要求。任何與規(guī)定要求不符的偏離都應在生物樣品分析報告中討論，此外，生物分析報告中還應提供需要重積分的色譜圖列表，包括所有手動積分情況以及重積分的理由。應保留原始和重積分色譜圖以及初始和重復積分結(jié)果以供參考，并在比較BA/BE研究的生物樣品分析報告中提交。4.配體結(jié)合分析4.1主要試劑4.1.1對照標準品對照標準品應進行充分表征并提供充足的證明性文件（例如，檢驗分析證書和來源）。生物藥物具有高度復雜的結(jié)構(gòu)，其與用于生物樣品分析的結(jié)合試劑的反應活性可能會受藥品生產(chǎn)工藝變化影響。因此用于配制校正標樣和質(zhì)控的對照標準品批次應盡可能與非臨床試驗和臨床試驗中使用的批次保持一致。如果用于生物樣品分析的標準品批次發(fā)生變化，則應在使用前用原始批次和新批次的質(zhì)控樣品進行評估，以確保方法學的性能符合接受標準。4.1.2關鍵試劑關鍵試劑包括結(jié)合試劑（例如結(jié)合蛋白、適配子、抗體或偶聯(lián)抗體）和含酶試劑，對分析結(jié)果有直接影響，因此必須確保關鍵試劑的質(zhì)量。關鍵試劑通過與待測物結(jié)合，發(fā)生相互作用以產(chǎn)生與待測物濃度相關的儀器響應。應在分析方法中對關鍵試劑進行鑒定和規(guī)定。在方法開發(fā)的早期應考慮關鍵試劑的可靠采購方式，無論是自制還是購買商品化試劑。關鍵試劑的數(shù)據(jù)表應至少包括試劑標識、來源、批次/批號，純度（如適用）、濃度（如適用）和穩(wěn)定性/復測日期/儲存條件（參考表1）。也有可能需要提供額外的表征數(shù)據(jù)。關鍵試劑生命周期管理程序是必要的，以確保關鍵試劑的原始批次和新批次的一致性。試劑性能應通過生物分析方法來評估。一般關鍵試劑的微小變化不會影響分析性能，而重大變化可能會顯著影響其性能。如果變化較?。ɡ纾渲幸环N試劑來源發(fā)生變化），則進行一個對比性的準確度和精密度分析批驗證即可。但如果變化較大，則有必要進行額外的驗證試驗。理想情況下，直接對新試劑和舊試劑的分析結(jié)果進行比較即可。重大變化包括但不限于以下方面：抗體生產(chǎn)工藝的改變，從動物采集的額外血樣用于制備多克隆抗體和新克隆、新供貨商的單克隆抗體。應記錄復驗日期和驗證參數(shù)，以支持延長使用或更換關鍵試劑。試劑的穩(wěn)定性試驗應基于生物分析方法中試劑的性能表現(xiàn)和儲存條件的一般指導原則，考察時間可延長至超過供應商提供的效期范圍。同時應記錄性能參數(shù)，來支持關鍵試劑效期延長或更換。4.2方法驗證LBA大部分情況下使用微孔板，每個研究樣品可使用單孔或多孔的方式進行分析。分析方式應在方案、研究計劃或SOP中進行規(guī)定。如果在方法學開發(fā)和驗證中每個樣品使用單孔或多孔進行分析，那么樣品分析中也應該每個樣品相應地分別使用單孔或多孔進行分析。如果每個樣品采用多孔方式進行分析，可以采用復孔響應的平均值來報告樣品濃度或分別計算每個孔的濃度值，再取復孔濃度平均值的方法報告結(jié)果。數(shù)據(jù)評估應基于可報告的濃度值。4.2.1特異性特異性與LBA中的交叉反應性概念有關。重要的是，結(jié)合試劑與目標待測物特異性結(jié)合，但不與共存的結(jié)構(gòu)相關分子（例如，內(nèi)源性化合物、異構(gòu)體或結(jié)構(gòu)相關的伴隨藥物）發(fā)生交叉反應?？刹捎迷诳瞻谆|(zhì)樣品中添加研究樣品中最大濃度的預期相關干擾物質(zhì)來考察。應考察加入最大濃度相關干擾物質(zhì)時，目標待測物在LLOQ和ULOQ水平的準確度。添加相關干擾物質(zhì)的空白樣品的響應應低于LLOQ。存在相關干擾物質(zhì)的情況下，目標待測物的準確度不應超過標示值的±25。當存在非特異性干擾的情況下，應在空白基質(zhì)中添加遞增濃度的相關干擾物質(zhì)，考察目標待測物在LLOQ和ULOQ水平的準確度，來評估相關干擾物質(zhì)對分析方法的影響。存在干擾時，需確定發(fā)生干擾時相關干擾物質(zhì)最低濃度。在生物樣品分析過程中，應采取適當措施避免，例如，可能需要相應地調(diào)整LLOQ/ULOQ或考慮新方法。在方法學開發(fā)和早期分析驗證期間，這些“相關干擾物質(zhì)”通常不可獲得?？梢栽谧畛醯姆椒▽W驗證完成后，再補充特異性驗證。4.2.2選擇性選擇性是指在樣品基質(zhì)中存在非特異性干擾成分時，分析方法檢測和區(qū)分目標待測物的能力?；|(zhì)中可能含有干擾目標待測物檢測的非特異性成分，如降解酶、異嗜性抗體或類風濕因子。應評估低濃度水平的選擇性，因為在很多案例中，低濃度水平的分析會存在選擇性的問題，但也建議在較高的待測物濃度水平下評估選擇性。因此，應通過向至少10個不同來源的空白基質(zhì)中，分別加入LLOQ和高濃度質(zhì)控水平的目標待測物來考察選擇性。在稀有基質(zhì)的情況下，可接受使用較少不同來源的空白基質(zhì)。至少80不同來源的空白樣品的響應應低于LLOQ的響應。至少80不同來源中，目標待測物標樣樣品的LLOQ的準確度應在標示值的±25%范圍內(nèi)，高濃度水平質(zhì)控的準確度應在標示值的±20%范圍內(nèi)。應評估高脂基質(zhì)和溶血樣品中的選擇性（參考第3.2.1節(jié)）。對于高脂和溶血樣品，可以使用單一來源的基質(zhì)分析一個批次來評估選擇性。應在相關患者人群（如腎或肝功能損傷患者、炎癥或免疫腫瘤患者，如適用）的樣品中評估選擇性。在這種情況下，至少需要使用5名患者不同來源的基質(zhì)。4.2.3校準曲線和范圍校準曲線反映了待測物濃度與分析平臺響應值之間的關系。校準曲線由已知濃度的待測物加入基質(zhì)中配制得到的構(gòu)成一定濃度范圍的校正標樣組成。校正標樣應使用與研究樣品相同的生物基質(zhì)制備。定量范圍由最低濃度的校正標樣LLOQ和最高濃度的校正標樣ULOQ來定義。在方法學驗證期間，每一個待測物的每一個分析批都應有一條校準曲線。如有需要，應說明使用替代基質(zhì)的合理性。校準曲線應至少由6個濃度水平的校正標樣建立，包括LLOQ和ULOQ，以及一個空白樣品?？瞻讟悠凡粦獏⑴c校準曲線參數(shù)的計算?？梢允褂脻舛鹊陀跇藴是€LLOQ和高于ULOQ的錨定點樣品來改善曲線的擬合。如果上下漸近線附近有數(shù)據(jù)點，則校準曲線的響應和濃度之間的關系通常由四參數(shù)或五參數(shù)logistic模型來擬合，如果有合理的理由，也可采用其他模型進行擬合。應該在不同天內(nèi)評估至少6個獨立批次，以考察批次間的變異性。每個校正標樣回算濃度的準確度和精密度應滿足：LLOQ和ULOQ水平的準確度和精密度在標示值的±25范圍內(nèi)，其他所有濃度水平的準確度和精密度在標示值的±20范圍內(nèi)。在不包括錨定點的情況下，應至少有75，且至少6個濃度水平的校正標樣（包括LLOQ和ULOQ）符合上述標準。錨定點因超出校準曲線的定量范圍，可不要求滿足上述標準。建議校準曲線采用新鮮配制的校正標樣。如果不使用新鮮配制的校正標樣，則可在規(guī)定的穩(wěn)定期內(nèi)使用凍存的校正標樣。4.2.4準確度和精密度4.2.4.1質(zhì)控樣品的配制質(zhì)控樣品旨在模擬研究樣品，通過在基質(zhì)中加入已知量的待測物來配制，并在與預期研究樣品相同的條件下儲存和檢測，以評估分析方法的有效性。用于配制質(zhì)控樣品的稀釋系列應完全獨立于用于配制校正標樣的稀釋系列。如果儲備液的準確度和穩(wěn)定性已得到驗證，，則可使用同一份儲備液（或工作儲備液）來配制校正標樣和質(zhì)控樣品。在校準曲線定量范圍內(nèi)質(zhì)控樣品應至少配制5個濃度水平：LLOQ、LLOQ的三倍以內(nèi)（低濃度質(zhì)控）、校準曲線定量范圍幾何平均值附近（中濃度質(zhì)控）、ULOQ的75%以上（高濃度質(zhì)控）以及ULOQ。對于非準確度和精密度驗證分析批，可分析兩組低、中和高濃度QC樣品。這些QC樣品連同校正標樣將為接受或拒絕分析批提供依據(jù)。4.2.4.2準確度和精密度評估準確度和精密度應通過分析每一個分析批內(nèi)（批內(nèi)）和不同分析批間（批間）的質(zhì)控樣品來確定。準確度和精密度應使用同樣的分析批和數(shù)據(jù)來進行評估。準確度和精密度應通過在2天或2天以上的至少6個分析批中，對每一個質(zhì)控濃度水平（LLOQ、低、中、高、ULOQ）至少重復分析3次來確定。報告的方法驗證數(shù)據(jù)和準確度及精密度的測定應包括所有可獲得的結(jié)果，但明顯錯誤且記錄在案的情況除外。應報告每個分析批的批內(nèi)準確度和精密度數(shù)據(jù)。如果不是所有的分析批均符合批內(nèi)準確度或精密度的接受標準，則應計算每一個濃度水平質(zhì)控樣品的批內(nèi)準確度和精密度的總體估計值。分析批之間（批間）精密度和準確度應結(jié)合所有分析批的數(shù)據(jù)來計算。除LLOQ和ULOQ（應在標示值的±25范圍內(nèi)）外，每個濃度水平下的批內(nèi)和批間總體準確度應在標示值的±20%范圍內(nèi)。除LLOQ和ULOQ不應超過25外，每一濃度水平質(zhì)控的批內(nèi)和批間精密度均不應超過20%。對于非準確度和精密度驗證分析批，至少2/3的總質(zhì)控樣品和每個濃度水平至少50%的質(zhì)控樣品應在標示值的±20%范圍內(nèi)。此外，還應評估總誤差（即準確度（%）和精密度（%）誤差絕對值的總和））?？傉`差不應超過30%（LLOQ和ULOQ的總誤差不應超過40%）。4.2.5殘留效應LBA一般不會出現(xiàn)殘留效應的問題。但是，如果分析平臺有出現(xiàn)殘留的趨勢，應通過在ULOQ的校正標樣之后放置空白樣品來考察殘留效應的可能性?？瞻讟悠返捻憫獞陀贚LOQ。4.2.6稀釋線性和鉤狀效應由于很多LBA的分析范圍狹窄，因此研究樣品的濃度可能需要稀釋后才能處于定量范圍內(nèi)。對稀釋線性進行評估，以確定：（i）測量濃度在校準曲線范圍內(nèi)不受稀釋的影響，以及（ii）高于校準曲線ULOQ的樣品濃度的準確性不受鉤狀效應（即由高濃度待測物引起的信號抑制）的影響，以免產(chǎn)生錯誤的結(jié)果。應使用與研究樣品相同的基質(zhì)來制備稀釋用質(zhì)控樣品。稀釋線性采用稀釋質(zhì)控來驗證，即在基質(zhì)中加入高于ULOQ濃度的待測物，分析未稀釋的樣品（用于鉤狀效應），同時用空白基質(zhì)稀釋該樣品（至少3個不同稀釋因子）至校準曲線濃度范圍內(nèi)。至少用3個獨立配制的稀釋系列來考察每一個稀釋因子，復孔數(shù)與樣品分析中的復孔數(shù)保持一致。通過稀釋質(zhì)控樣品驗證是否存在響應抑制現(xiàn)象（鉤狀效應），如果觀察到該現(xiàn)象且不能通過合理的方式來消除，則應在研究樣品分析過程中采取措施減輕響應抑制。經(jīng)稀釋因子校正后，每個稀釋質(zhì)控樣品的計算平均濃度應在標示值的±20%范圍內(nèi)，精密度不應超過20%。在研究樣品分析過程中應用的稀釋因子應在經(jīng)驗證合格的稀釋因子范圍內(nèi)。4.2.7穩(wěn)定性應進行穩(wěn)定性評估，以確保樣品制備、處理和分析過程中的每一步驟以及儲存條件不會影響待測物的濃度。穩(wěn)定性試驗的儲存和分析條件，如樣品儲存時間和溫度、樣品基質(zhì)、抗凝劑和容器材料，都應反映實際研究樣品條件。僅用參考文獻報道的數(shù)據(jù)證明穩(wěn)定性是不夠的。應采用儲存時間等于或大于研究樣品儲存時間的穩(wěn)定性質(zhì)控樣品進行儲存期限的驗證。使用低濃度和高濃度的穩(wěn)定性質(zhì)控樣品評估待測物在基質(zhì)中的穩(wěn)定性。低和高濃度的穩(wěn)定性質(zhì)控樣品分別在零時和一定儲存條件儲存后進行評估。每個濃度水平應制備一批質(zhì)控樣品，該批質(zhì)控樣品至少分成三份，用于儲存、處理和分析。由新鮮制備的校正標樣獲得校準曲線，根據(jù)校準曲線分析穩(wěn)定性質(zhì)控樣品，同批次隨行檢測新鮮制備的質(zhì)控樣品或穩(wěn)定性已被證明的質(zhì)控樣品。盡管使用新鮮制備的校正標樣和質(zhì)控樣品是首選的方式，但對于大分子，在某些情況下，可能需要將其冷凍過夜。在這種情況下，應提供有效的數(shù)據(jù)證明凍融穩(wěn)定性。質(zhì)控樣品在每個凍融循環(huán)間應該至少冷凍12小時。每個質(zhì)控水平下的平均濃度與標示值的偏差應在±20%范圍內(nèi)。在定量范圍狹窄的情況下，許多LBA可能需要對樣品進行稀釋，研究樣品的濃度可能始終高于校準曲線的ULOQ。如果是這種情況，應考慮樣品稀釋，調(diào)整穩(wěn)定性質(zhì)控樣品的濃度來表示實際樣品濃度范圍。對于固定劑量復方制劑和特定的給藥方案，評估基質(zhì)中一個待測物的凍融穩(wěn)定性、前處理穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性時，應該在基質(zhì)中加入所有的給藥化合物，具體視情況而定。如第3.2.8節(jié)所述，穩(wěn)定性的驗證應包括室溫或樣品制備溫度下的前處理過程（短期）穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性。此外，應驗證長期凍存穩(wěn)定性。對于化學藥物，將一種溫度（例如-20℃）下的穩(wěn)定性外推至更低溫度（例如-70℃/-80℃）是可接受的。對于生物藥物，可以采用括號法，例如在-70℃/-80℃和-20°C下證明穩(wěn)定性的情況下，則無需考察樣品在這兩個溫度之間儲存的穩(wěn)定性。4.3研究樣品分析在驗證完成后可進行研究樣品的分析，但是一些參數(shù)可能在稍后的階段中完成（例如，長期穩(wěn)定性）。當數(shù)據(jù)提交給監(jiān)管機構(gòu)時，生物分析方法學驗證應該已經(jīng)完成。研究樣品、質(zhì)控樣品和校正標樣的處理應與經(jīng)過驗證的分析方法保持一致。有關內(nèi)容請參閱表1。4.3.1分析批一個分析批包括一個空白樣品，至少6個濃度水平的校正標樣，至少3個濃度水平的質(zhì)控樣品（低、中和高）各兩套（或至少占研究樣品總數(shù)的5，以較高者為準），以及待分析研究樣品?？瞻讟悠凡粦{入校準曲線參數(shù)的計算中。質(zhì)控樣品應分散在分析批中，且能夠與所有研究樣品同樣處理，以確保整個分析批準確度和精密度符合要求。大多數(shù)情況下，LBA使用微孔板。一個分析批可包括一個或多個板。通常，每塊板包含一套獨立的校準曲線和質(zhì)控樣品。如果每塊板包含獨立的校準標樣和質(zhì)控樣品，那么需單獨評估每塊板是否符合接受標準。但是，對于某些分析平臺，樣品容量可能是有限的。這種情況下，可以在第一塊和最后一塊板上各放置一套校正標樣，但質(zhì)控樣品應分散在每塊板上。至少在每塊板的研究樣品開始（之前）和結(jié)束（之后）均應放置質(zhì)控樣品。每塊板上的質(zhì)控樣品及每條校準曲線均應符合接受標準（參見第4.3.2節(jié)）。計算濃度時，應整合所有校正標樣進行一次回歸分析。如果整合的校準曲線不符合接受標準，則整個分析批失敗。4.3.2分析批接受標準在方案、研究計劃或SOP中應明確定義接受或拒絕分析批的標準。如果分析批包含多個處理批，則整個分析批和各個處理批均應符合接受標準。即使分析批中的一個處理批因不符合接受標準而被拒絕，分析批也有可能滿足接受標準。在失敗的分析批中的校準樣品不能用于支持同分析批中其他批次的接受。校正標樣除LLOQ和ULOQ水平外的所有濃度水平的回算濃度應在標示值的±20以內(nèi)，LLOQ和ULOQ水平的回算濃度應在標示值的±25以內(nèi)。至少75的校正標樣且至少6個濃度水平，應符合上述接受標準。上述要求不適用于錨定點校正標樣。如果設置超過6個校正標樣，且其中一個校正標樣不符合接受標準，則應拒絕該校正標樣，應剔除該校正標樣后對校準曲線進行重新評估并再次進行回歸分析。如果校正標樣的LLOQ不符合要求被拒絕，則此分析批新的定量下限為校準曲線可接受的次低濃度的校正標樣。如果校準標樣的ULOQ不符合要求被拒絕，則該分析批新的定量上限為校準曲線可接受的次高濃度的校正標樣。修訂后的定量下限和定量上限校正標樣將保持原來的接受標準（即±20）。修訂后的校準曲線校正范圍必須涵蓋所有質(zhì)控樣品（低、中、高）。超出修訂后校準曲線校正范圍的研究樣品應重新進行分析。每個分析批應至少包含3個濃度水平質(zhì)控樣品（低、中、高）。在研究樣品分析過程中，校正標樣和質(zhì)控樣品應與研究樣品的復孔數(shù)保持一致。至少2/3的質(zhì)控樣品以及在每個濃度水平下50％的質(zhì)控樣品的準確度應在標示值的±20以內(nèi)。如果接受標準與上述標準不同，則應在SOP或方案中預先說明。應計算所有可接受分析批中每個濃度水平質(zhì)控樣品總體的平均準確度和精密度，并在分析報告中進行報告。如果總體平均準確度和/或精密度超過20，應進行額外的調(diào)查以分析導致該偏差的原因。在比較BA/BE研究中，這種情況可能會導致數(shù)據(jù)被拒絕。4.3.3校正范圍研究樣品分析中，至少2個水平的質(zhì)控樣品應落入研究樣品測定的濃度范圍內(nèi)。在預期的治療劑量下，如果研究樣品開始分析后，發(fā)現(xiàn)研究樣品的結(jié)果聚集在校準曲線一端，那么應停止分析，在繼續(xù)進行研究樣品分析之前，可采取下列方法優(yōu)化檢測方法：縮小標準校準范圍（即部分驗證），更改現(xiàn)有的質(zhì)控濃度，或者在原校準曲線范圍內(nèi)增加額外濃度水平的質(zhì)控樣品。在優(yōu)化校準曲線范圍或質(zhì)控濃度之前，不需重新分析已分析的研究樣品。4.3.4研究樣品重分析在開始分析研究樣品之前，應在方案、研究計劃或SOP中預先規(guī)定重分析生物樣品的可能原因、重分析的數(shù)量和重分析后選擇報告值的標準。應在生物分析報告中報告并討論重分析的樣品數(shù)量（以及占樣品總數(shù)的百分比）。對于比較BA/BE研究，應使用單獨的表格報告拒絕的分析批的濃度值。研究樣品重分析可能原因有：由于校正標樣的準確度和/或質(zhì)控樣品的精密度和準確度不符合接受標準，因而拒絕該分析批；檢測濃度高于ULOQ；因校準曲線LLOQ被拒絕，調(diào)整后的校準曲線的定量下限高于其他分析批，導致檢測濃度低于調(diào)整后的定量下限；設備發(fā)生故障；稀釋樣品濃度低于LLOQ；給藥前樣品、對照或安慰劑樣品中檢測到可定量的目標待測物；如果生物樣品為復孔檢測，由于一個孔的結(jié)果未能達到預定義的接受標準（例如，復孔間差異較大，其中一個孔的濃度高于ULOQ或低于LLOQ）而獲得不可報告的值。對于比較BA/BE研究，不可接受由于PK原因（例如樣品濃度不符合預期曲線）對研究樣品進行的重分析，因為這樣可能導致試驗結(jié)果發(fā)生偏差。生物分析報告中應報告重分析樣品，并提供初始值、重分析的原因、重分析的結(jié)果、最終接受的值以及接受的理由。此外，報告中應提供由于各種原因而重分析的樣品匯總表。如果在第一次分析時，產(chǎn)生了不可報告結(jié)果，那么單次樣品重分析是足夠的（例如，濃度高于ULOQ或復孔間的差異過大）。樣品的重分析的復孔數(shù)應與最初分析時的孔數(shù)一致。在某些需要確認檢測結(jié)果的情況下（例如，給藥前樣品檢測到可測量濃度），在樣品體積允許時需要多樣品測定。臨床試驗受試者的安全應優(yōu)先于試驗的任何其他方面。因此，在其他情況下，可能需要為了調(diào)查目的重新分析特定研究樣本。5.已測樣品再分析（ISR）研究樣品與方法驗證中使用的校正標樣和QC樣品的表現(xiàn)可能不同，后者是通過向空白基質(zhì)中加入待測物而制備的。在蛋白結(jié)合、已知或未知代謝物的回復轉(zhuǎn)化、樣品非均一性、合并用藥或研究樣品特有的生物組分等方面的差異，可能影響測定的研究樣品中待測物的濃度。ISR旨在驗證所報告的樣品待測物濃度的可靠性。至少應在下列情況下開展ISR：對于本指南范圍內(nèi)的非臨床試驗，一般每個種屬應至少進行一次ISR所有關鍵性的比較BA/BE試驗首次人體臨床試驗關鍵性早期患者試驗，每個患者群體一次首次或關鍵性肝功能和/或腎功能不全患者試驗通過使用同樣的生物分析方法，在不同天單獨的（即不同于原來的）分析批重新分析給定試驗的部分樣品，來開展ISR。ISR的規(guī)模依賴于待測物和研究樣品，并應基于對分析方法和待測物的深入了解。當研究樣品總數(shù)≤1000時，至少應重新分析10%的樣品；如果樣品總數(shù)>1000，則應分析前1000樣品的10%（即100），加上超過1000樣品數(shù)目的5%樣品。應在研究方案、研究計劃或SOP中，預先確定ISR研究樣品選取的客觀標準。應從用藥的群體中，盡可能隨機選擇受試者/實驗動物，重要的是足以覆蓋濃度分布。因此，推薦在峰濃度（Cmax）周圍選擇ISR樣品以及部分在消除相選擇。此外，所選擇的樣品應代表整個試驗。不應混合樣品，因為混合樣品可能限制異常情況的發(fā)現(xiàn)。ISR樣品和質(zhì)控樣品應以和原始分析同樣的方式處理和分析。應在待測物穩(wěn)定性窗口內(nèi)進行ISR，但不應在與原始分析的同一天。應根據(jù)下式計算原始濃度和重新分析測得濃度平均值的百分偏差：%差值=對于色譜方法，至少2/3的重新分析的百分偏差應在±20%范圍內(nèi)。對于LBA方法，至少2/3的重新分析的百分偏差應在±30%范圍內(nèi)。如果總體ISR結(jié)果不符合接受標準，則應進行調(diào)查并糾正原因。應該有SOP指導如何引發(fā)和開展調(diào)查。如果調(diào)查不能確定失敗原因，則也應在分析報告中提供ISR失敗對試驗有效性的影響。如果ISR滿足接受標準，但在多個樣品的結(jié)果中顯示較大的或系統(tǒng)性誤差，這可能表明分析存在問題，建議繼續(xù)開展調(diào)查。值得關注的趨勢性例子可能包括：來自一名受試者的所有ISR均失敗來自一個分析批的所有ISR均失敗ISR評價的所有內(nèi)容均應記錄，以允許重構(gòu)該試驗和任何調(diào)查。與原始值偏差很大（例如>50%或“異常值”）的單個樣品不應引發(fā)對原始樣品的重新分析，且不必調(diào)查。ISR樣品數(shù)據(jù)不應取代研究樣品的原始數(shù)據(jù)。6.部分驗證和交叉驗證6.1部分驗證部分驗證旨在評價對已經(jīng)完整驗證的生物分析方法的修改。部分驗證的范圍可由少至一個批內(nèi)準確度和精密度的測定，到接近于完整驗證。如果在一個場所建立了穩(wěn)定性，則不必在另一個場所重復驗證。對于色譜法，這類典型的生物分析方法修改或變更包括但不限于下列情形：使用同樣方法，但變更分析地點（即生物分析方法在不同實驗室間轉(zhuǎn)移）分析方法變更（例如變更檢測體系、檢測平臺）樣品處理步驟變更樣品體積變更（例如較小的兒童樣品體積）標準曲線濃度范圍變更生物體液中抗凝劑變更（但反離子不變）（例如從肝素變?yōu)橐叶匪囊宜幔‥DTA）同一種屬，從一種基質(zhì)變更為另一種基質(zhì)（例如從人血漿變?yōu)檠寤蚰X脊液），或同一基質(zhì)，從一個種屬變更為不同種屬（例如從大鼠血漿變更為小鼠血漿）儲存條件變更對于LBA分析，這類典型的生物分析方法修改或變更包括但不限于下列情形：LBA關鍵試劑變更（例如變更批號）MRD變更儲存條件變更標準曲線濃度范圍變更分析方法變更（例如變更檢測體系或檢測平臺）使用同樣方法，但變更分析地點（即生物分析方法在不同實驗室間轉(zhuǎn)移）樣品預處理變更生物體液中抗凝劑變更（但反離子不變）（例如從肝素變?yōu)镋DTA）如果檢測到的參數(shù)滿足完整驗證標準，則部分驗證可以被接受。如果不滿足這些標準，則需要額外的調(diào)查和驗證。6.2交叉驗證當涉及多個生物分析方法和/或多個生物分析實驗室時，需采用交叉驗證來評估報告數(shù)據(jù)間的相關性。下列情形需要進行交叉驗證：在一項試驗中，從不同的經(jīng)完整驗證的方法獲得數(shù)據(jù)在一項試驗中，從不同實驗室使用同一生物分析方法獲得數(shù)據(jù)在不同試驗中，從不同的經(jīng)完整驗證的方法獲得數(shù)據(jù)，將被合并或用于比較，以支持特定給藥方案，或監(jiān)管機構(gòu)用于做出關于安全性、有效性和藥品說明書的決定如果數(shù)據(jù)來自不同的經(jīng)完全驗證的方法，并且數(shù)據(jù)不用于各試驗合并，通常不需要交叉驗證。如果可能，應在分析研究樣品之前進行交叉驗證。交叉驗證應使用兩種方法或在兩個實驗室中測量同一批QC樣品（低、中、高濃度），至少三個重復，和在試驗研究濃度范圍內(nèi)的實際樣品（如果可以獲得）（n330）的結(jié)果進行評估?？赏ㄟ^Bland-Altman作圖或Deming回歸來評估偏差。也可以使用其他用于評估兩種方法一致性的工具（例如一致性相關系數(shù)）。還可以用每種方法得到的研究樣品檢測濃度-時間曲線作圖來評估偏差。在進行一項比較BA/BE試驗中，強烈反對使用多種生物分析方法來測量同一待測物。7.相關考慮7.1待測物同為內(nèi)源性物質(zhì)的分析方法對于同為內(nèi)源性物質(zhì)的待測物（例如替代療法），當檢測方法不能區(qū)分治療藥物和內(nèi)源性物質(zhì)時，待測物檢測的準確性成為挑戰(zhàn)。此外，待測物的內(nèi)源性水平可能隨年齡、性別、人種、晝夜變化、疾病或藥物治療的副作用的變化而變化。生物標志物不在本指南的范圍內(nèi)。如有可能，用于制備校正標樣和QC樣品的生物基質(zhì)應與研究樣品基質(zhì)（即真實的生物基質(zhì)）相同，且應如第3節(jié)和第4節(jié)所述無基質(zhì)效應和干擾。選擇的生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)濃度應足夠低，以獲得足夠的信噪比（例如，小于LLOQ的20%）。在沒有可用的無干擾基質(zhì)時，可使用以下方法計算研究樣品中待測物的濃度：1）替代基質(zhì)法，2）替代待測物法，3）背景扣除法，4）標準添加法。替代基質(zhì)法：采用替代基質(zhì)配制校正標樣。替代基質(zhì)從簡單緩沖液或仿真人工基質(zhì)，到去除內(nèi)源性待測物的基質(zhì)或其他的基質(zhì)，復雜程度可能有很大差異。替代待測物法：采用穩(wěn)定同位素標記的待測物作為質(zhì)譜法中的替代標準物質(zhì)，以構(gòu)建內(nèi)源性待測物定量的校準曲線。此方法假設實際待測物和替代待測物除分子量外的物理化學性質(zhì)基本相同。然而，同位素標準物質(zhì)的保留時間和質(zhì)譜靈敏度可能不同于待測物，因此，在應用該方法之前，應確認標記與未標記待測物的質(zhì)譜響應的比率（即響應因子）應接近一致，并在整個校準范圍內(nèi)保持恒定。如果響應因子不符合這些要求，則應將其納入校準曲線的回歸方程中。背景扣除法：外加待測物的校正標樣中測得的濃度減去在合并基質(zhì)/代表性基質(zhì)中測得的內(nèi)源性物質(zhì)濃度，然后使用凈差值建立校準曲線。加入標準物質(zhì)前，若通過稀釋空白基質(zhì)來降低背景濃度（例如，如果需要更低的LLOQ），則研究樣品和校正標樣中基質(zhì)的組成不同，可能導致不同的回收率和基質(zhì)效應。在驗證方法時，應考慮這些差異。標準添加法：標準添加法僅適用于具有線性響應的分析平臺。通常，標準添加法用于確定實際基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)的濃度，以用于制備校正標樣和QC樣品。然而，該方法也可用于研究樣品的測定。該方法中，每個研究樣本被分成等份。除一份外，所有等分試樣均單獨加入已知和不同量的待測物標準，以構(gòu)建實際空白基質(zhì)或每個研究樣品的校準曲線（例如，3到5個點）。然后將內(nèi)源性空白濃度或研究樣品濃度確定為該特定研究樣品中制備的校準曲線的x軸負截距。除了第3節(jié)和第4節(jié)中所示的驗證外，同為內(nèi)源性物質(zhì)的待測物的分析方法進行驗證還需要考慮以下因素。7.1.1待測物同為內(nèi)源性物質(zhì)分析方法的質(zhì)控樣品在制備QC樣品之前，應評估生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)濃度。應使用內(nèi)源性干擾物質(zhì)濃度盡可能低的基質(zhì)。QC樣品的濃度應考慮實際基質(zhì)中的內(nèi)源性物質(zhì)濃度，并應代表預期的研究樣品濃度。QC樣品應類似于研究樣品，并應在同一基質(zhì)中制備。原則上，用于驗證的所有QC樣品濃度應為未添加（如果可能，內(nèi)源性物質(zhì)濃度在LLOQ和LQC之間）和添加已知濃度（HQC、MQC和LQC）的實際生物基質(zhì)濃度的整數(shù)倍。添加樣品（例如LLOQ、LQC）中待測物添加量應足以提供比內(nèi)源性物質(zhì)濃度高三倍以上，或統(tǒng)計學上足以顯示比內(nèi)源性濃度更高。如果多批次、不同供應商和可能含有較低濃度待測物的特殊群體基質(zhì)等，總是產(chǎn)生內(nèi)源性物質(zhì)水平很高的基質(zhì)，以致無法在實際基質(zhì)中制備LQC，則可使用稀釋基質(zhì)或替代基質(zhì)。7.1.2待測物同為內(nèi)源性物質(zhì)分析方法的選擇性、回收率和基質(zhì)效應由于缺乏無干擾的基質(zhì)，選擇性的評估很復雜。對于色譜法，作為方法驗證的一部分，應通過使用分辨檢測系統(tǒng)（例如串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS））分析來自多個供體（至少6個正?？瞻?、1個溶血和1個脂質(zhì)）的基質(zhì)來考察峰純度。如果有科學原理證明，也可以考慮其他方法。對于標準添加法和背景扣除法，由于研究樣品和校正標樣使用相同的生物基質(zhì)和待測物，故兩者具有相同的回收率和基質(zhì)效應。然而，如果內(nèi)源性成分不完全相同（例如重組蛋白），則應在一項平行試驗中評估回收率的潛在差異。對于替代基質(zhì)和替代待測物方法，校正標樣和研究樣品之間的基質(zhì)效應和提取回收率可能不同。應評估并確保基質(zhì)效應（特別是在LLOQ水平）不會影響準確度和精密度。如果使用替代基質(zhì)法，應評估替代基質(zhì)和實際基質(zhì)中不同基質(zhì)效應和回收率的影響。應在同一項實驗中，采用基質(zhì)中加入待測物、僅內(nèi)源性基質(zhì)以及替代基質(zhì)中加入待測物得到的QC樣品，用替代校準曲線進行分析。如果在質(zhì)譜色譜法中使用替代待測物方法，應評估替代待測物和實際內(nèi)源性物質(zhì)之間不同基質(zhì)效應和回收率的影響。應在同一項實驗中，采用基質(zhì)中加入待測物、僅內(nèi)源性基質(zhì)以及替代物加入基質(zhì)中得到的QC樣品，用替代基質(zhì)校準曲線進行分析。在某些情況下，當內(nèi)源性物質(zhì)水平較高且LLOQ需要降低時，可能需要使用替代基質(zhì)稀釋QC樣品（例如背景扣除法）。此時，應使用內(nèi)源性物質(zhì)濃度在LLOQ和LQC之間的實際生物基質(zhì)（如果可用），重復進行回收率和基質(zhì)效應實驗。色譜法和LBA法的接受標準分別參見第3節(jié)和第4節(jié)。由于