食品中化學物質(zhì)的反應效果

339/125食品中化學物質(zhì)的生殖和發(fā)育毒性生殖是使種族連續(xù)的各種生理過程的總稱。生殖過程一般是指從配子形成直到胎兒娩出的整個過程，因此具有廣泛的含義，其中包括精子的發(fā)生、卵的形成、配子的釋放、受精、卵裂和胚泡發(fā)育、著床、胚胎發(fā)生、胎兒發(fā)育、分娩。而胎兒的娩出也并不意味著胎兒發(fā)育成熟的終止，從廣義上講還應包括胎兒娩出后的新生兒期、哺乳期、直到性成熟的整個過程。隨著我國人民生活水平提高，醫(yī)療衛(wèi)生條件改善，新生兒死亡率大幅度降低，死因順位也發(fā)生了明顯的變化。1953年先天畸形和先天心臟病死亡占總死亡的9.77％，到1979年已占37.50％，其死因順位也由第四位上升為第一位。1988年衛(wèi)生部公布了自1986年10月至1987年9月在全國29個省、市和自治區(qū)同步進行的出生缺陷的監(jiān)測資料，結(jié)果顯示1243284例圍產(chǎn)兒中，先天畸形有16172例，發(fā)生率為13.07％，其中神經(jīng)管畸形占3404例。按此結(jié)果推算，我國每年有30～40萬嚴峻的先天缺陷兒出生。1973年Wilson綜合了5次國際會議的資料，將人類先天缺陷的成因歸為三大類。即遺傳因素(染色體畸變和基因突變，占25％)，環(huán)境因素(物理因素、宮內(nèi)感染、母體疾病、藥物與環(huán)境化學物質(zhì)，占10％)，和緣故不明的出生缺陷(可能是由于遺傳因素與環(huán)境因素相互作用，占65％)。人們對先天缺陷和環(huán)境關(guān)系的認識是經(jīng)歷了一系列重大人間悲劇后才得到的。1940年澳大利亞發(fā)生風疹大流行，次年嬰兒中流行先天性白內(nèi)障、耳聾、智力不全和先天心臟病。1945年美國在日本廣島和長崎爆炸原子彈，受到核幅射的胎兒出生后患小頭畸形和智力低下，嬰兒一年內(nèi)死亡率達25％。1953年日本水俁灣因氮肥廠排放含汞工業(yè)廢水污染了水體，居民因食用污染的魚類引起甲基汞中毒，兩年后發(fā)覺先天水俁病。1960年前后，英、德、日本等國婦女以反應停(thalidomide)作冷靜劑減輕早孕反應，出生了近萬名短肢畸形兒(海豹畸形)，約占早孕期服藥者新生兒的1／3。1968年秋，日本發(fā)生了因多氯聯(lián)苯污染米糠油引起的中毒事故，中毒孕婦發(fā)生死產(chǎn)、早產(chǎn)和產(chǎn)下“油癥兒”。1961-1970年間，美國在侵越戰(zhàn)爭中使用高于本國農(nóng)用13倍濃度的落葉劑2、4、5-T[含有雜質(zhì)四氯二苯二惡英TCDD(tetra-chlorodibenzo-p-dioxin)]污染了大面積耕地和森林，造成婦女流產(chǎn)和產(chǎn)下患有小頭癥和Down’s綜合征的畸形兒。另有報道工業(yè)發(fā)達的國家和地區(qū)先天缺陷的發(fā)生有增高的趨勢。我國是進展中國家，優(yōu)生優(yōu)育，提高人口素養(yǎng)是我國的差不多國策，因此應將發(fā)達國家已出現(xiàn)的問題引為前車之鑒。從70年代起，我國已開始了對藥品、農(nóng)藥、食品添加劑和環(huán)境污染物的致畸研究，并把致畸試驗、生殖毒性試驗列為新藥、農(nóng)藥、食品及首次進口化學品的安全性毒理學評價的重要組成部分?；瘜W品對生殖發(fā)育的損害不僅與妊娠母體有關(guān)，帶有致畸因子的雄性也會使胎仔發(fā)生畸形。例如給雄鼠經(jīng)口染毒反應停，使之與未染毒的雌鼠交配，引起嚴峻的胎仔畸形。接觸二硫化碳男工的配偶發(fā)生流產(chǎn)，早產(chǎn)或分娩畸胎兒增多。對生殖發(fā)育有害的化學品不僅能作用于妊娠器官形成期，造成形態(tài)畸形，對妊娠前期的阻礙還可發(fā)生不育，對胎期的毒效應，可在出生后觀看到發(fā)育、行為、代謝功能的障礙或子代腫瘤發(fā)生率增高。因此綜合考慮有害環(huán)境因素對母體和父體的阻礙，將形態(tài)致畸與行為致畸結(jié)合起來進行觀看，將生殖毒性和發(fā)育毒性結(jié)合起來進行研究已是進展的趨勢。第一節(jié)生殖毒性與發(fā)育毒性環(huán)境有害因素造成對親代的生殖功能及對子代發(fā)育過程的有害阻礙的作用稱為生殖毒性和發(fā)育毒性。兩者關(guān)系緊密，但不同研究者對其研究的側(cè)重面有所不同，多數(shù)主張對生殖毒性和發(fā)育毒性應有所區(qū)分。一、生殖毒性(reproductivetoxicity)生殖毒性指對雄性和雌性生殖功能或能力的損害和對后代的有害阻礙。生殖毒性既可發(fā)生于妊娠期，也可發(fā)生于妊前期和哺乳期。表現(xiàn)為外源化學物對生殖過程的阻礙，例如生殖器官及內(nèi)分泌系統(tǒng)的變化，對性周期和性行為的阻礙，以及對生育力和妊娠結(jié)局的阻礙等。二、發(fā)育毒性(developmentaltoxicity)發(fā)育毒性指在到達成體之前誘發(fā)的任何有害阻礙，包括在胚期(embryonicperiod)和胎期(fetalperiod)誘發(fā)或顯示的阻礙，以及在出生后誘發(fā)和顯示的阻礙。發(fā)育毒性的要緊表現(xiàn)為：1.發(fā)育生物體死亡(deathofthedevelopingorganism)：指受精卵未發(fā)育即死亡，或胚泡未著床即死亡，或著床后生長發(fā)育到一定時期死亡。早期死亡被汲取或自子宮排出(即自然流產(chǎn))，晚期死亡成為死胎。2.生長改變(alteredgrowth)：即生長遲緩(growthretardation)。能引起胚胎死亡和畸形的毒物多數(shù)能引起生長遲緩。一般認為胎兒的生長發(fā)育指標比正常對比的均值低2個標準差時，即可定為生長遲緩。胎鼠胸骨及枕骨骨化遲緩及低出生體重等是生長遲緩的較敏感指標。生長遲緩造成的局部發(fā)育不全可視為畸形，如腦小畸形和眼小畸形等。3.功能缺陷(functionaldeficiency)：包括器官系統(tǒng)、生化、免疫等功能的變化。功能缺陷往往要在出生后通過相當時刻才能診斷。如聽力或視力異常、行為發(fā)育遲緩等。4.結(jié)構(gòu)異常(structuralabnormality)：指胎兒形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，即畸形。致畸性(teratogenicity)是指化學物在胚胎發(fā)育期間引起永久的結(jié)構(gòu)與功能異常的性質(zhì)。致畸物(teratogen)是指出生前接觸，誘發(fā)永久的結(jié)構(gòu)與功能異常的物質(zhì)。三、生殖與發(fā)育毒性的特點及靶器官生殖與發(fā)育過程包括配子(精子與卵子)的發(fā)育與形成、交配、受精、合子形成與植入、胚胎形成與發(fā)育、分娩等時期。生殖與發(fā)育過程的每個時期所涉及的細胞或器官都可能成為外源化學物毒作用的靶。外源化學物對生殖與發(fā)育過程的損害要緊有以下幾個方面：1.親性腺作用(性腺毒性)某些化學物可作用于性腺，阻礙生殖器官的發(fā)育與性腺成熟，或造成性腺組織病理學改變。例如氯乙烯單體可使睪丸曲細精管萎縮，氯化鎘可引起小鼠卵巢出血，排卵抑制。某些化學物可阻礙配子的發(fā)生、增殖和成熟，使生殖細胞數(shù)量減少，功能減退及突變。例如過量接觸二硫化碳的男工多見性機能減退，表現(xiàn)為性欲下降、陽萎。鉛作業(yè)工人，特不是鉛中毒患者易發(fā)生生殖細胞受損，導致精子數(shù)目減少，精子活動力降低，精子畸變率增加。生殖細胞受損的結(jié)果是不育、流產(chǎn)、死胎、畸胎和其他先天缺陷。生殖細胞突變造成的畸胎與妊娠期內(nèi)接觸毒物的致畸作用不同，前者突變發(fā)生于父體或母體的性細胞中，突變誘發(fā)的畸形可傳給后代。后者突變發(fā)生在胚胎的體細胞中，引起的畸形不具有遺傳性。已知的親性腺毒物有多種，包括固醇類藥物，化療藥物，有機磷和有機氯農(nóng)藥，鎘、鉛、汞和二硫化碳等。2.親胚體作用(胚體毒性embryotoxicity)某些化學物可作用于妊娠早期(即從受孕到胚體形成時期)，對胚體發(fā)育產(chǎn)生損害作用。某些化學物能夠降低胚體對必需營養(yǎng)素的利用度，如EDTA降低胚體對微量元素的利用度，氨基蝶呤降低胚體對葉酸的利用度。當給予母體這些化學物時，可導致與缺乏這些必需營養(yǎng)素相似的胚體毒性。胚體毒性、胎體毒性(fetotoxicity)和胚胎毒性(embryo-fetaltoxicity)是指由出生前接觸引起對孕體的任何有害阻礙時期有關(guān)，而不考慮檢測的時刻。3.親胎盤作用(胎盤毒性placentaltoxicity)某些化學物可對胎盤造成損傷，改變胎盤血流量，降低胎盤對營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運，特異地干擾胎盤功能(如內(nèi)分泌和代謝功能)。例如5-羥色胺使小鼠動、靜脈狹窄，胎盤血流量減少，胎盤轉(zhuǎn)運功能障礙，引起死胎和先天畸形；甲基汞改變?nèi)颂ケP滋養(yǎng)層微絨毛對不能代謝的氨基酸的攝取，而致功能致畸，即先天水俁病?；純簢谰窠?jīng)遲鈍，共濟失調(diào)，步行困難，語言、咀嚼，下咽困難和大發(fā)作性癲癇。除上述外，化學物還可引起胎期毒性，哺乳期毒性(通過乳汁致嬰兒中毒，如鉛中毒)，和通過對中樞神經(jīng)系統(tǒng)及全身機能狀態(tài)的毒作用來阻礙生殖過程。某些化學物還能經(jīng)胎盤致癌(transplacentalcarcinogenesis)即致癌物由母血經(jīng)胎盤進入胚胎，造成胚胎期接觸，引發(fā)后代腫瘤。己烯雌酚(diethylstibestml)是第一個被證明的人類經(jīng)胎盤致癌物(transplacentalcarcinogen)。孕婦孕早期作為保胎藥服用時，女性后代可發(fā)覺陰道透明細胞腺癌(clearcelladenocacinoma)、陰道腺癌(adenosis)及陰道和子宮頸隆起；男性后代可發(fā)生附睪囊腫、睪丸營養(yǎng)性衰竭、睪丸囊性硬結(jié)、小陰莖畸形及精子異常。經(jīng)胎盤致癌的發(fā)育致癌物(developmentalcarcinogen)通過動物實驗已發(fā)覺了40多種。化學物的生殖發(fā)育毒性有兩個顯著的特點：一是生殖過程較機體的其他系統(tǒng)或功能對某些化學物的毒作用更為敏感，在成體系統(tǒng)毒性的未觀看到有害作用的水平(noobservedad-verseeffectlevel，NOAEL)胎兒即可受到阻礙。例如妊娠期接觸過不足以引起腫瘤的低劑量二乙基亞硝胺(diethyllnitrosamine)，仔鼠成年后再次接觸，則腫瘤發(fā)生率增加。二是損害作用不僅表現(xiàn)在接觸化學物質(zhì)的機體本身，還可阻礙其后代。例如母鼠接觸高濃度二硫化碳引起致畸作用，其子一代既使不再接觸二硫化碳，交配后所生的子二代仔鼠也出現(xiàn)與子一代仔鼠幾乎完全相同的畸變類型。第二節(jié)生殖與發(fā)育毒性試驗的目的和實驗設(shè)計的要點評價化學物對生殖和發(fā)育的毒性需要三方面的資料，即環(huán)境流行病學，動物生殖與發(fā)育毒性試驗和操縱的臨床研究。另外體外篩選試驗還可為發(fā)育毒性提供初篩和補充。然而在一些新化學品和藥品開發(fā)初期，顯然不可能得到流行病學方面的資料，也不能直接對人體做臨床研究，首先要靠動物試驗來預測它們對人生殖與發(fā)育的危險。生殖與發(fā)育毒性研究的目的是揭示化學品／藥品對哺乳動物生殖發(fā)育的任何有害阻礙，并將研究的結(jié)果與所有能夠得到的其他藥理學和毒理學資料聯(lián)系起來，以推測對人可能造成的生殖危險。研究應包括成年動物和從受孕到子代性成熟的各個發(fā)育時期接觸受試物。為檢測接觸所致的即發(fā)和遲發(fā)效應，應連續(xù)通過一個完整的生命周期，即從親代受孕到子一代受孕。為清晰地闡述各試驗方案的組合，現(xiàn)將完整的生殖發(fā)育過程細分為如下時期。A時期交配前到受孕：檢查成年雄性和雌性生殖功能，配子的發(fā)育與成熟，交配行為，受精。B時期受孕到著床：檢查成年雌性生殖功能，胚胎著床前發(fā)育、著床。C時期著床到硬腭閉合：檢查成年雌性生殖功能，胎體發(fā)育，要緊器官形成。D時期硬腭閉合到妊娠結(jié)束：檢查成年雌性生殖功能、胎體的發(fā)育與生長，器官的發(fā)育與生長。E時期出生到斷乳：檢查成年雌性生殖功能，新生仔對宮外生活的適應，斷乳前的發(fā)育與生長。F時期斷乳到性成熟：檢查斷乳后的發(fā)育與生長，對獨立生活的適應，達到完全的性功能。以上不同時期的組合能夠構(gòu)成許多可能的測試方案，各個國家和國際機構(gòu)均公布了不同的試驗準則和研究設(shè)計細則。本章介紹ICH準則和我國新藥評價、農(nóng)藥及健康相關(guān)產(chǎn)品安全性評價中推舉的三段生殖毒性試驗，一代和二代(多代)生殖毒性試驗。本章將用如下術(shù)語來描述整個生殖與發(fā)育過程：孕體[conceptus，包括胚體(embryo)和胎體(fetus)]、幼體(仔體pup)、成體(adult)、母體(materal)、父體(paternal)、親代(parentalgenetation)和子代(offspring)。實驗設(shè)計的一般考慮如下：一、動物選擇必須以哺乳動物為實驗對象。一般要求使用與其他毒理學研究中相同的物種與品系，以免必須進行另外的預試驗。原則上實驗動物對受試物的動力學、毒效學及其他有關(guān)參數(shù)應與人最接近，如代謝過程與生物轉(zhuǎn)化應與人相近、胎盤結(jié)構(gòu)與人相似、健康、生育力強、多產(chǎn)、孕期短、自發(fā)畸形率低、價廉、易得和操作方便。實際上沒有一個固定物種可通用于精確模擬人類生殖毒性研究。在毒理學評價程序中，假如借助毒物動力學，藥理學和毒理學的資料，能顯示所選物種是人的生殖毒性實驗的恰當模型，則用一種動物就夠了。首選嚙齒類中的大鼠，因用大鼠獲得的其他實驗結(jié)果有可比性并積存了大量的背景資料。在胚體——胎體毒性研究中，傳統(tǒng)上要求用第二種哺乳動物進行試驗。家兔因其也有較廣泛的背景資料和比大鼠更接近人的代謝類型而作為“非嚙齒類”優(yōu)選使用。在測試多巴胺類興奮劑或降低催乳激素水平的化合物時，大鼠不是一個好的動物模型，因為大鼠需要催乳素來維持早孕，在這種情況時使用家兔可能更好。但家兔孕期長短不定(32～36天)，有時缺乏毒性資料，對某些抗生素和消化道紊亂有易感性，在其他生殖毒性研究中較少用。二、接觸選擇1.劑量劑量選擇應依據(jù)從所有已進行的藥理學、急性和慢性毒性、以及動力學研究中得到的資料。高劑量應該在母體中產(chǎn)生輕度的毒性，如體重增長減少，體重增長速度改變(與擾亂了內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的機理有關(guān))、特異的靶器官毒性、藥理學反應增強(如冷靜、驚厥)、陰道出血、流產(chǎn)等。在研究中，要對所觀看到的效應進行劑量—反應關(guān)系分析時，推舉至少用三個劑量水平和適當?shù)膶Ρ冉M。低劑量不應有任何可歸因于受試物的有害作用。中劑量組應在高、低劑量之間按等比級差定位，應引起最小的毒作用。假如對結(jié)果有懷疑，應增加第四個劑量組，以免劑量間隔過大。實驗結(jié)果應提供最高未觀看到有害作用水平的劑量，否則應對該受試物進行進一步深入的研究。在大多數(shù)情況下，最高限量劑量為1g(kg·d)假如仍未引起血漿和組織濃度增加時，可略微增加染毒劑量。在測試低毒物質(zhì)時，假如劑量達到1g(kg·d)仍不產(chǎn)生胚胎毒性或致畸，則沒有必要進行其他劑量水平的研究。假如在高劑量進行的初步研究中，有明顯的母體毒性的證據(jù)而未顯示對胚胎的有害作用，也沒有必要進行其他劑量水平的研究。2.接觸途徑與頻率應與人的接觸途徑相同，假如采納其他接觸途徑，必須依據(jù)動力學的資料。接觸頻率一般是一日一次，每日在相同時刻染毒，并按體重調(diào)整染毒劑量。3.對比組用與試驗組相同的最大容量的賦形劑。當賦形劑可能有不良阻礙(如減少食物的攝取和利用)或阻礙受試物的作用時，應再設(shè)未處理對比組。第三節(jié)三段生殖毒性試驗用一組試驗研究全部生殖毒性的終點是不可能的，因此在決定適當?shù)牟呗院瓦x擇研究設(shè)計時，應考慮該受試物和其類似物質(zhì)所有可能得到的藥理學、動力學和毒理學資料。對大多數(shù)醫(yī)藥產(chǎn)品來講，三段生殖毒性試驗設(shè)計通常是適當?shù)?。關(guān)鍵因素是各個生殖時期之間不得有間隔，即在三個有關(guān)聯(lián)的時期接觸受試物的時期至少有一天的重迭，并能直接或間接地評價生殖過程的所有時期。三段生殖毒性試驗由生育力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗，胚體——胎體毒性試驗(致畸試驗)和出生前后發(fā)育毒性試驗(圍產(chǎn)期毒性試驗)三部分組成(圖8-1)。三段的劃分是按有害作用誘發(fā)的時期，而不考慮檢測的時刻。圖8-1三段生殖試驗圖解Ⅰ生育力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗Ⅱ胚體一胎體毒性試驗(致畸試驗)Ⅲ出生前后發(fā)育毒性試驗一、生育力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗1.研究目的評價化學物對配子成熟、交配行為、生育力、胚胎著床前和著床的阻礙(包括前述生殖發(fā)育過程A和B時期的評價)。雌性包括對動情期、輸卵管運輸、著床和胚胎著床前時期發(fā)育的阻礙。雄性包括檢測對功能的阻礙(例如性欲、附睪的精子成熟等)。2.動物至少一種，首選大鼠。每性不、每組的動物數(shù)應足以對數(shù)據(jù)進行有意義的解釋。建議每性不、每組16~20窩。3.給藥期應講明交配前染毒時刻的長度并提供依據(jù)。一般采取雄性交配前四周開始重復染毒，直至交配成功。若要保證雌性受孕成功，雄性也可接著染毒，仍同籠至處死。雌性交配前兩周開始染毒(可覆蓋至少兩個完整的動情期)直至著床。交配前雄性染毒期限較以往的規(guī)范變動較大，1981年OECD規(guī)定大鼠至少10周，小鼠8周。然而與雌鼠交配不是檢測對精子發(fā)生阻礙的敏感的方法。實際上沒有一個實例表明受試物對雄性生殖毒性的結(jié)論是僅靠雄鼠連續(xù)給藥8～10周后與雌性交配得出的。精子存活率和形態(tài)學檢查等進一步研究可為在生殖毒性研究觀看到的毒作用提供更敏感的終點。另外，已知阻礙精子發(fā)生的外源化學物幾乎總是阻礙減數(shù)分裂后時期(精子成熟前3～5周)。對雄性性腺組織和器官進行認確實組織病理學檢查(Bouin's液固定，石蠟包埋，睪丸作橫切片，附睪作縱切片，PAS和蘇木精染色)可對雄性生育力和精子發(fā)生阻礙提供有價值的補充信息。因此ICH準則將雄性染毒期縮短為4周，并結(jié)合組織病理學檢測。4.交配及受孕檢查雄大鼠給藥4周，雌大鼠給藥2周后開始同籠。交配期2~3周，交配比例1∶1。實驗程序應能識不出各窩的2個親本，以幸免不正確結(jié)果的分析和解釋。雌性受孕檢查一般靠查陰道涂片(大鼠)或陰栓(小鼠)。陰道涂片上有較多白色分泌物，鏡檢可見有較多有核上皮細胞，則提示雌鼠處于動情前期。大鼠性周期一般為4～5天，小鼠性周期為4天，動情前期向動情期移行多在夜間。人和幾種常用實驗動物早期發(fā)育時刻表8-1。陰栓是雄鼠精囊與凝固腺在雌鼠陰道凝聚而成的白色塊狀物，形似米粒，大鼠陰栓專門易脫落。觀看到陰道涂片上的精子或陰栓即提示受孕，檢出日為孕0天，次日為孕1天，以此推算孕齡。表8-1某些哺乳動物早期發(fā)育的時刻早期發(fā)育的時刻(由排卵起的天數(shù))物種胚胞形成著床器官形成期妊娠長度小鼠3～44～56～1519大鼠3～45～66～1522家兔3～47～86～18～33猴（恒河猴）5～79～1120～45164人5～88～1321～562675.終末處死雌性一般在孕中期第13-15天終止妊娠。雄性在證實交配并受孕成功后處死檢查。6.觀看項目染毒期間觀看雌、雄親代(Po)體征和死亡(至少1次／日)，體重和體重改變(至少2次／周)，攝食量(1次／周)，鏡檢雌性陰道涂片(交配期間1次／天)和其他毒性研究中見到的靶效應。處死時所有成體均作尸體解剖和肉眼觀看，進行所有動物的睪丸、附睪、卵巢和子宮的組織學檢查，附睪或睪丸中的精子計數(shù)以及精子存活力測定。檢查計數(shù)雌性的黃體數(shù)，著床數(shù)，汲取胎，死胎和活胎數(shù)。保存肉眼發(fā)覺改變的臟器，以便進行可能的組織學評價，并保存足夠的對比組的相應臟器，以供比較。對明顯未孕的大鼠或小鼠(而不是對家兔)，可用硫化銨子宮染色鑒不胚胎著床前死亡。7.結(jié)果評定綜合對F0代觀看的各項指標和參數(shù)，用合適的統(tǒng)計方法分析和評價。在分析對胎體(子一代，F(xiàn)1)的阻礙時，應考慮下述參數(shù)：各組受阻礙的窩數(shù)比；每窩受阻礙的胎體的組平均百分率；受阻礙胎體總數(shù)比。在對生殖與發(fā)育毒性的試驗結(jié)果進行推理統(tǒng)計(顯著性檢驗)時，應以窩(litter)[在兩種性不均被處理時，以交配的雙方(matingpair)]；在兩代生殖毒性試驗中，以親代交配的雙方，而不是以胎體或新生仔為比較的試驗單位。二、胚體—胎體毒性試驗(致畸試驗)1.研究目的評價母體自胚泡著床到硬腭閉合期間接觸受試物對妊娠雌性和對胚體—胎體發(fā)育的有害阻礙，即前述生殖發(fā)育過程中的C和D時期，要緊包括增強了與非妊娠雌性有關(guān)的毒性，胚體—胎體死亡、生長改變與結(jié)構(gòu)異常。2.動物通常用兩種，一種是嚙齒類，首選大鼠，另一種是非嚙齒類，最好是兔。若僅用一種動物，需提出正當理由。每組動物數(shù)應足以對數(shù)據(jù)進行有意義的解釋。建議每組16~20窩。雌性宜用性成熟的，未交配過的動物。3.給藥期從著床期到硬腭閉合，即器官形成期，大、小鼠孕期的第6~15天，兔孕期的6～18天。致畸實驗日程見表8-2。表8-2致畸試驗日程大鼠小鼠兔交配90～120日齡60～90日齡成年末交配過的染毒時刻孕第6～15日孕第6～15日孕期6～18日齡處死取胎孕第20日孕第18日孕第29日致畸試驗除陰性對比外、應設(shè)陽性對比組。陽性對比大、小鼠可用乙酰水楊酸或濃縮魚肝油，家兔可用6-氨基煙酰胺。陰性與陽性對比組的作用分不是為自發(fā)畸形的發(fā)生和該批實驗動物在試驗條件下的敏感性提供資料。差不多進行過致畸試驗并確知所用試驗動物有陽性結(jié)果的實驗室，可略去陽性對比。4.終末處死與標本制作在分娩前一天處死懷孕母體，以防止自然分娩后，母體吞食畸形子。剖腹檢查親代受孕情況和胎體發(fā)育。除逐個檢查所有胎體的存活和畸形外，尚需分不檢查軟組織和骨骼的異常。將每窩50％胎仔經(jīng)茜素紅染色后，作骨骼檢查。另外50％胎檢查軟組織改變時(對家兔胎體檢查的最好方法)，100％的家兔胎體均作軟組織和骨骼檢查。5.觀看項目染毒期觀看妊娠動物的體征和死亡(1次／日)，體重和體重改變(2次／周)，攝食量(1次／周)和在其他毒性研究中已證實的重要靶效應。有流產(chǎn)和早產(chǎn)征兆者處死并進行肉眼檢查。處死時對所有妊娠動物進行尸體解剖和肉眼檢查任何結(jié)構(gòu)異?；虿±砀淖儭１４嫒庋郯l(fā)覺有改變的臟器，以便進行組織學評價，亦保存足夠的對比組的相應臟器，以供比較。取出子宮，稱帶有胎體的子宮重，以得出妊娠雌性動物的凈增重。計數(shù)黃體數(shù)，汲取胎數(shù)，活胎數(shù)與死胎數(shù)及著床點，稱胎盤重并作肉眼評價，必要時可作組織學檢查。稱活胎體重，檢查胎體性不，以及外觀、內(nèi)臟和骨骼畸形。6.結(jié)果評定致畸研究的發(fā)覺應依照觀看到的效應和產(chǎn)生效應的劑量水平進行評價。有必要考慮所用試驗動物的物種／品系的歷史的致畸性資料。致畸研究進行適當，應提供一個符合要求的NOAEL(未觀看到有害作用水平)的可能。盡管將實驗結(jié)果外推到人的可靠性有限，然而NOAEL的建立，使得能以采取適當?shù)陌踩禂?shù)。對母體的終點評價指標包括：體重、體重變化、食物消耗量和母體毒性體征及母體畸胎出現(xiàn)率等。對胎體阻礙的評價應包括：受阻礙的窩數(shù)比、每窩受阻礙胎體數(shù)的組間均數(shù)、受阻礙的胎體總數(shù)比、畸胎率和某單項畸胎率等。7.阻礙致畸作用的因素致畸作用受多種因素阻礙，要緊包括敏感期、遺傳類型、劑量和母體毒性等。(1)致畸敏感期實驗證明器官形成期(organogenesisperiod)是發(fā)生形態(tài)結(jié)構(gòu)畸形(malformation)的關(guān)鍵期(criticalperiod)。迅速改變細胞分裂速度對畸形發(fā)生是極為重要的，因為增加復制速度即增強了突變的可能性。器官形成期正是細胞分裂極旺盛的時期。例如發(fā)育中的大鼠在妊娠第8～10天之間，有10次細胞有絲分裂，產(chǎn)生N×210新細胞(N表示器官形成期開始時的細胞數(shù))。人的器官形成期在人妊娠的第3～8周。60年代反應停藥物致畸事件就在人懷孕后的20～35天內(nèi)，在無一般毒性的“安全劑量”[1mg／(1g·d)]下發(fā)生的，有人甚至在這時期內(nèi)只服過一次藥。大多數(shù)器官又都有其對致畸作用的專門敏感期，即“靶窗(targetwindows)”。形態(tài)畸形和功能缺陷的敏感期也不同。致畸實驗的染毒時刻，必須安排在器官形成期，才有可能觀看到形態(tài)畸形的致畸效應。由于各物種妊娠期長短不同，敏感期的長短也不同，致畸試驗的染毒時刻需隨動物種屬而易。圖8-2表示人、大鼠和家兔的致畸作用關(guān)鍵期的比較，并圖解狹窄的“靶窗”概念。(2)遺傳類型致畸作用存在明顯的物種差異，這種差異是因代謝變化、胎盤種類、胚胎發(fā)育的速度和方式引起的。致畸物各有其易感物種和品系，易感性取決于機體的基因型。推測化學物生物轉(zhuǎn)化成活性中間產(chǎn)物的速度和途徑與遺傳因子有關(guān)，而畸形僅發(fā)生在那些形成恰當代謝物的物種中。反應停是其中一例。反應停4000mg／kg對大鼠和小鼠尚不致畸，而對人0.5～1.0mg／kg就有極強的致畸作用，這是由于人、猴和兔能將其代謝產(chǎn)生一個中間產(chǎn)物(可能是一個極性的代謝物，或一個anene氧化物)，而其他物種不產(chǎn)生。因此一個化學物在某些物種中是致畸的，在其他物種中產(chǎn)生專門小或不產(chǎn)生阻礙，或是一個物種產(chǎn)生的畸形，可完全不同于在另一個物種中誘發(fā)的畸形。因此在篩選致畸物時，強調(diào)采納包括非嚙齒類在內(nèi)的兩種動物中進行試驗，能夠減少因動物不敏感而出現(xiàn)的假陰性。(3)死亡的劑量只差2～4倍。如給孕小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺5～10mg，未見畸形發(fā)生，而40mg／kg即可引起胚胎100％死亡。從最大未觀看到有害作用劑量到胚胎死亡劑量間的劑量帶，稱為致畸帶。致畸帶越寬的致畸物，致畸危險性越大。掌握致畸作用中劑量—反應關(guān)系的規(guī)律，對致畸實驗中適當劑量的確定具有重要意義。劑量過低，不足以顯示確實存在的致畸作用。劑量過高，引起大量胚胎死亡，畸胎數(shù)減少，或?qū)δ阁w毒作用過強，不能辨明是致畸物的作用，依舊母體毒性的繼發(fā)作用，均阻礙結(jié)果的正確推斷。圖8-2人、大鼠和家兔的致畸作用關(guān)鍵期的比較，短線表示“靶窗”(4)其他因素化學物的理化性質(zhì)與致畸作用有關(guān)。若外來化學物或其代謝產(chǎn)物的分子量小、極性小、高脂溶性、未與母體血漿蛋白結(jié)合，則易穿透胚盤屏障，到達胚胎體內(nèi)。染毒途徑也阻礙致畸試驗結(jié)果，大鼠受孕第7～14天經(jīng)口給以EDTA，引起70％胎鼠畸形，但以同樣劑量皮下注射，對母體毒性增加，卻未見明顯的胎鼠畸形。同樣是經(jīng)口染毒，灌胃和經(jīng)飼料、飲水染毒在動力學也有差不。如苯菌靈(Benomyl)灌胃染毒致畸，而經(jīng)飼料染毒則否。反應停對大鼠灌胃結(jié)果為陰性，而經(jīng)飼料染毒幾乎全部胚胎致死。母體狀況也是阻礙致畸作用的重要因素，見下。8.母體毒性與致畸的關(guān)系母體毒性是指對懷孕母體的特異的(直接的作用)或非特異的(間接的作用)的有害阻礙。在致畸試驗中，劑量選擇應幸免用誘發(fā)母體毒性的劑量，因為若懷孕母體中毒，而不能正常進食，由營養(yǎng)缺乏對胎兒產(chǎn)生的阻礙可能比化學物本身的阻礙還大。例如羥基脲染毒引起懷孕家兔子宮血流量降低，出現(xiàn)胚胎毒性。二氟尼柳(Diflunisal)引起孕兔溶血性貧血，嚴峻時伴發(fā)孕體中軸骨骼畸形。己酰唑胺誘導小鼠胎體畸形明顯地與母體血內(nèi)碳酸過多和血鉀過少有關(guān)。苯妥因?qū)π∈蟮闹禄钥赡芾^發(fā)于母體心率降低，組織內(nèi)氧分壓降低。但胚胎毒性并不是任何時候差不多上繼發(fā)的、與母體毒性同時發(fā)生的，通常二者間專門難建立因果關(guān)系。為證明胚胎毒性是繼發(fā)于母體毒性的一個專門的參數(shù)，必須顯示所有胚胎毒性的母體也有母體毒性，以及對此發(fā)育阻礙的嚴峻性和發(fā)生率與母體毒性相關(guān)。一般認為胚胎死亡和生長遲緩是母體中毒劑量水平引起的胚胎毒性表現(xiàn)，但先天畸形是否繼發(fā)于母體毒性還有爭論，1984年Khera提出各種化學物質(zhì)的母體毒性和致畸作用之間有三種關(guān)系：①母體毒性不伴致畸作用；②母體毒性伴有包括腭裂在內(nèi)的多種畸形譜；③母體毒性伴有特征性的畸形譜。推斷第二類化學物質(zhì)的致畸性是專門困難的。腭裂是小鼠在妊娠期禁食和禁水誘發(fā)的最要緊的畸形。但也是多種致畸物如糖皮質(zhì)類固醇在不引起母體毒性的劑量水平特異性誘發(fā)的畸形。為了區(qū)不腭裂是由于化學物質(zhì)對胚胎的致畸作用依舊繼發(fā)于母體毒性的非特異毒性作用，就需要觀看飼料和飲水消耗量，母體體重及母體內(nèi)穩(wěn)態(tài)改變(即組織病理學，腎和肝功能異常，血液學改變，藥理作用及其他可能的毒作用)。第三類化學物質(zhì)引起的特征性畸形包括露腦，開眼，融合肋，缺肋，多肋及胸骨節(jié)融合或雜亂。這些缺陷的嚴峻性和發(fā)生率與母體毒性直接相關(guān)，無母體毒性的劑量水平則無或罕見。Khera認為這些缺陷是由于母體毒性，并不反映化學物質(zhì)的致畸性。但大多數(shù)學者認為母體毒性可能引起肋骨和胸骨的微小變異，但可不能引起露腦及開眼等重要畸形。9.致畸物及發(fā)育毒物的危險度評定由于致畸作用的機理尚未充分闡明，因此致畸物危險度評定方法也沒有完全統(tǒng)一。本章只介紹三種方法，供實際工作中參考。(1)致畸指數(shù)推斷致畸指數(shù)：母體LD50／胎體最小致畸劑量通過致畸指數(shù)能夠推斷致畸帶的寬窄和致畸性的強弱。致畸指數(shù)小于10為一般不致畸，致畸指數(shù)10~100為致畸，大于100為強致畸。(2)化學物致畸潛力分類和安全系數(shù)確定依照動物試驗中發(fā)育毒性效應的類型、嚴峻性和發(fā)生率將化學物分為四類，并規(guī)定各類型的不同的安全系數(shù)范圍(表8-3)，用以評定待測物發(fā)育毒性的危險度。表8-3致畸化學物的分類基準A類B類C類D類1.最小母體中毒劑量與最小致畸劑量之比值遠大于1大于1或兩劑量間有專門大重疊小于1母體中毒時無致畸2.畸胎率高，與劑量有關(guān)高，與劑量有關(guān)低，但與劑量有關(guān)3.較低劑量時畸形的類型有特定的器官系統(tǒng)一般為多發(fā)性，也可能有特定的特點無特異性，廣泛多發(fā)4.靶細胞特定細胞特定細胞泛化、非特定細胞不詳5.安全系數(shù)范圍～400～300～250～100國際生命科學院(InternationalLifeSciencesInstitute，ILSI)1989年提出(3)ICH人類用藥危險度分類研究設(shè)計中規(guī)定，一旦一種新藥被批準，就要依照動物發(fā)育毒性的研究結(jié)果和從人類使用經(jīng)驗得到的信息(但通常得不到)，將該藥品在妊娠用藥類不中定位(共5類)，并要求大夫在開處方時遵守，以使懷孕婦女按規(guī)定使用這些藥品。妊娠用藥類不見表8-4。表8-4妊娠期用藥類型人群研究結(jié)果動物實驗結(jié)果+－無可用資料+X或DX或DX或D－BAA或B無可用資料ClBC2A、B、C2：僅在假如明顯地需要時，在懷孕期間可使用。C1：僅在假如證明可能的效益與對胎兒的可能的危險比較是可取時，在懷孕期間可使用。D：假如在懷孕期間使用，應通知病人對胎兒可能的危害。X：在懷孕或可能懷孕的婦女中禁止使用。⑷依照動物試驗人群調(diào)查資料對致畸物分級，這是由歐共體（EEC）和經(jīng)濟與進展組織（OECD）所建議。表8-5致畸物的參考分級標準級不分級依據(jù)對人類危險性1已確定人類母體接觸后可引起子代先天性缺陷子已證實對人致畸2A對動物確信致畸，但對人類致畸作用尚未確定因果關(guān)系對人可能致畸2B動物試驗結(jié)果確信致畸，但無人類致畸資料對人可能致畸3尚無結(jié)論性確信致畸證據(jù)或資料不足能夠認為對人無致畸作用，但應接著研究，4動物試驗陰性，人群調(diào)查結(jié)果未發(fā)覺致畸對人無致畸作用10.確認人類致畸物的標準盡管外源化學物在動物試驗中陽性致畸物的比率專門高，但確認的人類致畸物還比較少。由于沒有完全適合的動物模型，在確認人類新的致畸物時，不能把動物實驗的結(jié)果輕易外推到人，還必須結(jié)合環(huán)境流行病學和有操縱的臨床研究的結(jié)果進行評價。Wilson提出的確認人類新的致畸物的標準如下：(1)一種專門的缺陷或幾種缺陷并發(fā)(綜合征)的頻率突然增加。(2)缺陷的增加與某種已知的環(huán)境改變，如一種新藥的廣泛使用巧合。(3)已知在妊娠的專門時期接觸環(huán)境的改變，產(chǎn)生有特征性缺陷的綜合征。(4)缺少妊娠時引起特征性缺陷嬰兒產(chǎn)生的其他一般因子。確認的人類致畸物見表8-6。表8-6已知的人類致畸物電離輻射放射治療放射性碘原子武器感染風疹巨細胞病毒感染單純性皰疹梅毒弓形體病代謝失調(diào)克汀病糖尿病苯丙酮酸尿男性化腫瘤高溫藥物和化學品反應停Abameetin酒精氨基蝶呤雄性激素麻醉劑抗甲狀腺藥物白消安咖啡因氯代聯(lián)苯類香豆素抗凝劑環(huán)磷酰胺二已基乙烯雌酚敵螨普三氟氯溴乙烷異維A酸鋰甲巰咪唑有機汞化合物有機溶劑類苯妥因腐霉利四環(huán)素三甲惡唑烷二酮丙(基)戊酸三、出生前和出生后發(fā)育毒性試驗(圍生期毒性試驗)1.研究目的評價母體自著床至斷乳期間接觸化學物對妊娠／哺乳母體和對孕體及代發(fā)育直至成熟的有害阻礙(前述生殖過程的C-F時期)。在此期間引起的毒性反應會延遲發(fā)生，故觀看應接著到性成熟。有害阻礙要緊包括增加與未妊娠雌性有關(guān)的毒性，子代出生前和出生后死亡，生長與發(fā)育的改變，子代中的功能缺陷(包括行為，青春期性成熟)和生殖(Fl代)。2.動物至少一種，首選大鼠。每性不、每組動物數(shù)應足以對數(shù)據(jù)進行有意義的解釋。建議每組16-20窩。3.染毒期雌性從著床至哺乳期終止。4.實驗程序及終末處死同意分娩和撫養(yǎng)子代到斷乳。子代出生當天被定為出生后0天。在斷乳時，每窩可選出部分雄性和雌性子代撫育到成熟并交配。有些實驗室將親代(F0)動物分組，分不或聯(lián)合進行行為試驗和生殖功能評價。親代于Fl代斷乳時處死。Fl代動物處死日齡以及窩大小尚未標準化，因?qū)嶒炇叶悺Ｓ行嶒炇以贔1代出生0，3或4天調(diào)整窩大小，剔除多余仔鼠(每窩8只，盡可能雌雄各半)，并在出生第21天或斷乳時陸續(xù)處死。評價生殖能力的F1代要在雄／雌同籠，子二代(F2)出生后處死。5.觀看項目染毒期間觀看親代體征和死亡(至少1次／日)、體重、體重增長(至少2次／周)和在往常毒性研究中見到的有評價價值的靶效應、妊娠的長度、分娩。處死時對所有親代和Fl代成體進行尸解，肉眼檢查任何存在的結(jié)構(gòu)異?；虿±砀淖?，特不要注意生殖系統(tǒng)的器官，保存發(fā)覺改變的臟器和進行可能的組織學評價，并保存足夠?qū)Ρ冉M的相應臟器，以供比較。檢查著床數(shù)，對明顯未孕大鼠或小鼠(但不是家兔)可用硫化銨染色以證實胚胎著床前死亡。子代需檢查每窩出生時活仔數(shù)、死仔數(shù)、畸形數(shù)、出生時和斷乳前后存活率、體重、身長、軀體發(fā)育、性成熟和生育力、感受功能、反射和行為等。軀體發(fā)育和最好指標是體重。斷奶前還包括張耳、開眼、出毛、出牙。斷乳后包括表明性成熟開始的雌性陰道張開和雄性龜頭包皮分開。建議在達標時記錄體重，以辨不與對比的任何差異是特異的，依舊與一般生長有關(guān)。功能試驗目前未規(guī)定專門的試驗方法，鼓舞對感受功能、反射、運動能力、學習和經(jīng)歷的檢測方法進行探究。現(xiàn)將部分常用的神經(jīng)行為功能試驗介紹如下(表8-7)，以供參考。表8-7哺乳動物神經(jīng)功能試驗項目參數(shù)研究方法平面翻正(出生后4和7天)負向地性(出生后4和7天)將子鼠頭朝下放在一個30傾斜的面板上，測它們調(diào)轉(zhuǎn)自身，成為頭朝上位置所需的時刻。懸崖躲避(出生后7天)將子鼠放置和定位于高于桌面10cm的平臺上，使其前肢和口鼻部均處于平臺邊緣一條假想線的某一點上，記錄其向后退所需的時刻。游泳行為(出生后4和14天)將子鼠放在水溫23℃的水槽中，游泳行為是對方向(直線，環(huán)形，漂移)，頭出水面的角度(耳露出水面，半個耳出水面，鼻和頭頂出水面，不能保持頭向上)肢的運動(四肢，后肢)的評定。嗅覺定向(出生后14天)將仔鼠放在兩個相連盒的連接臂中，一間盒中放有未用過的木屑，另一個放于鼠用過的木屑(家)，測動物發(fā)覺“家”所需的時刻。6.結(jié)果評定綜合親代(F0)和子代(F1)各項指標觀看的結(jié)果，對圍產(chǎn)期給藥的毒性及阻礙程度做出綜合評價。一代和多代生殖試驗一些外源性化學物如食品添加劑、農(nóng)藥以及環(huán)境污染物等人類反復接觸，與僅在患病期間使用的藥品不同，欲查明其對生殖有關(guān)的阻礙，僅做三段生殖毒性試驗是不夠的，應進行多代生殖試驗。除了家兔的胚體—胎體發(fā)育試驗外，上述各段試驗均可聯(lián)合成一代或多代研究以代替分的。一、一代生殖毒性試驗一代生殖毒性試驗是指僅親代(F0代)動物直接接觸受試物，仔一代(F1)將在母體子宮內(nèi)及經(jīng)哺乳接觸受試物。例如將生育力研究和出生前后研究的染毒期合并，雄性在交配前4周，雌性在交配前15天直至斷乳接觸受試物，就構(gòu)成了一個典型的一代生殖毒性研究(即A-E時期的評價)(圖8-3)。假如在這種研究中包括胚體-胎體期檢查，部分孕鼠在分娩前一天處死，進行胎鼠形態(tài)與結(jié)構(gòu)檢查，另一部分正常分娩和接著接觸毒物至斷乳和對子代進行生化，生理或行為的評價，并在足夠高的接觸劑量得到清晰的陰性結(jié)果，則沒有必要在嚙齒類中，進行進一步研究，但希望提供另一種動物進行胚體-胎體發(fā)育毒性的結(jié)果。圖8-3一代生殖毒性試驗圖解圖8-3一代生殖毒性試驗圖解二、兩代(多代)生殖毒性試驗兩代生殖毒性試驗是指僅對兩代動物成體進行染毒，即F0代直接接觸受試物，F(xiàn)1代既有直接接觸，也有通過母體的間接接觸，第三代動物(子二代，F(xiàn)2)將在子宮和經(jīng)哺乳接觸受試物。三代及多代的研究也照此規(guī)定類推。實驗程序：F0代雄性于交配前4周接觸受試物，雌性于交配前兩周接觸受試物并連續(xù)至哺乳期，以便FlA代經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運和經(jīng)乳汁接觸受試物，F(xiàn)lA代在斷乳時處死、尸體解剖并檢查出現(xiàn)的異常與畸形。斷乳后的兩周，仍然接觸受試物的F0代雌鼠再生殖產(chǎn)生第2窩F1B代。FlB代斷乳后，隨機選出部分F1B進行進一步生殖毒性研究。即FlB代在同一周齡同意同一劑量受試物，生殖并開始下一個周期，產(chǎn)生F2A代。F2A代斷乳時處死，檢查。F1B代再生殖，產(chǎn)生第二窩F2B代。如此提供了不斷接觸受試物的子代來源和開始下一代F3A和F3B。圖8—4表示三代生殖試驗(圖8—4)。圖8-4多代（含三代）生殖毒性試驗圖解結(jié)果評定：應依據(jù)觀看到的毒效應，尸檢和鏡檢的結(jié)果對生殖毒性研究的發(fā)覺進行評價。評價應包括受試物的劑量與包括生育力、體征、體重改變、死亡數(shù)和其他毒效應在內(nèi)的異常是否存在及其嚴峻性之間的關(guān)系。生殖毒性試驗進行適當，應提供NOAEL的良好可能和對生殖、分娩、哺乳和出生后生長等的了解。多代生殖毒性試驗可看作對處于生殖期動物的毒性篩選試驗，盡管它強調(diào)的是檢測針對生殖的阻礙，但對檢測作為與生殖和發(fā)育有關(guān)的生理變化的結(jié)果而發(fā)生的一般毒效的增強也是有用的。多代生殖毒性試驗的要緊優(yōu)點是能檢測對生殖的間接或直接的范圍廣泛的毒作用。這種能力是由于生殖過程的復雜性，以致于孤立看時難以確認的微小毒作用可聯(lián)合或級聯(lián)(cascade)，以在更遠的終點(如窩重)產(chǎn)生一個更顯著的偏移。交配前期間的觀看為評價隨后的觀看提供了背景資料；在交配期間初期的觀看可確定性欲缺乏或激素(動情)周期的紊亂；在這以后得到的資料表明生殖力、生育力、出生前的毒性、分娩、哺乳、斷乳和子代出生后的生長和發(fā)育、青春期至性成熟的毒效應。在生殖毒性試驗中交叉交配(即未處理的雄性與處理的雌性交配，或反之)可能也是需要的，以查明不育配偶的性不。一旦確定不育性不后，生殖系統(tǒng)的組織病理學檢查能夠提供表明毒效應種類的報告。還能夠進行血液中激素水平的測定。出生后仔鼠的生長速度和存活率受多種因素的阻礙，包括母體一般飼養(yǎng)、宮內(nèi)開始的效應、母體哺乳減少、乳汁中存在毒物。當出現(xiàn)仔鼠死亡或體重增長降低時，首先應對死亡仔鼠進行組織病理學檢查。假如哺乳受到阻礙，應進行交叉撫養(yǎng)研究，即處理母鼠的仔鼠由未處理的母鼠撫養(yǎng)，或反之。生殖和毒性的檢測方法一、雄性生殖毒性實驗雄性生殖器官產(chǎn)生精子，精子是一種高度分化的細胞，它不僅把父親的遺傳信息傳遞給卵子，它又可決定新生后代的性不。精子的發(fā)生是指精原細胞發(fā)育成為成熟精子的過程。自胎兒期以來，精原細胞在曲細精管中是休止著的，到了青春期數(shù)量開始增多。曲細精管基底膜上的精原細胞在性成熟期間不斷分裂，同時產(chǎn)生初級精母細胞，通過減數(shù)分裂，形成兩個單倍體的次級精母細胞，再經(jīng)等數(shù)分裂，形成四個單倍體的精子細胞，精子細胞再進一步分化成為具有專門形態(tài)的成熟精子。從一個精原細胞分化成為成熟的精子，各種動物所需要的天數(shù)是不同的。例如，小鼠為34.5天，大鼠為48天。調(diào)節(jié)精子發(fā)生的激素要緊有垂體前葉分泌的FSH，LH以及睪丸間質(zhì)細胞產(chǎn)生的雄激素。進入曲細精管的精子沒有活動能力，在副睪丸中通過成熟過程才逐步獲得了運動能力和受精力，也就變成了具有爽朗運動能力的成熟精子。精子的發(fā)生是周期性變化的。關(guān)于同一種動物而言，精子發(fā)生所需要的時刻相對恒定。因此了解生精上皮的周期性變化，對確定食品中化學物質(zhì)對精子發(fā)育各時期的阻礙有著重要意義?；瘜W物質(zhì)作用時刻與精子發(fā)育時期的關(guān)系見表8-8。表8-8化學物質(zhì)作用時刻與精子發(fā)育時期的關(guān)系受作用時精子發(fā)育時期從給藥到精子成熟經(jīng)歷的時刻(W)小鼠大鼠輸精管和附睪內(nèi)的精子11～2后期精細胞23前期精細胞34～5次級精母細胞46～8初級精母細胞56～8精原細胞69雄性生殖毒性實驗（一）精子分析精子分析是生殖毒性較為敏感的指標，要緊包括精子計數(shù)、精子運動能力以及精子形態(tài)的檢查。實驗常用小鼠或大鼠。收集精子的方法可采納交配射精后沖洗陰道的方式獵取精子，但大多采納處死動物收集睪尾部和輸卵管中的精子。（二）精子穿透實驗精子穿透實驗實際上確實是精子體外授精的實驗。精子在體外成功地穿透卵子的能力是常規(guī)精子分析所不能顯示的。事實上驗原理是哺乳動物受精過程中物種專一性要緊表現(xiàn)在卵子的透明帶上。獲能及頂體反應是所有哺乳動物精子進行的先決條件。因此，以受試動物的精子使去透明帶的金黃地鼠的卵子受精，以綜合評價外來化學物質(zhì)對精子授精能力的阻礙。（三）大鼠睪丸支持細胞與間質(zhì)細胞分離培養(yǎng)盡管整體動物實驗是評價化學物質(zhì)性腺毒性的要緊途徑，但其耗時、費勁，而且在中毒機制的研究中也受到諸多限制。應用睪丸體外培養(yǎng)的手段檢測化學物質(zhì)對睪丸功能的阻礙，不失為一種簡便、可靠的方法。1.睪丸支持細胞的分離與培養(yǎng)：支持細胞是曲細精管上皮除各級生精細胞外，與精子生成有關(guān)的細胞之一。盡管它是睪丸生精上皮中惟一的非生殖細胞，但它對精子的發(fā)生發(fā)育具有十分重要的意義。支持細胞能分泌多種生物活性物質(zhì)，對生精細胞起到支持和營養(yǎng)作用。因為生精細胞本身不能利用萄萄糖，它所必須的能量是由支持細胞糖酵解所產(chǎn)生的乳酸和丙酮酸來提供。支持細胞具有較強的糖酵解能力，可將萄萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸和丙酮酸。支持細胞的乳酸含量和乳酸脫氫酶活性的變化常被作為反映支持細胞功能以及對生精細胞能量代謝的阻礙和對生精過程干擾的指標。2.睪丸間質(zhì)細胞的分離和培養(yǎng)：間質(zhì)細胞分布在睪丸曲細精管的結(jié)締組織中，細胞呈圓形、梭形或多角形，體積較大，胞核有1－2個核仁，胞漿豐富，呈嗜酸性，含有大量滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。間質(zhì)細胞的要緊功能是分泌雄激素（睪丸酮）。（四）睪丸中標志酶活性檢測睪丸中酶含量和活性的改變是生殖毒性的敏感指標之一，能夠簡便且可靠地反映出外來化學物質(zhì)對睪丸功能的損害。已知睪丸中的酶大致可分為兩類，一類酶其含量和活性隨著精子的形成、成熟而增高，如乳酸脫氫酶同工酶、山梨醇脫氫酶、透明質(zhì)酸酶、α-磷酸甘油脫氫酶等；另一類則是隨著精子的形成、成熟，其活性下降，如6-磷酸葡萄糖脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、三磷酸甘油醛脫氫酶以及異檸檬酸脫氫酶等。下面對常用的三項睪丸酶活性檢測方法加以介紹。1.乳酸脫氫酶x（LDHx）檢測：LDHx是睪丸組織和精子中的一種LDH同工酶，是精子的一種特異酶，存在于精子中段線粒體和尾段漿膜內(nèi)，其活性與精子的發(fā)育、成熟有關(guān)，在精子母細胞的減數(shù)分裂、分化和成熟精子的能量代謝過程中起重要作用。因此，LDHx活性測定能夠作為評價精子質(zhì)量的指標。其差不多原理是LDHx催化乳酸脫氫生成丙酮酸，使輔酶I（NAD+）還原為NADH，酚嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）將NADH的氫傳給硝基四唑氮藍（NBT），使其還原成紫藍色化合物而顯示出酶的有色區(qū)帶。2.山梨醇脫氫酶檢測：山梨醇脫氫酶（SDH）是一種精子特異酶，在睪丸要緊分布在曲細精管和精細胞的線粒體內(nèi)，在精子能量代謝中起重要作用。精子要緊以果糖為供能原料，SDH把果糖轉(zhuǎn)化為山梨醇，進而轉(zhuǎn)化為葡萄糖，才開始通常的代謝途徑。SDH在睪丸成熟期內(nèi)隨著睪丸的重量增加其活性亦增加，因而常被視為睪丸成熟、精子功能和形態(tài)完善的標志酶。其差不多原理是SDH催化山梨醇氧化成果糖，與此同時氧化型輔酶I（NAD＋）被還原為NADH。在340nm處測定NADH的生成量，計算SDH的活力。3.6-磷酸葡萄糖脫氫酶檢測：睪丸內(nèi)的6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G-6PD）要緊存在于曲細精管的間質(zhì)細胞、支持細胞和精細胞內(nèi)，尤其是間質(zhì)細胞內(nèi)G-6PD活性最強。在合成睪酮過程中需要NADPH為輔助因子。氧化旁路即戊糖途徑，是間質(zhì)細胞中NADPH的要緊來源。因G-6PD是氧化旁路開始時的重要酶，從而G-6PD可由供應NADPH的情況為反應間質(zhì)細胞功能的一個指標。其差不多原理是G-6PD催化6-磷酸葡萄糖（G6P）氧化成6-磷酸葡萄糖-δ內(nèi)脂，之后專門快氧化為6-磷酸葡萄酸（6-PGA），與此同時氧化型輔酶Ⅱ（NADP＋）被還原為NADPH。通過測定NADPH的生成量計算G-6PD的活性。（五）雄性激素檢測睪丸生成精子的同時還具有分泌性激素的功能。雄性激素是睪丸中產(chǎn)生的要緊性激素，睪丸的功能要緊靠卵泡刺激素、促黃體生成素和睪酮來維持和調(diào)節(jié)。卵泡刺激素要緊作用于曲細精管的支持細胞，使其合成與分泌雄性激素結(jié)合蛋白。后者的作用是使雄性激素濃聚，維持曲細精管中的雄性激素達到一定水平。促黃體生成素要緊作用于間質(zhì)細胞，使其合成和分泌睪酮。雄性生殖系統(tǒng)不管生精過程、精子成熟過程，依舊附屬性腺的分泌活動，都需要有足夠的睪酮。檢測上述三種性激素含量有助于生殖毒性的評價以及生殖毒作用機制的探討。下面介紹血清睪丸酮含量測定方法。（六）雄性生殖器毒性病理檢驗從形態(tài)學角度評價外來化學物質(zhì)對雄性生殖系統(tǒng)的毒性作用，是雄性生殖毒理學研究中不可缺少的較為敏感的指標和重要手段。睪丸、附睪、前列腺以及精囊的重量和大小的改變常是接觸有害化學物質(zhì)的明顯征兆。睪丸組織最易受到外來化學毒物的侵害，因此在亞慢性或慢性動物實驗中，睪丸組織形態(tài)檢驗是一項重要的指標。睪丸外觀呈橢圓形，成年大鼠睪丸大小約為14mm×20mm，重2~3g。表面包有一層透明而致密的，有接締組織構(gòu)成的白膜。睪丸實質(zhì)內(nèi)有較疏松的接締組織型簡直分割成睪丸小葉。小葉內(nèi)是由大量曲細精管，小管管腔直徑均勻一致。曲細精管的管壁要緊由生精上皮構(gòu)成。該上皮與基底膜相接，細胞核靠近基底膜。生精細胞處于不同發(fā)育時期，從基底膜到管腔排列5~8層?？炕啄そ帪榫毎吮容^大。在精原細胞里側(cè)是初級精母細胞，胞體較精原細胞大。再往內(nèi)側(cè)是次級精母細胞，接著是精細胞，最內(nèi)側(cè)則為精子。小葉間質(zhì)組織中存在具有突起、形狀不整的間質(zhì)細胞。外來化學物質(zhì)作用于雄性生殖系統(tǒng)，可引起睪丸及其附屬器官、組織或細胞的病理性損傷。睪丸各種細胞，特不是各級生精細胞其生理、生化功能各異，因而毒作用引發(fā)的受損表現(xiàn)與程度亦有專門大差異。動物實驗證明，有些毒物對睪丸曲細精管生精上皮的發(fā)育有不同程度的阻礙，如生精細胞胞質(zhì)、胞核的改變，或是細胞產(chǎn)生變性、壞死；有的毒物表現(xiàn)為致精子數(shù)目減少。因為實驗目的各不相同，形態(tài)學研究的實驗動物染毒途徑、處理劑量、取材時刻、處死動物的方式以及觀看的重點均不能劃一。解剖觀看是生殖毒性病理檢驗的要緊環(huán)節(jié)，對以后的光鏡或電鏡觀看結(jié)果的可靠性以及結(jié)論的正確性都有專門大的阻礙，必須認真做好大體解剖的操作，檢視和記錄，正確取材，選擇合適的固定液保存病理檢驗材料。由于電鏡技術(shù)和其他創(chuàng)新的檢測手段的建立、進展，生殖毒性病理學研究深入到亞細胞和分子水平。對組織和細胞化學成分進行微量甚至超微量分析，亞細胞水平定位等方法的出現(xiàn)，使病理形態(tài)逐漸脫離單純的形態(tài)微量甚至超微量分析，亞細胞水平定位等方法的出現(xiàn)，使病理形態(tài)逐漸脫離單純的形態(tài)描述，而把形態(tài)結(jié)構(gòu)變化與功能改變緊密地結(jié)合起來。（七）雄性生殖細胞遺傳毒性檢測除傳統(tǒng)的哺乳動物生殖細胞突變試驗，如：小鼠睪丸染色體畸變分析、小鼠精子畸變分析、小鼠顯性致死突變試驗、黑腹染色體性隱性試驗等外，那個地點再介紹一下小鼠精子慧星試驗?；坌窃囼灒╟ometassey），又稱單個細胞凝膠電泳試驗（singlecellgelassay，SCG），是1984年由Ostiling和Johanson首先建立的，該方法的優(yōu)點是測試完整細胞DNA鏈斷裂，簡便又快速。其原理和方法如下：細胞在體內(nèi)或體外試驗中受化學物作用后，DNA鏈發(fā)生斷裂。將細胞制成單個細胞懸液。在載玻片上制備加有受檢細胞混懸液的凝膠，在堿性條件下使細胞裂解，DNA解旋后進行電泳。帶負電荷的DNA斷裂端由陰極向陽極遷移。DNA經(jīng)EB染色后在熒光顯微鏡下可觀看到DNA受損的細胞核一條尾巴、呈慧星狀，如DNA無損傷則見圓形的核。用圖像自動分析儀可測定呈慧星狀細胞的數(shù)量和比例及計算出受損的DNA量。手工操作可用目鏡測微尺在熒光顯微鏡下測量細胞核的直徑和慧星尾部的長度作為DNA損傷的評價指標。二、雌性生殖性實驗卵巢的內(nèi)分泌功能受垂體前葉促性腺激素（FSH）和黃體生成激素（LH）的操縱。垂體分泌的FSH又受下丘腦某些神經(jīng)細胞產(chǎn)生的促性腺釋放激素（GnRH）的調(diào)節(jié)。由于垂體分泌的促性腺激素FSH和LH的作用，促使卵巢內(nèi)發(fā)生周期性的變化（卵泡的發(fā)育、排卵、黃體生成）。垂體分泌的FSH使卵泡生成，卵泡發(fā)育至次級卵泡時卵泡膜內(nèi)層細胞分泌雌激素，雌激素作用于子宮內(nèi)膜，使子宮內(nèi)膜呈增生期改變。同時它們又反饋地抑制下丘腦和垂體停止分泌促性腺激素。因此，黃體退化、血中孕酮和雌激素含量下降?，F(xiàn)在，下丘腦及垂體不再受抑制，促性腺激素又開始分泌。卵巢中又有卵泡的生長。如此生長反復循環(huán)，從而形成卵巢內(nèi)周期性變化。卵巢的周期性變化與動情周期緊密相關(guān)。小鼠及大鼠的動情周期是4~5天節(jié)律性地重復一次。預定成熟的卵泡大約在動情期開始發(fā)育，下一個動情期末排卵。卵巢中能夠看到不同發(fā)育時期的黃體。黃體的發(fā)育決定于排出的卵是否受精，妊娠黃體比周期黃體大，假如未受精，周期黃體萎退化。同樣在卵泡成熟過程中，有相當數(shù)量不同發(fā)育時期的卵泡萎縮退化形成閉鎖卵泡，大鼠各種卵泡的大小見表8-9。表8-9大鼠各種卵泡及黃體的平均大小卵泡及黃體類型大?。é蘭）卵母細胞大小（μm）初級卵泡25～3018～20生長鐓泡30～40040～60成熟卵泡650～70080～90周期黃體約700－妊娠黃體約100－雌性生殖系統(tǒng)的要緊功能是保障生物繁衍傳代。在哺乳類動物中，它包括卵巢及其附屬器官，如輸卵管、子宮及陰道。外來化學物質(zhì)對雌性生殖系統(tǒng)的損傷要緊表現(xiàn)在對雌性卵巢功能的干擾。卵巢功能包括生殖功能（卵細胞的發(fā)育、排卵、黃體形成）和內(nèi)分泌功能（雌激素和孕激素等性激素的生成和分泌）。（一）發(fā)情周期的觀看1.差不多原理：陰道上皮細胞，由于新陳代謝，不斷地脫落和再生。隨著卵巢激素的變化，脫落的陰道上皮細胞類型和形態(tài)也呈現(xiàn)周期性變化。逐日連續(xù)，了解卵巢功能狀況是否正常。嚙齒類動物的發(fā)情周期可分為發(fā)情前、發(fā)情后及間期等四個期。正常大鼠或小鼠每一發(fā)情周期4~5天。外來化學毒物及不良環(huán)境因素會阻礙卵巢功能，使發(fā)情周期紊亂。2.觀看方法：在滅菌的平皿中倒入滅菌生理鹽水，將小棉拭子插入滅菌鹽水內(nèi)使棉花蘸濕，抓牢受試動物，將棉拭子伸入其陰道，輕輕擦試陰道壁，拭取陰道分泌物，得其涂布于滴有一滴生理鹽水的載玻片上，置顯微鏡下觀看脫落細胞，詳見表8-10。表8-10大鼠或小鼠發(fā)情周期陰道脫落細胞所見持續(xù)天數(shù)陰道涂片細胞所見發(fā)情前期0.5～1.5較多的圓形有核上皮細胞，常見出現(xiàn)少量元核的角化上皮細胞，無白細胞發(fā)情期1要緊為角化上皮細胞，有時混有圓形有核上皮細胞，細胞分散不成堆發(fā)情后期1.2～2大量的角化上皮細胞，常聚攏成堆發(fā)情間期2～4大量散在的白細胞，有時混有少量圓形有核上皮細胞細胞的觀看應在較暗的光線下進行。涂片經(jīng)甲醇固定后可用伊紅、美藍或蘇木素伊紅染色。顯微鏡下見到的胞體最小且有多形核的是白細胞；涂片上大的、扁平多角形、沒有核或有一個小核的是角化上皮細胞；圓形有核上皮細胞是標準的上皮細胞，呈圓或卵形，有清晰的細胞質(zhì)，核深染位于細胞的中央部位。正式實驗前，對實驗動物連續(xù)作陰道脫落紅細胞觀看8~12天，按每組10只選動身情周期正常的受試動物。實驗處理開始后對陰道脫落細胞的觀看至少25天。統(tǒng)計分析各組動物發(fā)情周期平均持續(xù)天數(shù)，將各處理組與對比組比較，如有周期異常表現(xiàn)（發(fā)情周期延長或縮短），應進一步明確要緊是周期中哪一期的改變或發(fā)情周期停滯在哪一期。（二）排卵的觀看染毒處理應在雌鼠處于發(fā)情間期進行，在染毒的第六天（發(fā)情前期）處死動物。取出卵巢。稱量濕重，分離出黃體及非黃體再分不稱重。計數(shù)黃體數(shù)。用Hank’s液沖洗兩側(cè)輸卵管，在實體顯微鏡或擴大鏡下計數(shù)卵細胞數(shù)。整理分析卵巢重量，黃體數(shù)目及其總重量，卵細胞數(shù)等指標。黃體重量減輕，排卵數(shù)目減少是化學毒物對卵巢功能損害的常見表現(xiàn)。也有將卵巢固定，做連續(xù)切片，觀看計數(shù)各期卵泡，推斷排卵情況（見病理組織學檢查）。（三）雌性激素檢測包括雌激素活性測定（TTC還原實驗），血漿雌二醇放免分析法，血漿孕酮放免分析。（四）病理組織學檢查雌性生殖系統(tǒng)包括陰道、子宮、輸卵管、卵巢等以及腎上腺和腦垂體。對其進行毒性病理學檢查應注意有關(guān)器官的重量，如腦垂體、卵巢重量。同時應在光學顯微鏡下對與生殖有關(guān)的器官進行病理組織學檢查，其中卵巢因其具有形成卵細胞和內(nèi)分泌雙重作用而更加重要。通常研究卵巢病理組織學改變的方法是：實驗動物按打算染毒處理后處死，取出卵巢，用甲醛或BouimH氏液固定24h后，作連續(xù)切片，厚5μm，H-E染色，光鏡下檢查，通過每隔五張片子數(shù)一張的方法進行卵母細胞計數(shù)，觀看染毒動物及對比的未染毒動物閉鎖卵泡的數(shù)量差不。這一方法能夠提供以下評價指標：（1）一張切片上的平均卵泡數(shù)；（2）閉鎖卵泡的百分率；（3）進行卵泡分類（原始卵泡、生長卵泡、成熟的格氏卵泡）的相對百分比。電鏡檢查有助于發(fā)覺微細的更為早期的病變部位。三、致畸實驗方法致畸實驗是借助動物實驗檢測外來物致畸效應的方法。（一）差不多原理妊娠母體接觸某些具有致畸作用的化學物質(zhì)，關(guān)于處在器官形成期的胚胎發(fā)育可產(chǎn)生不良阻礙，使胎仔形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生缺陷而呈現(xiàn)畸形。因此，能夠通過觀看妊娠母體在敏感期接觸受試物后胚胎及胎仔的發(fā)育狀況來評價某種化學物質(zhì)有無致畸作用。（二）實驗步驟1.動物選擇：原則上應選擇動物體內(nèi)代謝途徑與人類似，胎盤結(jié)構(gòu)也差不多與人相近，妊娠期短而一致，產(chǎn)仔數(shù)多，而且自發(fā)畸形率較低的實驗動物，為此多選用大鼠或小鼠。選擇健康成年未曾孕產(chǎn)的大鼠，體重200~250g，小鼠20~25g。雌雄動物2:1比例于晚上合籠，次日早晨對雌鼠陰道涂片檢查，查見精子或發(fā)覺陰栓者揭示已交配過，定為孕鼠，以這一天作為妊娠第0天計算妊娠日數(shù)。將查出的孕鼠按隨機區(qū)組法分組，每組10~20只。2.劑量分組：一般高劑量組可選雌鼠LD50的1／3~1／5，低劑量組取1／30~1／50LD50的劑量；也能夠亞慢性毒性實驗中的最大無作用劑量為高劑量，以其1／30為低劑量；還有建議以人體實際接觸量為低劑量，以此劑量的3~5倍為高劑量。在高、低劑量之間再插入一個中間劑量組。陰性對比組為受試物的溶劑，陽性對比組可投與維生素A（150000IU／kg）。此外，也可用敵枯雙、五氯酚鈉、脒基硫脲或乙酰水楊酸等做陽性對比物。3.染毒：在雌鼠妊娠的第7~15天染毒，每日1次。染毒途徑采納灌胃。4.孕鼠狀況觀看：在受試期間內(nèi)應緊密觀看孕鼠的一般狀況，每3天稱量體重1次，通過體重的增減反映出受試物對孕鼠及胚胎的毒性程度。如母體未明顯中毒，胚胎發(fā)育正常，孕鼠體重應明顯持續(xù)增加；反之，如母體中毒，胚胎死亡、汲取，則體重停止增長或下降。5.動物剖檢：鼠類有食畸形胎仔的習性，應在預期分娩的前一天（見表8-12）處死母鼠進行檢查。剖檢前要稱量交記錄母鼠最終體重。常采納頸椎脫臼法處死動物，從腹中線剖開，暴露子宮和卵巢，做大體觀看并記錄黃體數(shù)、活胎數(shù)及汲取胎數(shù)。表8-11胎仔活產(chǎn)，死亡和汲取的特征顏色器官外形自然運動對機械刺激的反應胎盤活產(chǎn)胎仔肉紅色完整成形有有運動反應紅色，較大晚期死胎灰紅色完整成形無無運動反應色灰紅，較小早期死胎烏紫色未完整成形無暗紫吸收胎暗紫或淺色點塊不能辨認胚胎不能辨認胎盤注意觀看有否子宮腺（或稱蛻膜瘤）。子宮腺是受精卵著床子宮內(nèi)壁局部受刺激，組織增生而形成的微小突起，其生長與著床后果無關(guān)，故胚胎著床后死亡，子宮腺則為惟一標志。摘出子宮連同宮內(nèi)胎仔一起稱重，稱為“窩重”。剖開子宮及羊膜，逐個鉗住，剪斷臍帶，取出胎仔，剝離下胎盤，稱胎盤重量。6.胎仔檢查：鑒不并記錄每窩胎仔中活胎數(shù)、晚期死胎數(shù)、早期死胎數(shù)、汲取胎數(shù)及各種胎仔的特征。逐一記錄胎仔外觀所見，對活胎仔要測量其體重、體長和尾長。必要時記錄活胎仔的性不（生殖突與肛門間距離，雌胎仔約1mm，雄性約2mm）。表8-12常用實驗動物妊娠期和致畸敏感期（平均）動物妊娠（天）致畸敏感期（妊娠天數(shù)）金黃地鼠164～14小鼠205～15大鼠216～15兔316～18貓635～12狗638～28豚鼠6811～20（1）胎仔外觀畸形檢查：首先觀看是否有水腫、皮下瘀血。然后從頭頸、胸腹、脊背到前后肢認真觀看記錄?？梢姷囊o外觀畸形見表8-13，表8-14。表8-13致畸實驗中可見的要緊外觀畸形頭部軀干四肢頭部軀干四肢無腦脊柱裂前或后肢形成不全單鼻孔卷尾短指（趾）腦膨出脊髓膨出多指（趾）無耳短尾小頭胸骨裂少指（趾）無顎或小顎無尾顏面裂腹裂畸形指（趾）兔唇開眼鎖肛并指（趾）無頜或小頜表8-14常見的外觀畸形部位畸形及特征頭顱鼻眼耳腭頜肢趾脊柱脊髓腹部尾肛門腦突出：皮膚完整，但部分腦組織與腦膜通過顱骨，向外突出，在皮下形成腫塊露腦：頭顱骨及皮膚均缺損，部分腦組織外露，小腦畸形顱背柱裂：部分腦組織和脊髓露在不處單純性腦膜突出：皮膚完整、半透明，但充滿液體、腦膜通過單孔鼻，鼻孔擴大眼小，無眼，開眼，眼異位無耳，小耳，耳異位腭裂(上腭中部裂開，腭腔與鼻道相通)頜小，無頜，無口，唇裂短肢，畸形足多趾，少趾，短趾，融合趾(并趾)脊柱裂，脊柱骨缺失(多發(fā)生于尾椎以上，軀干較正常短粗，脊柱側(cè)凸)脊髓膜膨出(膨出處脊柱呈小泡狀隆起)臍疝，腹裂(腹腔中全部或部分內(nèi)臟從裂開處露出體外)短尾，角形尾，；螺旋狀尾，無尾肛門閉鎖（2）胎仔內(nèi)臟畸形檢查：將每窩胎仔總數(shù)的1／3左右放入Bouin氏液固定2周。用自來水沖去固定液，將胎仔放在蠟板上切掉四肢和尾巴，采納徒手切片法檢查內(nèi)臟。切面1：通過口經(jīng)耳后作水平切面，檢查顎與舌。切面2：將切下的頭部沿眼球中央垂直通過眼球作額狀切面，檢查眼及嗅球。切面3：在切面2與鼻翼間作垂直額狀切面，觀看鼻道及鼻中隔。切面4：在切面2與后腦中間，即頭部最大橫上作垂直切面，檢查腦、蛛網(wǎng)膜下腔及腦室。然后再作胸腹部切面。首先沿肋下緣作水平切開，然后沿胸腹中線作垂直切開，檢查心臟、主動脈、脈臟、肝臟及胃腸。然后將肝和胃腸摘出，檢查腎臟、輸尿管、膀胱以及睪丸、子宮等發(fā)育狀況。致畸實驗中可見的要緊內(nèi)臟畸形見表8-15，表8-16，表8-17。表8-15胎鼠徒手切片檢查內(nèi)臟畸形切片順序下刀部位和方向橫斷面所見1從鼻孔下通過眼球中部向上切大腦、側(cè)腦室、眼球、鼻中隔、鼻腔2把嘴打開，從舌向口角下刀，向枕部切大腦大腦間腦、延腦、下橫斷面看腭裂3齊下頜向頸后切舌、鼻喉腔、延髓4從雙肩上沿向頸后切氣管、食管、脊髓5從前肢剪斷面中央向后切氣管、食管、脊髓6從前肢剪斷面下沿向后切肺、縱隔、心房、脊髓7從劍突下向后切肺、心室、心室中隔8從臍至劍突間1／2處后切肺、橫膈9從臍向后切肝、胃（小部分）10從腹股溝至臍間1／2處向后切11在相當于骼骨前棘處向后切胃（小部分）肝、腎、脾、胰、腸12不必切，用眼科剪解剖生殖器、膀胱、腎表8-16致畸實驗中可見的要緊內(nèi)臟畸形或異常頭部胸部腹部嗅球發(fā)育不全左位心肝分葉異常無腦右大動脈弓無腎腦室擴張心房（室）中隔缺損腎積水腦室積液食管閉鎖馬蹄腎無眼球肺發(fā)育不全輸尿道積水小眼球肺葉融合無膀胱鼻中隔缺損膈疝無睪丸或無卵巢、子宮或子宮不全表8-17常見的臟器畸形部位畸形及特征腦腭舌眼心肺肝膈腸腎生殖器膀胱腦積水，并引起腦室擴大腭裂短舌，分叉舌少眼，小眼(兩眼大小不等)，無眼右位，心室中隔缺損，單