生物化學(xué)核酸雜交

核酸分子雜交

nucleicacidhybridization

第四章本章內(nèi)容第一節(jié)核酸分子雜交的基本原理第二節(jié)核酸探針第三節(jié)印跡雜交技術(shù)第四節(jié)常用的核酸分子雜交技術(shù)核酸分子雜交的基本原理第一節(jié)

核酸變性核酸復(fù)性核酸雜交

在化學(xué)和物理因素的影響下,維系核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵和堿基堆積力受到破壞,DNA雙螺旋解旋成為單鏈的過程.DNA變性后，理化性質(zhì)和生物活性喪失。一、核酸的變性(denaturation)

物理因素：熱（高溫）

化學(xué)因素：酸、堿；變性劑（如尿素、胍）；有機(jī)溶劑（如乙醇、丙酮）

（一）引起核酸變性的因素：（二）變性溫度（或解鏈溫度，Tm):單鏈DNA的紫外吸收比雙鏈DNA高40%，所以變性導(dǎo)致DNA的紫外吸收增加，稱為增色效應(yīng)（hyperchromiceffect）。在熱變性過程中，增色效應(yīng)達(dá)一半時(shí)即雙螺旋被解開一半時(shí)的溫度稱為解鏈溫度(Tm)。

（1）堿基組成：Tm=69.3+0.41(G+C)%

（2）分子大小:

（3）離子強(qiáng)度：

（3）pH：5～9

（4）變性劑：干擾堿基堆積力和氫鍵的形成，降低Tm值。（三）影響Tm值的因素：變性的DNA兩條互補(bǔ)單鏈,在適當(dāng)條件下重新締合成雙鏈的過程，又叫退火。二、核酸的復(fù)性(renaturation)DNA復(fù)性后，理化性質(zhì)和部分生物活性恢復(fù)。

復(fù)性導(dǎo)致DNA的紫外吸收降低，稱為減色效應(yīng)（hypochromiceffect）。DNA的最適復(fù)性溫度（Tor）比解鏈溫度低20℃

-25℃（1）DNA大?。浩卧叫?，復(fù)性越快；反之亦然。（2）離子強(qiáng)度：增加鹽濃度可加速復(fù)性。（3）DNA濃度：濃度越大，復(fù)性越快。（4）若變性不徹底，復(fù)性很快。（5）序列越簡(jiǎn)單，復(fù)性越快。影響復(fù)性速度的因素DNA的變性和復(fù)性三、核酸分子雜交

(nucleicacidhybridization)

在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)

。

雜交可以發(fā)生在DNA/DNA、DNA/RNA、

RNA/RNA、以及人工合成的寡核苷酸單鏈與

DNA或RNA之間。分子基礎(chǔ)：核酸的變性和復(fù)性雜交可分為：液相雜交和固相雜交液相雜交:

進(jìn)行雜交的核酸都在雜交液中

特點(diǎn):雜交速度快，但誤差較高

固相雜交:

將參加反應(yīng)的核酸先固定在固相支持物上，與雜交液中的游離探針進(jìn)行雜交復(fù)性RNADNA核酸分子雜交

第二節(jié)核酸探針

探針的概念探針的種類和選擇探針的標(biāo)記一、探針(probe)的概念一小段用染料(同位素、生物素或熒光)標(biāo)記的(末端或全鏈)已知序列的多聚核苷酸，與固定在膜(NC、PVDF或尼龍）上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。

簡(jiǎn)言之，探針指已知序列的標(biāo)記核酸片段。二、探針(probe)的種類基因組DNA探針cDNA探針RNA探針人工合成的寡核苷酸探針（ASO）基因組探針：用基因克隆技術(shù)分離獲得的特異的DNA序列。RNA探針：特異DNA序列在體外轉(zhuǎn)錄出的RNA序列。cDNA探針：以特異mRNA序列為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下合成的cDNA序列。寡核苷酸探針（ASO）：人工合成已知序列的寡核苷酸片段。探針種類三、探針的標(biāo)記物（一）放射性同位素標(biāo)記物：

32P、3H、35S

生物素（biotin）地高辛（digoxigenin）

熒光素（

fluorescein）酶（堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶）（二）非放射性標(biāo)記物：四、探針的標(biāo)記方法

酶標(biāo)記法化學(xué)標(biāo)記法

體外標(biāo)記方法：

切口平移法（nicktranslation)

隨機(jī)引物法（randompriming）

DNA的5’末端標(biāo)記

PCR標(biāo)記法

幾種探針標(biāo)記方法：

第三節(jié)印跡雜交技術(shù)

印跡雜交技術(shù)以固相雜交為基礎(chǔ).

印跡雜交技術(shù)是將通過凝膠電泳分離的待測(cè)核酸轉(zhuǎn)移并結(jié)合到固相支持物上，然后與探針進(jìn)行雜交并分析。印跡指將凝膠中的待測(cè)核酸轉(zhuǎn)移到固相膜上。一、固相支持物

硝酸纖維素膜尼龍膜活化濾紙二、印跡方法毛細(xì)管虹吸轉(zhuǎn)移法真空轉(zhuǎn)移法電轉(zhuǎn)移法三、印跡雜交過程

樣品制備

電泳分離

預(yù)雜交

洗膜

分析雜交

印跡第四節(jié)

常用核酸分子雜交技術(shù)

DNA印跡法

RNA印跡法

斑點(diǎn)雜交法

原位雜交

主要用于基因組DNA的定性和定量分析(特定序列定位)，亦可分析重組質(zhì)粒和噬菌體。一、DNA印跡技術(shù)(Southernblotting)

1975年,Southern印跡雜交（Southernblot）由英國人埃德溫·邁勒·薩瑟恩（EdwinMellorSouthern）創(chuàng)建。埃德溫·邁勒·薩瑟恩方法：利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，通過顯色，檢測(cè)特定DNA分子的含量。兩個(gè)主要過程：一是印跡（blotting）二是分子雜交主要步驟:RE酶切待測(cè)DNA瓊脂糖電泳分離待測(cè)DNA片段使DNA變性中和預(yù)雜交雜交放射自顯影結(jié)果分析一、DNA印跡技術(shù)(Southernblotting)DNA的純化、酶切凝膠電泳分離DNA片段DNA變性轉(zhuǎn)膜、固定預(yù)雜交、雜交檢測(cè)分析制備探針Southernblotting的步驟：DNA分子雜交實(shí)驗(yàn)①②③目錄放射自顯影照片

將RNA樣品完全變性，通過瓊脂糖凝膠電泳按分子大小分離，然后轉(zhuǎn)移到固相膜上，固定后與探針進(jìn)行雜交。二、RNA印跡技術(shù)(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。主要用于檢測(cè)某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA的表達(dá)水平，也可以比較不同組織和細(xì)胞中的同一基因的表達(dá)情況。

Northernblotting的步驟制備探針變性、凝膠電泳泡膠，洗去變性劑轉(zhuǎn)膜、固定預(yù)雜交、雜交檢測(cè)分析RNA的純化與DNA印跡的區(qū)別：

DNA印跡是先電泳后變性、轉(zhuǎn)移；

RNA印跡是先變性后電泳、轉(zhuǎn)移，且不能采用堿變性固定直接將樣品點(diǎn)在膜上預(yù)雜交、雜交檢測(cè)分析制備探針三、斑點(diǎn)雜交法(dotblotting)

特點(diǎn):

簡(jiǎn)單,但特異性差.

在細(xì)胞保持基本形態(tài)的情況下將探針注入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交，雜交反應(yīng)在載物片上的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。

四、原位雜交法(insituhybridization)DNA點(diǎn)陣本章重點(diǎn):掌握以下概念:核酸分子雜交;探針;