殘留檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展課件

化學(xué)物及代謝物分離純化監(jiān)控獸藥等化學(xué)物樣品檢測(cè)方法快速檢測(cè)方法儀器確證方法固相萃取技術(shù)基質(zhì)固相分散技術(shù)免疫親和色譜技術(shù)分子印跡技術(shù)超臨界萃取技術(shù)四、有害化合物殘留檢測(cè)技術(shù)微生物抑制測(cè)定法酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法量子點(diǎn)標(biāo)記熒光檢測(cè)法熒光偏振免疫檢測(cè)法化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)法放射免疫測(cè)定法金標(biāo)試紙條生物傳感器生物芯片1、快速檢測(cè)方法熒光偏振免疫分析技術(shù)熒光偏振免疫分析（Fluorescencepolarizationimmunoassay，F(xiàn)PIA）是競(jìng)爭(zhēng)性的均相免疫分析方法，就是檢測(cè)熒光標(biāo)記抗原（tracer）在結(jié)合特異性的抗體前后，熒光偏振值（FP）值的變化，不需要分離結(jié)合的和未結(jié)合的抗體，經(jīng)過幾分鐘甚至是幾秒鐘的溫育便可直接測(cè)量，很快得到被測(cè)藥物的濃度，實(shí)驗(yàn)的時(shí)間僅僅決定于加樣的時(shí)間熒光素與磺胺二甲基嘧啶偶聯(lián)SM2-FITCTLC分離純化FFFFFYYYYYYYFFYFYFFY測(cè)定熒光偏振值

藥物最低檢測(cè)限ng/mL半數(shù)抑制量ng/mL回收率（%）磺胺二甲基嘧啶116雞肉：78-89磺胺氯吡嗪0.2529牛奶：60-120磺胺甲氧吡嗪0.711.5牛奶：68-145馬杜霉素2160雞肉：92-132雞脂肪：92-121雞蛋：125-82鹽霉素0.0833.2-喹諾酮類（12種）0.1-110-20牛奶：70-110幾種獸藥檢測(cè)分析結(jié)果時(shí)間分辯免疫分析技術(shù)

時(shí)間分辨熒光免疫分析（TrFIA）是利用鑭系絡(luò)合物作為標(biāo)記物的免疫分析技術(shù)，其絡(luò)合物具有熒光壽命長、激發(fā)光譜帶較寬、發(fā)射光譜帶甚窄和Stokes位移大等特點(diǎn)，可以消除背景熒光的干擾，有效提高檢測(cè)方法的靈敏度化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)

化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA），一般分為兩種模式。第一種是以發(fā)光劑作為酶免疫測(cè)定的底物，通過發(fā)光反應(yīng)增強(qiáng)測(cè)定的敏感性；第二種是以發(fā)光劑作為抗體或抗原的標(biāo)記物，直接通過發(fā)光反應(yīng)檢測(cè)標(biāo)本中抗原或抗體的含量

量子點(diǎn)標(biāo)記免疫分析技術(shù)

量子點(diǎn)(quantumdots，QDs)又稱半導(dǎo)體納米微晶體，是一種由II-VI族或Ⅲ-V族元素組成的，直徑約為1-100nm，能夠接受激發(fā)光產(chǎn)生熒光的半導(dǎo)體納米顆粒，量子點(diǎn)表面結(jié)構(gòu)經(jīng)過修飾，借助于其外端的羧基，能與生物分子的氨基相結(jié)合，如抗體等偶聯(lián)1pg/g1ng/g1g/g1mg/g紫外/可見分光光度法放射免疫測(cè)定法/酶免疫測(cè)定法色質(zhì)聯(lián)用分析放射受體分析氣相色譜(ECD/NPD)氣相色譜(FID)高效液相色譜(FLD/UVD)極譜法熒光分光光度法微生物測(cè)定法比色法各種測(cè)定方法的靈敏度范圍有害化合物殘留檢測(cè)：先用快速檢測(cè)產(chǎn)品進(jìn)行篩查，可疑陽性樣品再用儀器分析方法尤其是色質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法加以確證。美國、歐盟、日本等均采用此策略，抽檢數(shù)量超過總樣品數(shù)的10%！1、快速檢測(cè)產(chǎn)品種類試劑盒試紙條生物傳感器免疫芯片快速檢測(cè)儀檢測(cè)箱目前主要的快速檢測(cè)產(chǎn)品包括:五、快速檢測(cè)產(chǎn)品研制2、小分子抗體制備技術(shù)目前抗體種類主要是多抗和單抗替代抗體：基因重組抗體、納米抗體、核酸適配體、抗轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、受體、分子印跡聚合物等均有相關(guān)研究核酸適配體抗轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白信息含量豐富的半抗原合理設(shè)計(jì)小分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化計(jì)算化學(xué)性質(zhì)參數(shù)（物化、電量、空間等信息）最佳半抗原免疫動(dòng)物抗體合適抗原表位間隔臂最佳半抗原統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用量子力學(xué)AM1，得到了磺胺類和玉米赤霉醇類藥物的物化、電性、疏水性等性質(zhì)，從分子水平比較各藥物與半抗原的異同（化學(xué)學(xué)報(bào)，2008，66，2613-2619）。為半抗原合理設(shè)計(jì)提供了方法指導(dǎo)SM2化學(xué)結(jié)構(gòu)SM2最低能量構(gòu)象SM2最高占據(jù)軌道（HOMO）和最低未占據(jù)軌道（LUMO）Table2.Physicalandchemicalindexesofα-zearalanolandanalogsHaptensVSRLogPPμHMWD18-14D18-16α-zearalanol937.37601.8590.381.1634.312.949952.51322.4011.189.37β-zearalanol925.51597.5790.381.1634.310.992254.12322.409.567.99α-zearalenol903.64583.5491.500.9034.123.203352.68320.397.996.47β-zearalenol916.33644.5591.500.9034.124.20850.39320.399.357.21zearalanone909.49593.3189.351.3733.763.4748113.07320.3910.059.33zearalenone905.71603.7490.471.1033.575.6308111.13318.378.106.44Table3.Quantumchemicalindexesofα-zearalanolandanalogsHaptensQO1QO3QO14QO16QO18QC11QC12QC17EHOMOELUMO△Eα-zearalanol-0.4326-0.4929-0.6257-0.6153-0.6187-0.2388-0.3347-0.4067-12.297-1.70610.591β-zearalanol-0.4346-0.4910-0.6262-0.6155-0.6129-0.2374-0.3352-0.4071-11.988-0.88711.101α-zearalenol-0.4753-0.4830-0.6256-0.6132-0.6588-0.0885-0.1590-0.3931-12.252-2.3889.864β-zearalenol-0.4275-0.4938-0.6267-0.6147-0.6223-0.0709-0.1646-0.4037-12.190-2.14810.042zearalanone-0.4088-0.5095-0.6254-0.6117-0.4218-0.2544-0.3338-0.4040-11.722-1.8089.914zearalenone-0.4201-0.5000-0.6295-0.6155-0.4277-0.0919-0.1465-0.4120-11.882-2.5399.343玉米赤霉醇類藥物的結(jié)構(gòu)信息Table4.PearsonCorrelationanalysisformoleculardescriptorsandantibodyrecognitionabilityVHLogPRMWSμ△EQO1QO3QO14QO16QO18QC11QC12QC17D18-14D18-16PersonCorrelation-0.002-0.35-0.540.54-0.100.880.25-0.070.120.07-0.06-0.12-0.280.510.400.05-.001-0.22Sig.(2-tailed)0.9970.490.260.260.840.010.630.880.820.890.900.810.580.290.420.910.980.67ZHWang，JZShen.2009.JournalofMolecularRecognition,submitted.疏水性體積偶極距分子距離電量相關(guān)系數(shù)獲得的分子結(jié)構(gòu)信息，已用于半抗原的合理設(shè)計(jì)單克隆抗體制備過程噬菌體展示抗體庫淘選策略scFv雙特異性單鏈抗體制備策略ScFv1LinkerScFv2BispesificscFvBroad-specificityantibodypCANTAB5E-bispesificscFv磺胺類喹諾酮類識(shí)別磺胺類和喹諾酮類抗體評(píng)價(jià)及指導(dǎo)抗體定向改造CoMFA初步測(cè)定抗體特性3D-QSAR重組抗體Docking獲取獸藥-抗體互作主要力場(chǎng)預(yù)測(cè)抗體三維結(jié)構(gòu)互作模型重組抗體定向改造同源模擬獲取獸藥-抗體互作結(jié)構(gòu)信息推測(cè)獸藥-抗體間發(fā)生作用的氨基酸性質(zhì)推測(cè)獸藥-抗體間發(fā)生作用的氨基酸位點(diǎn)ELISA放射性受體分析法1978年美國波士頓大學(xué)教授Charm發(fā)明受體分析法 CHARMI是專用于牛奶中β一內(nèi)酰胺抗生素殘留檢測(cè)方法，也是美國AOAC承認(rèn)的第一個(gè)快速測(cè)定法，這個(gè)方法非?？焖俸挽`敏，一個(gè)奶牛樣品分析只需15分鐘時(shí)間目前，CHARM被多國政府的農(nóng)業(yè)部和衛(wèi)生部采用作為的標(biāo)準(zhǔn)方法如我國:四環(huán)素類（SN/T2309-2009），β-內(nèi)酰胺類(GB/T21174-2007)，磺胺類(GB/T21173-2007)

細(xì)胞膜上或細(xì)胞內(nèi)能特異識(shí)別生物活性分子并與之結(jié)合，進(jìn)而引起生物學(xué)效應(yīng)的特殊蛋白質(zhì)微孔板檢測(cè)系統(tǒng)基于膜的檢測(cè)系統(tǒng)表面等離子共振傳感器側(cè)流層析技術(shù)免疫滲濾技術(shù)熒光分析系統(tǒng)CHARM原理受體分析法的優(yōu)勢(shì)：可以檢測(cè)同一類抗生素難點(diǎn)：受體的制備檢測(cè)方法的應(yīng)用目的基因的調(diào)取目的蛋白活性鑒定目的蛋白的表達(dá)及純化表達(dá)載體的構(gòu)建基于受體的快速檢測(cè)方法建立檢測(cè)方法的優(yōu)化

青霉素等β-內(nèi)酰胺類抗生素通過與細(xì)菌膜蛋白結(jié)合，抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的生物合成，引起細(xì)菌細(xì)胞死亡從而發(fā)揮殺菌作用的。這種細(xì)菌蛋白被命名為青霉素結(jié)合蛋白(Penicillin-BindingProtein，PBP)2001年發(fā)現(xiàn)了肺炎鏈球菌野生R6株5個(gè)編碼明確的青霉素結(jié)合蛋白的基因，其中PBP2x對(duì)青霉素類和頭孢類抗生素都具有很高的敏感性青霉素結(jié)合蛋白識(shí)別β-內(nèi)酰胺藥物列表基本原理目前常用的主要為ELISA試劑盒。在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)，結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量有一定的比例，加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。

（1）試劑盒3、試劑盒、試紙條研制1、加入待測(cè)物；2、加入抗體；3、加入酶標(biāo)二體；4、加入底物；5、加入終止液目前試劑盒最常用方法為間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，其他還用直接法、夾心法等。優(yōu)點(diǎn)

靈敏度高，特異性強(qiáng)，可進(jìn)行定性和定量測(cè)定檢測(cè)方便、快捷，一般1-2個(gè)小時(shí)就能出結(jié)果對(duì)操作者和實(shí)驗(yàn)室條件要求不高可以用于大量樣本的快速篩選試劑盒組成

96孔酶標(biāo)版樣品稀釋液標(biāo)準(zhǔn)溶液底物溶液終止液酶標(biāo)二抗工作液濃縮洗滌液抗體工作液試劑盒檢測(cè)需要的儀器恒溫?fù)u床離心機(jī)恒溫培養(yǎng)箱渦動(dòng)儀酶標(biāo)分析儀移液槍試劑盒檢測(cè)所需試劑主要用于復(fù)雜樣品（如肌肉、肝臟等）的前處理。大多為常規(guī)有機(jī)或無機(jī)溶劑，1、甲醇2、乙腈3、乙酸乙酯4、磷酸鹽緩沖溶液5、……YP1YP2YP3YP4YP5YP6YP7YP8YP1YP2YP3YP4YP5YP6YP7YP8YP9YP10YP11YP12YP13YP14YP15YP16YP9YP10YP11YP12YP13YP14YP15YP16YP17YP18YP19YP20YP21YP22YP23YP24YP17YP18YP19YP20YP21YP22YP23YP24YP25YP26YP27YP28YP29YP30YP31YP32YP25YP26YP27YP28YP29YP30YP31YP32YP33YP34YP35YP36YP37YP38YP39YP40YP33YP34YP35YP36YP37YP38YP39YP40BZ1BZ2BZ3BZ4BZ5BZ6陽性陰性BZ1BZ2BZ3BZ4BZ5BZ6陽性陰性ABCDEFGH123456789101112由低到高的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線陽性添加樣品孔陰性添加樣品孔實(shí)測(cè)樣品區(qū)，最多可檢測(cè)40個(gè)樣品酶標(biāo)板實(shí)際檢測(cè)布局試劑盒一般操作步驟1、向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液，再加入一抗，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中孵育；2、倒出孔中液體，加入濃縮洗滌液，30s后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作，用吸水紙拍干；3、加入酶標(biāo)二抗，37℃恒溫箱中孵育；4、倒出孔中液體，重復(fù)洗滌步驟；5、加入底物顯色液A液，底物顯色液B液，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫箱避光顯色15min；6、加入終止液，輕輕振蕩混勻；7、用酶標(biāo)儀，測(cè)定每孔吸光度值。以檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)濃度(μg/L)的自然對(duì)數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度(μg/kg)可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計(jì)算出樣本溶液濃度。利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。0102030405060708090100103090270810待測(cè)物濃度（ppb）吸光度（%）1試紙條結(jié)構(gòu)基本原理

采用競(jìng)爭(zhēng)法，樣品滴入后，在層析作用下經(jīng)膠體金標(biāo)記抗體的結(jié)合墊，再流經(jīng)包被抗原和二抗的T線和C線，若樣品中含有藥物，藥物與金標(biāo)抗體結(jié)合后不再與抗原反應(yīng)，T線不顯色；若不含藥物，則金標(biāo)抗體與抗原反應(yīng)，T線顯色；無論有無藥物，二抗與金標(biāo)抗體均反應(yīng)，即C線顯色。（2）試紙條優(yōu)點(diǎn)靈敏度高，特異性強(qiáng)檢測(cè)方便、快捷，一般3-5分鐘就能出結(jié)果幾乎不需要任何儀器設(shè)備可用于大量樣本的快速篩選，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)試紙條組成試紙條的一般檢測(cè)步驟1、樣品前處理對(duì)牛奶、蜂蜜、尿液等樣品，只需進(jìn)行簡單稀釋即可；對(duì)豬肉等樣品，通過提取或加熱處理后，進(jìn)行稀釋；2、取出試紙條，平放到桌面上，用一次性吸管吸取樣品處理液，在加樣孔中加入4滴；3、5min后觀察結(jié)果；4、結(jié)果判定。陰性：C線顯色，T線有顏色，無論顏色深淺均判為陰性。