原代細(xì)胞培養(yǎng)操作鼠胎組織細(xì)胞培養(yǎng)為課件

原代細(xì)胞培養(yǎng)操作（鼠胎組織細(xì)胞培養(yǎng)為例）取材：用頸椎脫位法使孕鼠迅速死亡。把整個孕鼠浸入盛有75％乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消過毒的剪刀在軀干中部環(huán)行剪開皮膚，剖腹取出子宮置于無菌平皿中。用消過毒的剪刀剪開子宮，取出鼠胎，剪去頭、爪，以平衡鹽溶液洗去血污切割：用平衡鹽溶液將取出的組織塊清洗三次，然后用眼科手術(shù)剪刀仔細(xì)將組織反復(fù)剪碎，直到成1mm3左右的小塊，再用平衡鹽溶液清洗，洗到組織塊發(fā)白為止。靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清消化、接種培養(yǎng)：加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍量），與組織塊混勻。置37℃水浴，觀察消化情況（每隔幾分鐘搖動一下試管），靜止，吸去上清，加入5～10ml細(xì)胞培養(yǎng)液，用吸管吹打混勻，移入二個培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng)操作（鼠胎組織細(xì)胞培養(yǎng)為例）取材：用頸椎脫位法使1原代細(xì)胞培養(yǎng)操作(鼠胎組織細(xì)胞培養(yǎng)為課件2細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)注意的幾個問題

1）培養(yǎng)液和培養(yǎng)物的比例：一定濃度的培養(yǎng)液僅能支持一定數(shù)量的細(xì)胞生長，不能盲目增加每單位體積的細(xì)胞濃度。2）PH：初培養(yǎng)pH應(yīng)為7.4，培養(yǎng)過程應(yīng)不低于7.0。3）培養(yǎng)瓶內(nèi)的空間：一般培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液與液面上的空間體積之比為1:10。

細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)注意的幾個問題1）培養(yǎng)液和培養(yǎng)物的比例：一定濃34）容積、深度、表面面積：培養(yǎng)液體積與表面面積的比例為0.2-0.5ml/cm2。需高濃度氧的，在淺的培養(yǎng)液（2mm）中生長較好；需要低濃度氧的。在深的培養(yǎng)液（5mm）中生長較好。5）去除死細(xì)胞6）溫度控制：動物細(xì)胞培養(yǎng)對溫度波動的敏感性很大。溫度低于36.5℃，細(xì)胞生長緩慢；溫度高于37.5℃，細(xì)胞存活力降低。細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)注意的幾個問題

4）容積、深度、表面面積：培養(yǎng)液體積與表面面積的比例為0.24細(xì)胞傳代方法根據(jù)細(xì)胞生長的恃點，傳代方法有3種。1懸浮生長細(xì)胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。2半懸浮生長細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使紉胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。3貼壁生長細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。細(xì)胞傳代方法根據(jù)細(xì)胞生長的恃點，傳代方法有3種。5傳代細(xì)胞培養(yǎng)操作將長成單層的細(xì)胞從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出，在超凈工作臺中倒掉瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，加入少許消化液(以液面蓋住細(xì)胞為宜)，靜置5～10分鐘在倒置鏡下觀察被消化的細(xì)胞，如果細(xì)胞變圓，相互之間不再連接成片，這時應(yīng)立即在超凈臺中將消化液倒掉，加入3～5ml新鮮培養(yǎng)液，吹打，制成細(xì)胞懸液將細(xì)胞懸液吸出2ml左右，加到另一個培養(yǎng)瓶中并向每個瓶中分別加3ml左右培養(yǎng)液，蓋好瓶塞，送回二氧化碳培養(yǎng)箱中，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)傳代細(xì)胞培養(yǎng)操作將長成單層的細(xì)胞從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出，在超6細(xì)胞計數(shù)：

1、將血球計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。

2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。

3、靜置3分鐘。

4、鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計左側(cè)和上方的。然后按下式計算：

細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/4×10000

注意：鏡下偶見由兩個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個細(xì)胞計算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。

細(xì)胞計數(shù)：

1、將血球計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在72．臺盼藍(lán)法活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色；用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力；方法：

1、將細(xì)胞懸液以0.5ml加入試管中；

2、加入0.5ml0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘；

3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片；

4、鏡下取幾個任意視野分別計死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計細(xì)胞活力；

死細(xì)胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。

活力測定可以和細(xì)胞計數(shù)合起來進(jìn)行，但要考慮到染液對原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。

2．臺盼藍(lán)法8MTT比色法操作步驟：

（1）單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；103-104細(xì)胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200微升（96孔培養(yǎng)板每孔容積370微升），37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間（根據(jù)實驗?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時間）；（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3小時；（3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（150微升／孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解；（4）酶標(biāo)儀檢測各孔OD值（檢測波長570納米）。記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞生長曲線。MTT比色法操作步驟：9慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)程序：

當(dāng)溫度在-25℃以上時，1～2℃/min當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時，5～10℃/min當(dāng)溫度達(dá)-100℃時，可迅速放入液氮中簡易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1～2℃的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)程序：10細(xì)胞凍存方法1．預(yù)先配制凍存液：含20%血清培養(yǎng)基，10%DMSO，DMSO液用培養(yǎng)液配好，避免因臨時配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞；2．取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液,用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1×106～5×106細(xì)胞/ml)；3．加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。細(xì)胞凍存方法1．預(yù)先配制凍存液：含20%血清培養(yǎng)基，10%D11細(xì)胞復(fù)蘇方法

（1）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）；（2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上；（3）低速離心10分鐘；（4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。細(xì)胞復(fù)蘇方法（1）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37～312

實驗準(zhǔn)備實驗用品：超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡酶標(biāo)儀、微孔板震蕩器液氮罐自動雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，培養(yǎng)板，凍存管

實驗準(zhǔn)備實驗用品：13壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣電熱干燥箱：干熱消毒（160℃，2小時）。主要用干玻璃器皿消毒濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌超凈工作臺：為細(xì)胞操作提供無菌環(huán)境紫外燈：紫外線消毒。主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒

原代細(xì)胞培養(yǎng)操作(鼠胎組織細(xì)胞培養(yǎng)為課件14玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和沖洗四個步驟清洗后的玻璃器皿干凈透明無油跡不能殘留任何物質(zhì)玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和沖洗四個步驟15浸泡初次使用和培養(yǎng)使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶掉新的初次使用的玻璃器皿，在生產(chǎn)及運輸過程中，玻璃表面帶有大量的干固的灰塵，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對細(xì)胞有害的物質(zhì)等先用自來水簡單刷洗，然后用5％稀鹽酸液浸泡過夜，以中和其中的堿性物質(zhì)再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過的蛋白質(zhì)，干固后不易洗掉用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上浸泡16浸酸：玻璃器皿浸泡到清潔液中清潔液對玻璃器皿無腐蝕作用，而其強氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質(zhì)浸泡時器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面浸泡時間：一般為過夜，不應(yīng)少于6小時配制洗液時應(yīng)注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護(hù)好面部及身體裸露部分配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制溶液應(yīng)選擇塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色

浸酸：17沖洗在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗。使之盡量不留污染或清潔液的殘跡最好用洗滌裝置如用手工操作需流水沖洗十次以上，每次水須灌滿及倒干凈，最好用蒸餾水清洗3-5次，晾干備用沖洗18膠塞的清洗新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應(yīng)先用自來水沖洗，再做常規(guī)處理常規(guī)清洗方法每次用后立即置入水中浸泡，用2%NaOH或洗衣粉煮沸10-20分鐘（以除掉培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)），自來水沖洗，蒸餾水沖洗2-3次，晾干備用膠塞的清洗新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應(yīng)先用自來水沖洗19塑料制品的清洗塑料制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的包裝，打開包裝即可用，多為一次性物品必要時用2%NaOH浸泡過夜，用自來水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30分鐘，最后用自來水和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用塑料制品的清洗塑料制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的包裝，打20完全培養(yǎng)基的組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基80％一95％血清5％一20％碳酸氫鈉2.0g/L青、鏈霉素各100單位／毫升完全培養(yǎng)基的組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基21稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，用少許D-Hanks平衡鹽溶液調(diào)成糊狀，再補足D-Hanks平衡鹽溶液，攪拌混勻，置室溫4小時或冰箱過夜，不斷攪拌振蕩次日，先用濾紙粗濾，再進(jìn)行過濾除菌，分裝入瓶中，-20℃保存?zhèn)溆茫ㄒ悦夥纸馐ВＳ脻舛葹?.25%（0.1%-0.5%）胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH至7.2左右胰蛋白酶溶液配制稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，用少許D-Hanks平衡鹽溶液調(diào)22EDTA·2Na溶液一種化學(xué)螯合劑，對細(xì)胞有一定的離散作用，而且毒性小，價格低廉，使用方便常用工作液濃度為0.02%。

注意：使用EDTA處理細(xì)胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因殘留的EDTA會影響細(xì)胞生長EDTA溶液配制：用D-Hanks’平衡鹽溶液溶解后，高壓蒸汽滅菌，分裝成小瓶，4℃冰箱保存EDTA·2Na溶液一種化學(xué)螯合劑，對細(xì)胞有一定的離散作用23pH調(diào)整液NaHCO3溶液常用濃度為7.5%。配制時用三蒸水溶解后，過濾除菌或高壓滅菌，分裝，4℃保存HEPES（分子量238.31）溶液一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細(xì)胞無毒性主要作用:防止培養(yǎng)基pH迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時要添加HEPES使用終濃度一般為10-50mmol/L常配成1M儲存液：用20ml雙蒸水溶解4.76克HEPES，過濾除菌或高壓滅菌，分裝小瓶，4℃保存。使用時可向100ml培養(yǎng)液中加入2mlHEPES濃縮液，終濃度為20mmol/LpH調(diào)整液NaHCO3溶液24原代細(xì)胞培養(yǎng)操作（鼠胎組織細(xì)胞培養(yǎng)為例）取材：用頸椎脫位法使孕鼠迅速死亡。把整個孕鼠浸入盛有75％乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消過毒的剪刀在軀干中部環(huán)行剪開皮膚，剖腹取出子宮置于無菌平皿中。用消過毒的剪刀剪開子宮，取出鼠胎，剪去頭、爪，以平衡鹽溶液洗去血污切割：用平衡鹽溶液將取出的組織塊清洗三次，然后用眼科手術(shù)剪刀仔細(xì)將組織反復(fù)剪碎，直到成1mm3左右的小塊，再用平衡鹽溶液清洗，洗到組織塊發(fā)白為止。靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清消化、接種培養(yǎng)：加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍量），與組織塊混勻。置37℃水浴，觀察消化情況（每隔幾分鐘搖動一下試管），靜止，吸去上清，加入5～10ml細(xì)胞培養(yǎng)液，用吸管吹打混勻，移入二個培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng)操作（鼠胎組織細(xì)胞培養(yǎng)為例）取材：用頸椎脫位法使25原代細(xì)胞培養(yǎng)操作(鼠胎組織細(xì)胞培養(yǎng)為課件26細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)注意的幾個問題

1）培養(yǎng)液和培養(yǎng)物的比例：一定濃度的培養(yǎng)液僅能支持一定數(shù)量的細(xì)胞生長，不能盲目增加每單位體積的細(xì)胞濃度。2）PH：初培養(yǎng)pH應(yīng)為7.4，培養(yǎng)過程應(yīng)不低于7.0。3）培養(yǎng)瓶內(nèi)的空間：一般培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液與液面上的空間體積之比為1:10。

細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)注意的幾個問題1）培養(yǎng)液和培養(yǎng)物的比例：一定濃274）容積、深度、表面面積：培養(yǎng)液體積與表面面積的比例為0.2-0.5ml/cm2。需高濃度氧的，在淺的培養(yǎng)液（2mm）中生長較好；需要低濃度氧的。在深的培養(yǎng)液（5mm）中生長較好。5）去除死細(xì)胞6）溫度控制：動物細(xì)胞培養(yǎng)對溫度波動的敏感性很大。溫度低于36.5℃，細(xì)胞生長緩慢；溫度高于37.5℃，細(xì)胞存活力降低。細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)注意的幾個問題

4）容積、深度、表面面積：培養(yǎng)液體積與表面面積的比例為0.228細(xì)胞傳代方法根據(jù)細(xì)胞生長的恃點，傳代方法有3種。1懸浮生長細(xì)胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。2半懸浮生長細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使紉胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。3貼壁生長細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。細(xì)胞傳代方法根據(jù)細(xì)胞生長的恃點，傳代方法有3種。29傳代細(xì)胞培養(yǎng)操作將長成單層的細(xì)胞從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出，在超凈工作臺中倒掉瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，加入少許消化液(以液面蓋住細(xì)胞為宜)，靜置5～10分鐘在倒置鏡下觀察被消化的細(xì)胞，如果細(xì)胞變圓，相互之間不再連接成片，這時應(yīng)立即在超凈臺中將消化液倒掉，加入3～5ml新鮮培養(yǎng)液，吹打，制成細(xì)胞懸液將細(xì)胞懸液吸出2ml左右，加到另一個培養(yǎng)瓶中并向每個瓶中分別加3ml左右培養(yǎng)液，蓋好瓶塞，送回二氧化碳培養(yǎng)箱中，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)傳代細(xì)胞培養(yǎng)操作將長成單層的細(xì)胞從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出，在超30細(xì)胞計數(shù)：

1、將血球計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。

2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。

3、靜置3分鐘。

4、鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計左側(cè)和上方的。然后按下式計算：

細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/4×10000

注意：鏡下偶見由兩個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個細(xì)胞計算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。

細(xì)胞計數(shù)：

1、將血球計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在312．臺盼藍(lán)法活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色；用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力；方法：

1、將細(xì)胞懸液以0.5ml加入試管中；

2、加入0.5ml0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘；

3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片；

4、鏡下取幾個任意視野分別計死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計細(xì)胞活力；

死細(xì)胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。

活力測定可以和細(xì)胞計數(shù)合起來進(jìn)行，但要考慮到染液對原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。

2．臺盼藍(lán)法32MTT比色法操作步驟：

（1）單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；103-104細(xì)胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200微升（96孔培養(yǎng)板每孔容積370微升），37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間（根據(jù)實驗?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時間）；（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3小時；（3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（150微升／孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解；（4）酶標(biāo)儀檢測各孔OD值（檢測波長570納米）。記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞生長曲線。MTT比色法操作步驟：33慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)程序：

當(dāng)溫度在-25℃以上時，1～2℃/min當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時，5～10℃/min當(dāng)溫度達(dá)-100℃時，可迅速放入液氮中簡易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1～2℃的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)程序：34細(xì)胞凍存方法1．預(yù)先配制凍存液：含20%血清培養(yǎng)基，10%DMSO，DMSO液用培養(yǎng)液配好，避免因臨時配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞；2．取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液,用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1×106～5×106細(xì)胞/ml)；3．加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。細(xì)胞凍存方法1．預(yù)先配制凍存液：含20%血清培養(yǎng)基，10%D35細(xì)胞復(fù)蘇方法

（1）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）；（2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上；（3）低速離心10分鐘；（4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。細(xì)胞復(fù)蘇方法（1）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37～336

實驗準(zhǔn)備實驗用品：超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡酶標(biāo)儀、微孔板震蕩器液氮罐自動雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，培養(yǎng)板，凍存管

實驗準(zhǔn)備實驗用品：37壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣電熱干燥箱：干熱消毒（160℃，2小時）。主要用干玻璃器皿消毒濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌超凈工作臺：為細(xì)胞操作提供無菌環(huán)境紫外燈：紫外線消毒。主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒

原代細(xì)胞培養(yǎng)操作(鼠胎組織細(xì)胞培養(yǎng)為課件38玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和沖洗四個步驟清洗后的玻璃器皿干凈透明無油跡不能殘留任何物質(zhì)玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和沖洗四個步驟39浸泡初次使用和培養(yǎng)使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶掉新的初次使用的玻璃器皿，在生產(chǎn)及運輸過程中，玻璃表面帶有大量的干固的灰塵，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對細(xì)胞有害的物質(zhì)等先用自來水簡單刷洗，然后用5％稀鹽酸液浸泡過夜，以中和其中的堿性物質(zhì)再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過的蛋白質(zhì)，干固后不易洗掉用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上浸泡40浸酸：玻璃器皿浸泡到清潔液中清潔液對玻璃器皿無腐蝕作用，而其強氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質(zhì)浸泡時器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面浸泡時間：一般為過夜，不應(yīng)少于6小時配制洗液時應(yīng)注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護(hù)好面部及身體裸露部分配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制溶液應(yīng)選擇塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色

浸酸：41沖洗在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗。使之盡量不留污染或清潔液的殘跡最好用洗滌裝置如用手工操作需流水沖洗十次以上，每次水須灌滿及倒干凈，最好用蒸餾水清洗3-5次，晾干備用沖洗42膠塞的清洗新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應(yīng)先用自來水沖洗，再做常規(guī)處理常規(guī)清洗方法每次用后立即置入水中浸泡，用2%NaOH或洗衣粉煮沸10-20分鐘（以除掉培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)），自來水沖洗，蒸餾水沖洗2-3次，晾干備用膠塞的清洗新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應(yīng)先用自來水沖洗43塑料制品的清洗塑料制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的包裝，打開包裝即可用，多為一次性物品必要時用2%NaOH浸泡過夜，用自來水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30分鐘，最后用自來水和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用塑料制品