蛋白純化課件

基因克隆與亞克隆

蛋白質(zhì)表達(dá)與純化

亞克隆技術(shù)步驟獲取目的片斷雙酶切載體和目的片斷純化回收載體和目的片斷連接載體和目的片斷轉(zhuǎn)化E.Coli鑒定獲取目的基因基因組文庫(kù)cDNA文庫(kù)PCR或酶切原核基因真核基因切膠回收和連接回收切下的膠要盡可能小膠的濃度不要太高切膠后進(jìn)行定量和純度分析連接●

載體和目的基因的摩爾比為1：3～10轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)的制備最好從-70oC冰箱里直接取細(xì)菌菌種，或者涂板后挑單菌落，搖細(xì)菌制備一步法轉(zhuǎn)化可以大大節(jié)省時(shí)間一般轉(zhuǎn)化后需要12～16小時(shí)長(zhǎng)成單菌落，時(shí)間太長(zhǎng)容易影響細(xì)菌活性克隆的鑒定PCR或者快速PCR酶切鑒定測(cè)序鑒定上游引物TCAGGACATATGATGGACCAGAAGCTNdeI

GTTAACG

下游引物ACTGAGGGATCCTCAGGTGTGTTTAA

BamHI

AGCTGTT

分子克隆示例引物設(shè)計(jì)重組質(zhì)粒pET28a-gadA瓊脂糖電泳（左）、雙酶切（中）、質(zhì)粒PCR（右）及測(cè)序鑒定測(cè)序重組蛋白可溶性表達(dá)

原理His純化系統(tǒng)是利用His融合蛋白的6,8或10連續(xù)的組氨酸殘基與固定的二價(jià)Ni2+通過(guò)金屬親和吸附，通過(guò)咪唑洗脫的原理來(lái)進(jìn)行純化。1ml樹脂大約可結(jié)合5–8mg融合蛋白，并且可以反復(fù)使用幾次。 The6×Histag在C-或N-末端均可pH8.0分子量小，不干擾目的蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

NTA特點(diǎn)：

NTA(Nitrilotriaceticacid)是一種四配位基的金屬吸收劑

NTA占住Ni2+的四個(gè)位點(diǎn),留下2個(gè)與6×His結(jié)合.試劑IPTG:異丙基硫代-β-D-半乳糖苷8bindingbuffer:40mMimidazole4MNaCl160mMTris-HCl,pH7.98washbuffer:480mMimidazole4MNaCl160mMTris-HCl,pH7.98elutebuffer:4Mimidazole2MNaCl80mMTris-HCl,pH7.9Ni2+-NTAHis?BindResin操作步驟挑一個(gè)克隆至2mlLB液中（Amp+）37℃搖OD600值至0.6左右加此2ml菌至100mlLB中37℃搖OD600值至0.6左右加IPTG至終濃度1mM繼續(xù)搖2～3小時(shí)離心（5000rpm,5min,4℃）懸浮細(xì)菌于10×柱體積的bindingbuffer超聲破碎細(xì)胞離心(12,000rpm,15min,4℃),取上清用濾紙過(guò)濾加0.5mlNi2+-NTAHis?BindResin于層析柱10×柱體積的bindingbuffer洗層析柱樣品過(guò)柱6×柱體積的washbuffer洗層析柱3×柱體積的elutionbuffer洗脫蛋白收集蛋白:0.5ml/管取20l樣品SDS鑒定一、原理GST純化系統(tǒng)是利用GST（glutathione-S-transferase)融合蛋白與固定的谷胱甘肽（GSH）通過(guò)硫鍵共價(jià)親和，通過(guò)GSH交換洗脫的原理來(lái)進(jìn)行純化。1ml樹脂大約可結(jié)合5–8mg融合蛋白，并且可以反復(fù)使用幾次。AmprAmprAmprTotalECV304cellsRNART-PCR(amplificationofAWP1)BamHI/EcoRIBamHI/EcoRIT4DNALigase試劑谷胱甘肽瓊脂糖

IPTG:異丙基硫代-β-D-半乳糖苷Lysisbuffer(50ml):2.5ml1MTris(pH8.0)0.1ml0.5mlEDTA0.292gNaCl0.5mlTritonX-1000.25ml1MDTTElutionbuffer:0.615gglutathione10ml1MTris(pH8.0)90mldistilledwater操作步驟挑一個(gè)克隆至2mlLB液中（Amp+）37℃搖OD600值至0.6左右加此2ml菌至100mlLB中37℃搖OD600值至0.6左右加IPTG至終濃度1mM繼續(xù)搖3～4小時(shí)離心（5000rpm,5min,4℃）懸浮細(xì)菌于10×柱體積的lysisbuffer超聲破碎細(xì)胞離心(12,000rpm,15min,4℃),取上清用濾紙過(guò)濾加0.5ml50%谷胱甘肽瓊脂糖beads于層析柱5×柱體積的lysisbuffer洗層析柱樣品過(guò)柱5×柱體積的lysisbuffer洗層析柱3×柱體積的elutionbuffer洗脫蛋白收集蛋白:0.5ml/管取20l樣品SDS鑒定操作步驟100l(約5g)GST或His融合蛋白被掛到樹脂上加另一種融合蛋白,單獨(dú)GST做對(duì)照時(shí)（約25g)lysis或washingbuffer洗層析柱用elutionbuffer洗脫蛋白用20l洗脫液或樹脂直接上樣行SDS

注意事項(xiàng)：細(xì)菌與蛋白始終保持在低溫操作在buffers中咪唑、鹽離子濃度及pH適當(dāng)細(xì)菌的誘導(dǎo)時(shí)間、溫度及IPTG濃度適當(dāng)最好在每次誘導(dǎo)前，做細(xì)菌的轉(zhuǎn)化SDS－PAGE

電泳SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)部、分子之間以及與其他物質(zhì)分子之間的非共價(jià)鍵，使蛋白質(zhì)變性而改變?cè)械目臻g構(gòu)象分子量越大的蛋白質(zhì)結(jié)合的SDS越多、帶負(fù)電荷也越多，使荷質(zhì)比趨于一致不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物形狀也相似，都呈橢圓狀。因此，在自由電泳時(shí)，它們的泳動(dòng)率基本相同由于凝膠的分子篩效應(yīng)，電泳遷移率就取決于蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物的大小，也可以說(shuō)是取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。原理試劑丙烯酰胺和N，N1－亞甲雙丙烯酰胺。10％SDS用制備分離膠和積層膠的Tris緩沖液。TEMED,催化過(guò)硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合。過(guò)硫酸銨。過(guò)硫酸銨提供驅(qū)動(dòng)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基。Tris－甘氨酸電泳緩沖液。SDS凝膠加樣緩沖液操作過(guò)程SDS聚丙烯酰胺凝膠的灌制樣品處理上樣電泳剝膠染色脫色拍照

注意事項(xiàng)：電泳玻璃板要干凈玻璃板間密封要好上槽液最好用新配制的剝膠要小心作好標(biāo)記常規(guī)ELISA

原理ELISA法是酶免疫技術(shù)中最常用的方法，是將抗原或抗體吸附于固相載體上，使酶免疫放大反應(yīng)在載體上進(jìn)行，即把固相吸附技術(shù)與酶聯(lián)免疫技術(shù)結(jié)合的方法。本實(shí)驗(yàn)以96孔聚苯乙烯板為固相載體的ELISA，可用于單克隆抗體的篩選、激活、血清學(xué)的檢測(cè)及細(xì)胞表面抗原等?；玖鞒虣z測(cè)抗體：間接型ELISA純化抗原包被載體無(wú)關(guān)蛋白封閉待測(cè)樣品酶標(biāo)抗體底物終止反應(yīng)結(jié)果顯示4℃過(guò)夜4℃過(guò)夜,室溫1～2h室溫45min，洗滌室溫45min，洗滌顯色15min，避光檢測(cè)抗原：雙抗體夾心型ELISA純化抗體包被載體無(wú)關(guān)蛋白封閉待測(cè)樣品酶標(biāo)抗體底物終止反應(yīng)結(jié)果顯示材料96孔聚苯乙烯板抗原：GST－AWP1PBS：pH7.4檸檬酸－磷酸緩沖液5.0，0.10mol/L封閉液：含1％BSA及0.05%Tween-20的PBS洗滌液：含0.05%Tween20的PBS酶稀釋液：同封閉液。底物：17mg鄰苯二胺，25lH2O2，50ml檸檬酸－磷酸緩沖液（保存于暗處）。12.5%硫酸兔抗人GST－AWP1抗體（一抗）辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔抗體（二抗）操作步驟以1至10g/ml抗原（在碳酸緩沖液或PBS中）100l/孔鋪板，置4℃過(guò)夜(二人一組，每人4孔）。棄抗原溶液，以1％BSA200l/孔封閉，置4℃過(guò)夜或置37℃至少1至2小時(shí)。棄封閉液，加待測(cè)樣品50l/孔（待測(cè)樣品為抗血清，1：對(duì)照，未免疫血清；2～4：分別為1：500，5000，10000的抗血清），置室溫45分鐘至1小時(shí)。棄待測(cè)樣品，以PB