藥用酶的分類與制備方法

9/9第十一講2008～2009學(xué)年第二學(xué)期授課內(nèi)容第五節(jié)酶類藥物的生產(chǎn)第六節(jié)糖類藥物的生產(chǎn)授課時(shí)數(shù)2教學(xué)目標(biāo)掌握掌握藥用酶的分類、來源和生產(chǎn)方法；糖類藥物的分類、制備方法，以及透明質(zhì)酸生產(chǎn)工藝。教學(xué)重點(diǎn)藥用酶的分類和生產(chǎn)方法；糖類藥物的分類、制備方法。教學(xué)難點(diǎn)藥用酶的分類教材教具教學(xué)內(nèi)容（含教學(xué)步驟、時(shí)刻分配、教法學(xué)法、作業(yè)布置等）導(dǎo)入新課：生物體內(nèi)的各種生化反應(yīng)幾乎差不多上在酶的催化作用下進(jìn)行的，因此酶在生物體的新陳代謝中起著至關(guān)重要的作用。酶的化學(xué)本質(zhì)要緊是蛋白質(zhì)，有少量的核酸具有酶的活性，但酶具有專門的催化功能。Francis1893年第一次發(fā)覺了木瓜蛋白酶的藥用效果。第五節(jié)酶類藥物一、藥用酶的分類及應(yīng)用（按用途分六大類）1、消化酶類作用：水解和消化食物中的成分，如蛋白質(zhì)、糖類和脂類等。作為消化劑能補(bǔ)充內(nèi)源性消化酶的不足，用于治療消化紊亂或促進(jìn)消化。胃蛋白酶、多酶片（蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶）等用于治療消化不良、食欲不振。2、消炎酶類作用：用于外傷、手術(shù)后、關(guān)節(jié)炎、副鼻竇炎等伴有水腫的炎癥，能抑滅細(xì)菌，促進(jìn)滲出液再汲取，達(dá)到消炎的目的。如：溶菌酶、某些蛋白酶和多糖水解酶等。3、與治療心腦血管疾病有關(guān)的酶類作用：血液中存在著相互拮抗的凝血系統(tǒng)和抗凝血系統(tǒng)（纖維蛋白溶解系統(tǒng)）。在生理狀態(tài)下，血液中的凝血酶會(huì)形成微量纖維蛋白，沉著于血管內(nèi)壁，但這些微量的纖維蛋白又不斷地被激活了的纖維蛋白溶解系統(tǒng)所溶解，兩者保持動(dòng)態(tài)平衡，保證了血流暢通。一旦這種平衡被打破，血管腔內(nèi)血液就會(huì)發(fā)生凝固或血液中的某些有形成分相互黏集形成固體塊——血栓。血栓的形成會(huì)引起心、腦、肺等重要器官缺血壞死，需要及時(shí)采取措施消除栓塞。如：尿激酶和纖溶酶（臨床上用于治療血栓）。4、抗腫瘤的酶類作用：1961年Broome發(fā)覺L-天冬酰胺酶具有抗腫瘤的作用。它能分解患者血液中的L-天冬酰胺，抑制需要L-天冬酰胺的腫瘤細(xì)胞的增殖，正常細(xì)胞由于自身能合成天冬酰胺而不受阻礙，從而選擇性地抑制腫瘤，達(dá)到抗腫瘤的目的。如：天冬酰胺酶（抗惡性腫瘤、抗白血病）、神經(jīng)氨酸苷酶（腫瘤免疫治療劑）。5、其他藥用酶解毒：有機(jī)磷解毒酶（用于治療有機(jī)磷農(nóng)藥中毒，緩解中毒癥狀）青霉素酶（能分解青霉素，用于治療青霉素引起的過敏反應(yīng)）抗衰老、抗輻射：超氧化物歧化酶（清除體內(nèi)氧自由基）細(xì)胞色素C（是參與呼吸鏈的一種特不有效的電子傳遞體，是組織缺氧治療的急救和輔助用藥）降血壓、降血脂：彈性蛋白酶防踽齒：葡聚糖酶二、藥用酶制備方法1、直接提取法工藝包括：選材→預(yù)處理→提取→分離→純化。關(guān)鍵：選擇含量豐富的動(dòng)植物原材料重點(diǎn)：工藝簡便、穩(wěn)定、成本低、無污染、收率和酶比活力、適于大規(guī)模生產(chǎn)的提取純化方法。2、微生物發(fā)酵法工藝包括：菌種培養(yǎng)→種子培養(yǎng)→發(fā)酵→發(fā)酵液處理關(guān)鍵：選育高產(chǎn)菌株高產(chǎn)菌株的選育途徑：=1\*GB3①自然界篩選，=2\*GB3②誘變育種，=3\*GB3③基因工程和細(xì)胞工程。3、動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)法如：大蒜細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)來生產(chǎn)超氧化物歧化酶（SOD），利用木瓜細(xì)胞生產(chǎn)木瓜凝乳蛋白酶。三、藥用酶的常用提取純化方法提取方法1、水溶液法=1\*GB3①鹽濃度：稀鹽溶液或緩沖液；一般使用等滲鹽溶液，如0.002～0.005mol/L磷酸鹽緩沖溶液或0.15mol/L氯化鈉溶液。=2\*GB3②溫度：低溫下操作；=3\*GB3③pH：選擇偏離等電點(diǎn)的適當(dāng)pH值。2、有機(jī)溶劑法【針對(duì)與脂類結(jié)合的酶，注意不可引起變性】常用的有機(jī)溶劑：丁醇方法：=1\*GB3①均相法；=2\*GB3②二相法。3、表面活性劑法【一種解構(gòu)蛋白質(zhì)結(jié)合力的方法】純化方法參見蛋白質(zhì)的純化。4、其他【蛋白質(zhì)分離純化中已介紹】利用溶解度、分子結(jié)構(gòu)和大小、電離性質(zhì)、生物功能專一性（親合性）不同的純化方法——鹽析、凝膠層析、親和層析、超速離心等。第六節(jié)糖類藥物的生產(chǎn)糖除了作為能量物質(zhì)以外，依舊重要的信號(hào)分子，細(xì)胞識(shí)不標(biāo)志。一、糖類藥物的類型（按其聚合的程度）1、單糖及其衍生物單糖是糖的最小單位，如葡萄糖、果糖、氨基葡萄糖和維生素C等。衍生物：6-磷酸葡萄糖，1,6-二磷酸果糖，磷酸肌醇等。2、寡糖又稱低聚糖，由2～20個(gè)單糖聚合而成。如蔗糖、麥芽糖、乳糖、乳果糖。3、多糖又稱多聚糖，由20個(gè)以上單糖聚合而成。如香菇多糖、右旋糖酐、甘露聚糖、茯苓多糖等。多糖在細(xì)胞內(nèi)的存在方式有游離型與結(jié)合型兩種。結(jié)合型多糖有糖蛋白、脂多糖。在組織中，粘多糖幾乎沒有例外地與蛋白質(zhì)以共價(jià)結(jié)合。二、多糖的來源1、動(dòng)物多糖來源于動(dòng)物結(jié)締組織、細(xì)胞間質(zhì)。如：肝素（抗凝血的作用）、硫酸軟骨素（防治脈硬化和骨質(zhì)增生）2、植物多糖要緊是一些中草藥多糖。如：黃芪多糖、牛膝多糖、豬苓多糖、枸杞子糖綴（zhuì）合物作用：免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血壓、抗輻射、抗突變、抗凝血、抗血栓等等。3、微生物多糖來源分為：細(xì)菌多糖、真菌多糖和藻類多糖（《本草綱目》中列出專門多的食用菌、食用藻）分泌類型分為：胞內(nèi)多糖和胞外多糖三、多糖的提取、分離純化與鑒定1、提取分離=1\*GB3①水或鹽溶液直接提?。ù蟛糠郑┑虼蟛空扯嗵桥c蛋白質(zhì)結(jié)合于細(xì)胞中，因此需用酶解法或堿解法使糖-蛋白質(zhì)間的結(jié)合鍵斷裂，促使多糖釋放。=2\*GB3②堿解法多糖與蛋白質(zhì)結(jié)合的糖肽鍵對(duì)堿不穩(wěn)定，故可用堿解法使糖與蛋白質(zhì)分開。=3\*GB3③酶解法理想的工具酶是專一性低的、具有廣泛水解作用的蛋白酶。如：鹿茸中酸性多糖采納木瓜蛋白酶消化法提取，收率專門高。2、除雜蛋白（游離蛋白質(zhì)）方法：=1\*GB3①Sevag法（氯仿）；=2\*GB3②三氯乙酸法；=3\*GB3③三氟三氯乙烷法。2、多糖的純化（1）乙醇沉淀法制備粘多糖的最常用手段，分級(jí)沉淀法。（乙醇分部）（2）季胺鹽絡(luò)合法粘多糖與一些陽離子表面活性劑（如：十六烷基三甲基溴化銨CTAB和十六烷基氯化砒啶CPC等）能形成季胺鹽絡(luò)合物。原理：在低離子強(qiáng)度的水溶液中，這些季胺鹽絡(luò)合物不溶解；在離子強(qiáng)度大時(shí)，這種絡(luò)合物能夠解離，溶解，釋放。（3）離子交換層析法粘多糖由于具有酸性基團(tuán)（如糖醛酸和各種硫酸基），在溶液中以聚陰離子形式存在，因而可用陰離子交換劑進(jìn)行交換吸附。吸附時(shí)能夠使用低鹽濃度樣液，洗脫時(shí)能夠逐步提高鹽濃度如梯度洗脫或分步階梯洗脫。（4）其他方法此外，超濾法、凝膠過濾層析法、區(qū)帶電泳法、及金屬絡(luò)合法等在多糖的分離純化中也常采納。3、純度鑒定測(cè)定所得組分是否均一。方法：功能團(tuán)分析、比旋光度、紙色譜、HPLC、高壓電泳等。四、糖類藥物的生理活性多糖是研究最多的糖類藥物。（1）增強(qiáng)機(jī)體免疫力要緊表現(xiàn)為阻礙補(bǔ)體活性，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，激活或提高吞噬細(xì)胞的功能。增強(qiáng)機(jī)體的抗炎、抗氧化和抗衰老作用。（2）抗腫瘤通過增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能而達(dá)到抗癌作用，毒副作用小。（3）抗輻射抗射線的損傷，有抗氧化、防輻射作用。（4）抗凝血肝素是天然抗凝劑。（5）抗病毒多糖能夠提高機(jī)體組織細(xì)胞對(duì)細(xì)菌，原蟲，病毒和真菌感染的抵抗力。（6）其他作用類肝素、硫酸軟骨素、小分子量肝素等具有降血脂、降血膽固醇，抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，用于防治冠心病和動(dòng)脈硬化。促進(jìn)細(xì)胞DNA，蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、生長。四、典型糖類藥物生產(chǎn)實(shí)例透明質(zhì)酸（HA）（一）來源和用途1、來源存在于動(dòng)物的組織細(xì)胞間質(zhì)和某些某些細(xì)菌的莢膜中。原料：雞冠、人臍帶、動(dòng)物眼球。2、用途：高效天然保濕因子，臨床上作為填充劑。（二）結(jié)構(gòu)與性質(zhì)是一種酸性粘多糖，由等量的葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖組成。（三）生產(chǎn)工藝組織提取法細(xì)菌發(fā)酵法組織提取法：雞冠[預(yù)處理]碎塊[提取]酶解液[過濾]濾液[沉淀]冷凍、絞碎蛋白水解酶硅藻土95%乙醇粗品[溶解]溶解液[除雜蛋白]水相[酶解]酶解液[絡(luò)合]0.1MNaClCHCl3鏈酶蛋白酶1%CPC沉淀[解離]解離液[過濾]濾