離子交換層析進(jìn)階與優(yōu)化

Imagination

at

work.離子交換層析進(jìn)階與優(yōu)化層析技術(shù)的分類凝膠過(guò)濾離子交換疏水層析親和層析反相層析2離子交換和疏水層析2015/7/13離子交換層析原理如何做離子交換層析離子交換層析的應(yīng)用離子交換填料的選擇總結(jié)內(nèi)容離子交換層析?4離子交換和疏水層析2015/7/133離子交換層析是通過(guò)生物分子所帶的電荷與填料上所帶的相反電荷的可逆相互作用來(lái)分離物質(zhì)的一種層析方式。COOHR

NH+R

NH3+COO

-RNH2COO

-low

pH正電荷high

pH負(fù)電荷獲得氫失去氫acid

isoelectric

point

alkalineexcess

positive

charge

balanced

positive

and

negative

charge

excessnegative

chargeCOOHR

NH+pH

3

3

pH

10RNH+3COO-RCOO-NH2overall

charge

on

protein-+蛋白質(zhì)所帶有的電荷取決于pH蛋白質(zhì)的滴定曲線不同宿主中蛋白質(zhì)pI的分布Archaeoglobus

fulgidus

(2420

proteins)

E.

coli

(4279

proteins)H.

Sapiens

(27

941

proteins)絕大部分的pI在5.8或9附近pI分布直方圖SOURCE:

Multi-modality

of

pI

distribution

in

whole

proteome

Songfeng

et

al,

Proteomics,

2006蛋白質(zhì)在生理環(huán)境下通常是帶電荷的！6離子交換和疏水層析2015/7/13為什么選擇離子交換?離子交換是一種可以在層析的各個(gè)階段以及各種規(guī)模下廣泛使用的層析技術(shù)良好的可操控性

Controllable高選擇性

High

selectivity高載量

High

capacity可以將樣品濃縮

Concentrating高回收率

High

recovery離子交換層析原理如何做離子交換層析離子交換層析的應(yīng)用離子交換填料的選擇總結(jié)內(nèi)容怎樣做離子交換層析步驟如何做①

選擇合適的層析設(shè)備②

配制合適的緩沖液③

選擇合適的層析填料④

樣品準(zhǔn)備⑤

洗脫方式⑥

填料的

和再生9離子交換和疏水層析2015/7/13上樣洗脫平衡再生-----

-

--

-

-

---

------

-

--

--

--

-

-

--------

-

----++++

++

++++++-+

+

-+

++

-+-

+-

+

-

+-

+

--

++

-++

-

+-----

+-

+

--

-

+---陰離子交換介質(zhì)怎樣做離子交換-層析步驟10離子交換和疏水層析2015/7/13pH

cond

UVfraction

collection

Frac-901AW1W2B

MIXERsample11離子交換和疏水層析2015/7/13pump

P-920valve

FV-903monitor

UPC-900differentbuffersinjectionvalve

V1large

and

small

fractionscolumns

for

AIX,

CIXand

buffer

exchangemonitor

for

UV,conductivity

and

pH怎樣做離子交換-①層析設(shè)備選擇pH

3pH

10陰離子交換色譜陽(yáng)離子交換色譜charge

on

protein-+怎樣做離子交換-②選擇緩沖液pH12離子交換和疏水層析2015/7/1310203040500

02040

60

80Elution

volume

(ml)100mAUM

NaCl13離子交換和疏水層析2015/7/1310.50120pH

5pH

6pH

7pH

8pH

9使用scouting功能篩選合適的pH條件分離DACOS怎樣做離子交換-②選擇緩沖液pHColumn:

Q

XL,

6

mlSample:

2

mg

crude

DACOSSystem:

?KTAexplorer?

100BufferPrep怎樣做離子交換-②選擇緩沖系統(tǒng)陰離子交換陽(yáng)離子型緩沖體系,pH

略高于目標(biāo)蛋白pI(0.5-1

PH)增加pH

可以提高結(jié)合的強(qiáng)度陽(yáng)離子交換陰離子型緩沖體系,pH略低于目標(biāo)蛋白pI(0.5-1

PH)降低pH可以提高結(jié)合的強(qiáng)度14離子交換和疏水層析2015/7/13A.Citrate

20

mM,

pH

4.9B.Citrate

20

mM,

NaCl

1

M,

pH

4.915離子交換和疏水層析2015/7/13A.Citrate

20

mM,

pH

4.9B.A

+

NaCl

1

M怎樣做離子交換-②緩沖液配制方式“相同”的方式配制緩沖液？怎樣做離子交換-②緩沖液中的添加劑不帶電荷的中性添加劑通常是OK的！注意蛋白的溶解性和穩(wěn)定性會(huì)增加靜電作用添加甘油和醇類后粘度和背壓增加陰離子去垢劑如

SDS 會(huì)結(jié)合在陰離子交換劑上陽(yáng)離子去垢劑如

CPC 會(huì)結(jié)合在陽(yáng)離子交換劑上采用去污劑后，先運(yùn)行空白對(duì)照16離子交換和疏水層析2015/7/13500%

B1008time

minRNA/DNA0246RNADNAEDTA在陰離子交換層析中的累積和洗脫EDTA

absorbs

at

254

nm怎樣做離子交換-②緩沖液中的添加劑去垢劑在鹽梯度中達(dá)到臨界膠束濃度CMC超過(guò)臨界膠束濃度CMC,去垢劑形成膠束導(dǎo)致紫外檢測(cè)出問(wèn)題。怎樣做離子交換-②緩沖液中的添加劑19

/GE

/怎樣做離子交換-③選擇填料基架OS

OO配基Sepharose基架Source基架Capto基架Sephadex基架纖維素基架陰離子交換劑DiethylaminoethylDiethylaminopropyl(DEAE)(ANX)-CH2CHOHCHH2N+H(CH2CH3)2

弱Quaternary

ammonium

(Q)

-CH2N+(CH3)3陽(yáng)離子交換劑-OCH2CH2N+H(CH2CH3)2

弱強(qiáng)Carboxymethyl

(CM)Sulphopropyl

(SP)Methylsulphonate

(S)弱強(qiáng)強(qiáng)3-OCH2COO–-CH2CH2CH2SO

–3-CH2SO

–怎樣做離子交換-③選擇填料配基種類蛋白質(zhì)分子的凈電荷和pH有關(guān)，所以要根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和穩(wěn)定性來(lái)選擇離子交換填料的類型如何選擇合適的離子交換填料？從強(qiáng)離子交換劑開(kāi)始(Q,S,SP)可以在寬pH范圍開(kāi)展工作如果目標(biāo)蛋白的等電點(diǎn)低于pH7.0

或未知，用強(qiáng)陰離子交換劑如果強(qiáng)離子交換劑不滿意，可以考慮弱離子交換劑20離子交換和疏水層析2015/7/13強(qiáng)離子交換劑:載量在很寬的pH

范圍內(nèi)保持恒定怎樣做離子交換-③選擇填料配基強(qiáng)弱弱離子交換劑:載量隨pH

而變化原則：首選強(qiáng)離子交換劑，若選擇性不夠好時(shí),嘗試弱離子交換劑21離子交換和疏水層析2015/7/13高載量通量:–高流速粗純

中度純化

精純高分辨率載量合適的流速最高的分辨率要求90

μm

40,

30,

34

μm

15

μm

10

μm粒徑填料Sepharose

HPSOURCE

15MonoBeads?分辨率Rs通量Capto?Sepharose?

FFSOURCE?

30填料的選擇可以登錄

：

om/protein-purification怎樣做離子交換-③選擇填料顆粒大小22離子H交o換w和疏to水d層o析it2015/7/13怎樣做離子交換-③選擇填料顆粒大小平均粒徑40μm23離子交換和疏水層析2015/7/13平均粒徑90μmSample:0.4

mgconalbumin

pI=6.3,

0.8

mg

a-lactoglobulin

pI=5.8,1.2

mg

soyabean

trypsin

inhibitor

pI=4.5start

buffer.HiTrap?DEAE

FF

1

mlHiTrap

Q

FF

1

mlHiTrap

Q

XL

1

mlHiTrap

ANX

FF

high

sub

1

ml20

mM

Tris-HCl

pH

7.420

mM

Tris-HCl,

0.5

M

NaCl

pH

7.41

ml/min

150

cm/hdissolved

in

2mlColumns:Start

buffer:Elution

buffer:Flow

rate:Running

parameters

Equilibration:

20

ml

start

bufferSample

application:

2

mlwash:5

ml

start

buffer

elution

40

ml,

linear

gradient,0–80

%

elution

buffer?KTAexplorer?

100

controlled

by

UNICORN?

3.0Instrumentation:怎樣做離子交換-③實(shí)驗(yàn)篩選填料24離子交換和疏水層析HiTrap

IEX

/

HiTrap

Capto

IEX

select2i0o1n5/7K/i1t325離子交換和疏水層析2015/7/13怎樣做離子交換-④樣品準(zhǔn)備在脫鹽柱上進(jìn)行緩沖液置換用于調(diào)整緩沖液的pH和鹽濃度過(guò)濾和離心來(lái)去除不溶物，防止堵塞層析柱如果緩沖液的pH和鹽濃度調(diào)整好了，大體積的樣品可以直接上樣樣品應(yīng)該溶解到起始緩沖液中，尤其是對(duì)于大體積的樣品更加關(guān)鍵緩沖液的離子濃度應(yīng)該在20-50mMAUvolumepH

valuegradientvolumeAUpH

valuegradient怎樣做離子交換-④樣品準(zhǔn)備怎樣做離子交換-⑤洗脫方式初次試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)條件:注意：不同鹽具有不同的洗脫能力Sulphate

(SO4-2)Chloride

(Cl-1)Acetate

(CH3COO-1)150

mM350

mM700

mMStart

buffer

A:Elution

buffer

B:0–50

%

B51–100%

B100-0%

B20-50

mM20-50

mM

+

1

MNaClin

20

col

volin

3–5

col

volin

3–5

col

volseparationwashre-equilibrate27離子交換和疏水層析2015/7/13怎樣做離子交換-⑤洗脫方式Manual

un

7

0_CondManual

un

7

0_pHManual

un

7

0_

act

onsManual

un

7

0_In

ectManual

un

7

0_UV

_280nm

Manual

un

7

0_

ogbook050000050020002500mAU

300020

030

040

050

060

070

080

0mlWas

eM

a

n

u

a

l

u

n

7

0

_

C

o

n

d

M

a

n

u

a

l

u

n

7

0

_

p

H

M

a

n

u

a

l

u

n

7

0

_

F

a

c

t

o

n

s

M

an

ua

lun

7

0

_

In

j

e

c

tM

a

n

u

a

l

u

n

7

0

_

U

_

2

8

0

n

m

M

a

n

u

a

l

u

n

7

0

_

L

o

g

b

o

o

k

50

0

00

0

50

0

2

0

0

0

2

5

0

0

m

A

U

3

0

0

0

24

0

26

0

28

0

34

0

ml

0W

a

s

t

eA

A

2

A3

A

5

W

a

s

t

eA6

A7

A8

A

9

A

0

A

A

2

B

2

B

B

0

B9

B8

B7

B6

W

a

s

t

e

B4

00 20

W

a

s

t

eHiscreen

CaptoDEAE(4.7ml)BufferA:pH8.2

50mM

Tris

0.075MNaClB

uffer

B:A+1MNaCl20min

0~100%BHiscreen

CaptoDEAE(4.7ml)BufferA:pH8.2

50mM

Tris0.075M

NaClB

uffer

B:A+1MNaCl20min

0~50%BManual

un

7

0_pHManual

un

7

0_

act

onsManual

un

7

0_In

ectManual

un

7

0_UV

_280nm

Manual

un

7

0_Cond

Manual

un

7

0_

ogbook05000005002000mAU500600620

mlC2

C3

C4

C6

C7

C8

Waste520

540C9

C

0

C C

2

D

2

D

D

0560

580Was

eHiscreen

CaptoDEAE(4.7ml)BufferA:pH8.2

50mM

Tris0.075M

NaClB

uffer

B:A+1MNaCl20min

0~30%B28離子交換和疏水層析2015/7/13洗脫梯度越長(zhǎng)，分辨率越高線性洗脫優(yōu)化后的分步洗脫怎樣做離子交換-⑤洗脫方式選擇29離子交換和疏水層析2015/7/13

分辨率高峰窄、濃度高

峰寬硬件要求低、工藝穩(wěn)定選擇性好需要預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索怎樣做離子交換-⑥填料的

和再生?用

1 Msalt去除結(jié)合比較緊的物質(zhì)。然后用5個(gè)柱體積的緩沖液進(jìn)行再平衡每次實(shí)驗(yàn)后都需要再生–

大多數(shù)的離子交換填料可以用

1 M

NaOH以徹底去除雜質(zhì)!–

中性去污劑和酶可以用來(lái)進(jìn)行

雜質(zhì)脂質(zhì)–

30%異丙醇保存–

使用過(guò)的離子交換填料保存在20%乙醇中30離子交換和疏水層析2015/7/13離子交換層析原理如何做離子交換層析離子交換層析的應(yīng)用離子交換填料的選擇總結(jié)內(nèi)容技術(shù)陰離子交換親和層析凝膠過(guò)濾陽(yáng)離子交換備注快速去除蛋白酶常規(guī)親和層析步驟用于DNA

結(jié)合蛋白緩沖液置換最后精細(xì)純化>90%純度Mono

S?

5/50

GLdisrupted

and

clarifiedE.

coli

expressing

TniA17.5

mlSOURCE?

15Q

4.6/100

PEHiTrap?

Heparin

HPHiPrep?

26/10

DesaltingSephadex?

G-25

Fine規(guī)模純化堿性DNA-結(jié)合蛋白32離子交換和疏水層析2015/7/13技術(shù)陰離子交換疏水層析凝膠過(guò)濾陰離子交換備注快速捕獲中度純化緩沖液置換精細(xì)純化>90%純度>60%收率SOURCE?

30

Q

packedin

FineLINE?

70homogenized

E.

coliexpressing

Tyrosinephosphatase

1B

7.6

LQ

Sepharose?

XL

packedin

INdEX?

100/500Phenyl

SepharoseHigh

Performancepacked

in

BPG?

100/500Sephadex?

G-25

Finepacked

in

BPG

200/50033離子交換和疏水層析2015/7/13在中試規(guī)模純化重組蛋白離子交換層析原理如何做離子交換層析離子交換層析的應(yīng)用離子交換填料的選擇總結(jié)內(nèi)容選擇重點(diǎn):合適的基架純度RESOURCE

Q?

1ml15

μm30

μmQ

Sepharose?

FF16

x50

mmSOURCE?

Q

XK16

x

50

mm34

μmQ

Sepharose?

HP16

x

50

mm90

μm反壓Capture

?Intermediate

purificationPolishing10

μm3

μmMono

Q?

5/50

GL?Mini

Q?(4.6x50mm)通量?高Sepharose基架High

Performance

(34um)Fast

Flow

(90