核酸提取天壇醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室

核酸提取天壇醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究1為什么要進(jìn)行核酸提取？PCRSNP,

CNV…(Sequencing)SourtherncDNA

Library

constructionGene

clone,

Vector

constructionReal-time

PCR，NorthernChip

(Expression,

micro-RNA,lncRNA…)…2核酸提取的方法組DNA提取CTAB法（植物、真菌等）SDS法（動(dòng)物組織，血液，細(xì)胞，細(xì)菌，酵母等）其它（按細(xì)胞裂解方式分類，按吸附材料分類）質(zhì)粒DNA提取堿裂解法煮沸法線粒體、葉綠體DNA的提取差速離心

SDS裂解法總RNA提取異硫

酸胍/苯酚法34組DNA提取實(shí)驗(yàn)流程—SDS法基本原則：提取DNA-產(chǎn)量去除雜質(zhì)-純度5組DNA提取基本步驟存的樣品材料不要反復(fù)凍融最好使用新鮮材料，低溫保提取血液

組DNA時(shí)，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸沉淀核酸溶解保存6組DNA提取基本步驟材料應(yīng)適量，過多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低針對(duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料－－液氮研磨材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸沉淀核酸溶解保存動(dòng)物組織－－勻漿或液氮研磨血液樣本－－去除紅細(xì)胞組培細(xì)胞－－蛋白酶K7細(xì)菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩組DNA提取基本步驟采用吸附材料或有機(jī)試劑（酚/氯仿）抽提離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間雜質(zhì)去除材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸沉淀核酸溶解保存蛋白質(zhì)的去除多糖的去除多酚的去除8鹽離子的去除組DNA提取基本步驟用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀會(huì)更充分沉淀時(shí)加入1/10體積的3M

NaAc（pH5.2）有利于充分沉淀材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸沉淀核酸溶解保存沉淀后應(yīng)用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）9組DNA提取基本步驟若長期 建議使用TE緩沖液溶解材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸沉淀TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為

.

，可防止DNA發(fā)生酸解避免反復(fù)凍融核酸溶解保存1011DNA提取常見問題—DNA降解材料不新鮮或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈，DNA被機(jī)械打斷外源核酸酶污染反復(fù)凍融DNA提取常見問題—DNA不純DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前，有

殘留，

抑制后續(xù)酶反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子12DNA提取常見問題—DNA產(chǎn)量低實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗滌時(shí)DNA丟失1314RNA的不穩(wěn)定性內(nèi)因：核糖殘基的2’和3’位置帶有羥基，易被水解外因：內(nèi)源(溶酶體)、外源RNA酶含量豐富，不易失活Basal

RNase

activity

from

mouse

pancreas

is17x

that

of

spleenand

181000x

that

of

brain.

15在RNase我之前它！DEPC異硫

酸胍0.1

M

NaOH，1

mM

EDTARNasin氧釩核糖核苷復(fù)合物SDS、尿素、硅藻土等16成功抽提完整RNA有效破碎細(xì)胞或組織白的變性內(nèi)源核酸酶的失活去除DNA及蛋白污染17RNA提取注意事項(xiàng)根本原則：防止RNA降解，確保RNase

free!避免內(nèi)源RNase：材料處理與保存操作快速液氮研磨/液氮速凍RNA保存試劑避免外源RNase：操作細(xì)節(jié)RNase

free工作區(qū)佩戴

及手套，經(jīng)常更換手套離心管和槍頭等塑料制品121℃處理1小時(shí)研缽及玻璃器皿可在180℃烘烤4小時(shí)0.1%DEPC水配制試劑，RNA實(shí)驗(yàn)18RNA提取實(shí)驗(yàn)流程—異硫 酸胍/苯酚法動(dòng)植物材料傳統(tǒng)方法：

抽提，得率高異丙醇沉淀乙醇洗滌晾干 溶解研磨或勻漿氯仿離心吸附

去蛋白

漂洗

洗脫柱純化法：純度高，無細(xì)胞裂解(TRIzol)19RNA提取基本步驟取材后應(yīng)將樣本切成小塊，立即液氮速凍，轉(zhuǎn)移至-80度的冰箱樣本也可保存于專門的R材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解氯仿抽提NA沉淀/柱純化RNA樣品

液中RNA溶解保存樣品與裂解液充分接觸前避免融化研磨要充分20RNA提取基本步驟TRIzol要與細(xì)胞組織充分接觸裂解盡量充分樣品量不要太大R材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解氯仿抽提NA沉淀/柱純化RNA溶解保存21RNA提取基本步驟R材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解氯仿抽提NA沉淀/柱純化氯仿抽提時(shí)充分混勻離心分離時(shí)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間注意避免吸入中間層不慎吸入應(yīng)再次用有機(jī)試劑抽提RNA溶解保存22RNA提取基本步驟異丙醇低溫沉淀RNA可適當(dāng)延長RNA沉淀時(shí)間預(yù)冷70％乙醇洗滌，晾干R材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解氯仿抽提NA沉淀/柱純化RNA溶解保存23RNA提取基本步驟用經(jīng)DEPC處理過的水或?qū)ｉT的試劑來洗脫或溶解RNA-80℃分裝保存R材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解氯仿抽提NA沉淀/柱純化RNA溶解保存24RNA

yields

General

Guidelines4ugYield

of

Total

RNA

from

1

mg

Tissue2ug

0.05ug0ugLiverBrainEmbryoBladderSpleenKidneyBoneHeartLungOvaryAdiposeThymusRNA

yields

depend

on

sample

type.25Phenol

based

chemical

reagentRNA

is

more

hydrophilic

than

DNA26紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)A260/280“Pure”

RNA：~2.0

(“Pure”

DNA：~1.8)蛋白質(zhì)殘留會(huì)顯著降低該比值A(chǔ)260/230通常在

.

.A230處有吸光的物質(zhì)殘留會(huì)顯著降低該比值，如：糖類、EDTA、酚、胍鹽……無法檢驗(yàn)RNA是否降解27瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)M12Genomic

DNA28s

RNA18s

RNA5.8s

RNA28RNA提取常見問題及解決方案—RNA降解外源RNase的污染裂解液的質(zhì)量不佳，裂解液的用量不足組織裂解不充分某些富含內(nèi)源酶的樣品(如脾臟，胸腺等)，很難避免RNA的降解。建議在液氮條件下研磨，并且使用

裂解液。樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后移至-80℃冰箱保存。樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須預(yù)冷，研磨過程中及時(shí)補(bǔ)充液氮。2930RNA提取常見問題及解決方案—RNA產(chǎn)量低起始樣本量過少組織裂解不充分外源RNase的污染降低沉淀溫度，延長沉淀時(shí)間加入助沉淀劑31RNA提取常見問題及解決方案—OD260

/OD280

比值偏低蛋白質(zhì)污染不要吸入中間層及有機(jī)相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底。苯酚殘留不要吸入中間層及有機(jī)相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。抽提試劑殘留確保洗滌時(shí)要徹底懸浮RNA，并且徹底去掉75%

乙醇。用水稀釋樣品RNA提取常見問題及解決方案—