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文檔簡介
核酸提取天壇醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究1為什么要進(jìn)行核酸提取?PCRSNP,
CNV…(Sequencing)SourtherncDNA
Library
constructionGene
clone,
Vector
constructionReal-time
PCR,NorthernChip
(Expression,
micro-RNA,lncRNA…)…2核酸提取的方法組DNA提取CTAB法(植物、真菌等)SDS法(動(dòng)物組織,血液,細(xì)胞,細(xì)菌,酵母等)其它(按細(xì)胞裂解方式分類,按吸附材料分類)質(zhì)粒DNA提取堿裂解法煮沸法線粒體、葉綠體DNA的提取差速離心
SDS裂解法總RNA提取異硫
酸胍/苯酚法34組DNA提取實(shí)驗(yàn)流程—SDS法基本原則:提取DNA-產(chǎn)量去除雜質(zhì)-純度5組DNA提取基本步驟存的樣品材料不要反復(fù)凍融最好使用新鮮材料,低溫保提取血液
組DNA時(shí),要選擇有核細(xì)胞(白細(xì)胞)材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸沉淀核酸溶解保存6組DNA提取基本步驟材料應(yīng)適量,過多會(huì)影響裂解,導(dǎo)致DNA量少,純度低針對(duì)不同材料,選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式:植物材料--液氮研磨材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸沉淀核酸溶解保存動(dòng)物組織--勻漿或液氮研磨血液樣本--去除紅細(xì)胞組培細(xì)胞--蛋白酶K7細(xì)菌--溶菌酶破壁酵母--破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時(shí),定時(shí)輕柔振蕩組DNA提取基本步驟采用吸附材料或有機(jī)試劑(酚/氯仿)抽提離心分離兩相時(shí),應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間雜質(zhì)去除材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸沉淀核酸溶解保存蛋白質(zhì)的去除多糖的去除多酚的去除8鹽離子的去除組DNA提取基本步驟用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀會(huì)更充分沉淀時(shí)加入1/10體積的3M
NaAc(pH5.2)有利于充分沉淀材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸沉淀核酸溶解保存沉淀后應(yīng)用70%的乙醇洗滌,以除去鹽離子等晾干DNA,讓乙醇充分揮發(fā)(不要過分干燥)9組DNA提取基本步驟若長期 建議使用TE緩沖液溶解材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸沉淀TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子,抑制DNasepH值為
.
,可防止DNA發(fā)生酸解避免反復(fù)凍融核酸溶解保存1011DNA提取常見問題—DNA降解材料不新鮮或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈,DNA被機(jī)械打斷外源核酸酶污染反復(fù)凍融DNA提取常見問題—DNA不純DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前,有
殘留,
抑制后續(xù)酶反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子12DNA提取常見問題—DNA產(chǎn)量低實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗滌時(shí)DNA丟失1314RNA的不穩(wěn)定性內(nèi)因:核糖殘基的2’和3’位置帶有羥基,易被水解外因:內(nèi)源(溶酶體)、外源RNA酶含量豐富,不易失活Basal
RNase
activity
from
mouse
pancreas
is17x
that
of
spleenand
181000x
that
of
brain.
15在RNase我之前它!DEPC異硫
酸胍0.1
M
NaOH,1
mM
EDTARNasin氧釩核糖核苷復(fù)合物SDS、尿素、硅藻土等16成功抽提完整RNA有效破碎細(xì)胞或組織白的變性內(nèi)源核酸酶的失活去除DNA及蛋白污染17RNA提取注意事項(xiàng)根本原則:防止RNA降解,確保RNase
free!避免內(nèi)源RNase:材料處理與保存操作快速液氮研磨/液氮速凍RNA保存試劑避免外源RNase:操作細(xì)節(jié)RNase
free工作區(qū)佩戴
及手套,經(jīng)常更換手套離心管和槍頭等塑料制品121℃處理1小時(shí)研缽及玻璃器皿可在180℃烘烤4小時(shí)0.1%DEPC水配制試劑,RNA實(shí)驗(yàn)18RNA提取實(shí)驗(yàn)流程—異硫 酸胍/苯酚法動(dòng)植物材料傳統(tǒng)方法:
抽提,得率高異丙醇沉淀乙醇洗滌晾干 溶解研磨或勻漿氯仿離心吸附
去蛋白
漂洗
洗脫柱純化法:純度高,無細(xì)胞裂解(TRIzol)19RNA提取基本步驟取材后應(yīng)將樣本切成小塊,立即液氮速凍,轉(zhuǎn)移至-80度的冰箱樣本也可保存于專門的R材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解氯仿抽提NA沉淀/柱純化RNA樣品
液中RNA溶解保存樣品與裂解液充分接觸前避免融化研磨要充分20RNA提取基本步驟TRIzol要與細(xì)胞組織充分接觸裂解盡量充分樣品量不要太大R材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解氯仿抽提NA沉淀/柱純化RNA溶解保存21RNA提取基本步驟R材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解氯仿抽提NA沉淀/柱純化氯仿抽提時(shí)充分混勻離心分離時(shí)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間注意避免吸入中間層不慎吸入應(yīng)再次用有機(jī)試劑抽提RNA溶解保存22RNA提取基本步驟異丙醇低溫沉淀RNA可適當(dāng)延長RNA沉淀時(shí)間預(yù)冷70%乙醇洗滌,晾干R材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解氯仿抽提NA沉淀/柱純化RNA溶解保存23RNA提取基本步驟用經(jīng)DEPC處理過的水或?qū)iT的試劑來洗脫或溶解RNA-80℃分裝保存R材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解氯仿抽提NA沉淀/柱純化RNA溶解保存24RNA
yields
General
Guidelines4ugYield
of
Total
RNA
from
1
mg
Tissue2ug
0.05ug0ugLiverBrainEmbryoBladderSpleenKidneyBoneHeartLungOvaryAdiposeThymusRNA
yields
depend
on
sample
type.25Phenol
based
chemical
reagentRNA
is
more
hydrophilic
than
DNA26紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)A260/280“Pure”
RNA:~2.0
(“Pure”
DNA:~1.8)蛋白質(zhì)殘留會(huì)顯著降低該比值A(chǔ)260/230通常在
.
.A230處有吸光的物質(zhì)殘留會(huì)顯著降低該比值,如:糖類、EDTA、酚、胍鹽……無法檢驗(yàn)RNA是否降解27瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)M12Genomic
DNA28s
RNA18s
RNA5.8s
RNA28RNA提取常見問題及解決方案—RNA降解外源RNase的污染裂解液的質(zhì)量不佳,裂解液的用量不足組織裂解不充分某些富含內(nèi)源酶的樣品(如脾臟,胸腺等),很難避免RNA的降解。建議在液氮條件下研磨,并且使用
裂解液。樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍,然后移至-80℃冰箱保存。樣品與裂解液充分接觸前避免融化,研磨用具必須預(yù)冷,研磨過程中及時(shí)補(bǔ)充液氮。2930RNA提取常見問題及解決方案—RNA產(chǎn)量低起始樣本量過少組織裂解不充分外源RNase的污染降低沉淀溫度,延長沉淀時(shí)間加入助沉淀劑31RNA提取常見問題及解決方案—OD260
/OD280
比值偏低蛋白質(zhì)污染不要吸入中間層及有機(jī)相,加入氯仿后首先混勻,并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。減少起始樣品量,確保裂解完全、徹底。苯酚殘留不要吸入中間層及有機(jī)相,加入氯仿后首先混勻,并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。抽提試劑殘留確保洗滌時(shí)要徹底懸浮RNA,并且徹底去掉75%
乙醇。用水稀釋樣品RNA提取常見問題及解決方案—
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