第五課沉淀法生物工程下游技術演示文稿

第五課沉淀法生物工程下游技術演示文稿第一頁，共五十三頁。優(yōu)選第五課沉淀法生物工程下游技術第二頁，共五十三頁。沉淀法的目的：通過沉淀達到濃縮的目的,從而降低了后續(xù)的生產費用和簡化了后續(xù)的生產工藝；沉淀方法可有選擇地沉淀所需成分或有選擇地沉淀雜質，起到初步分離的作用；將蛋白質由液態(tài)變成固態(tài)，避免了蛋白質的降解，提高了其穩(wěn)定性；第三頁，共五十三頁。對于小分子生化物質常采用等電點沉淀或形成復鹽沉淀。

如抗生素生產中，四環(huán)素可用等電點或尿素復鹽沉淀法，鏈霉素與苯甲胺縮合形成希夫堿沉淀，并在酸性條件下分解以制得成品。對于大分子生化物質常采用鹽析、有機溶劑、等電點及親和沉淀方法。沉淀法的應用第四頁，共五十三頁。沉淀法的分類根據所加入的沉淀劑的不同，沉淀法可以分為：（1）鹽析法；（2）等電點沉淀法；（3）有機溶劑沉淀法；（4）親和沉淀法；（4）非離子型聚合物沉淀法；（5）聚電解質沉淀法；（6）復合鹽沉淀法等；（7）選擇性沉淀法。第五頁，共五十三頁。蛋白質的溶解特性在水溶液中，多肽鏈中的疏水性氨基酸殘基具有向內部折疊的趨勢，即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸殘基暴露在外表面，形成疏水區(qū)。親水性氨基酸殘基基本分布在蛋白質立體結構的外表面。蛋白質是兩性電解質，因此，蛋白質表面由不均勻分布的荷電基團形成荷電區(qū)、親水區(qū)和疏水區(qū)構成。第六頁，共五十三頁。蛋白質分子表面的疏水區(qū)域和荷電區(qū)域第七頁，共五十三頁。防止蛋白質凝聚沉淀的屏障⑴蛋白質周圍的水化層（hydrationshell)，⑵蛋白質分子間靜電排斥作用。蛋白質水化層的厚度和δ電位與溶液性質密切相關，如溫度、pH值、介電常數(shù)和離子強度。第八頁，共五十三頁。鹽析法當中性鹽加入蛋白質分散體系時可能出現(xiàn)以下兩種情況：（1）“鹽溶”現(xiàn)象(salt-in)—低鹽濃度下，增加蛋白質分子間靜電斥力，隨著中性鹽離子強度的增加，蛋白質溶解度增大。（2）“鹽析”現(xiàn)象(salt-out)—高鹽濃度下，中和電荷、破壞水化膜，蛋白質溶解度隨之下降。

第九頁，共五十三頁。鹽析法原理（1）破壞水化膜，分子間易碰撞聚集（2）破壞水化膜，暴露出疏水區(qū)域（3）中和電荷，減少靜電斥力第十頁，共五十三頁。第十一頁，共五十三頁。㏒S=β-ＫsＩS—蛋白質的溶解度，g/L;I－離子強度，

I=1/2∑mizi2

mi—離子i的摩爾濃度；Zi—所帶電荷β—常數(shù)，圖中截距Ks—鹽析常數(shù)，圖中直線斜率Cohn經驗式

蛋白質溶解度與鹽濃度的關系第十二頁，共五十三頁。鹽析操作1）加入固體鹽法用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況，工業(yè)上常采用這種方法。2）加入飽和溶液法用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大的情況。3）透析平衡法先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸銨中進行透析，袋內飽和度逐漸提高，達到設定濃度后，目的蛋白析出。該法優(yōu)點在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性并且緩慢，鹽析效果好，故多用于結晶。第十三頁，共五十三頁。鹽析作用要強需有較大的溶解度鹽溶液密度不高鹽析用鹽必須是惰性的來源豐富、經濟例如：鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉

硫酸銨是最常用的蛋白質鹽析沉淀劑。鹽析用鹽的選擇第十四頁，共五十三頁。一般的規(guī)律為：半徑小的高價陰離子的鹽析作用較強。例如：陰離子鹽析效果：檸檬酸＞PO43-＞SO42-

＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-陽離子鹽析效果：NH4+＞K+＞Na+＞Mg2+

陰離子對蛋白質溶解度的影響大于陽離子。第十五頁，共五十三頁。1、鹽濃度）鹽濃度在進行分離的時候，一般從低離子強度到高離子強度順次進行。

每一組分被鹽析出來后，經過過濾或冷凍離心收集，再在溶液中逐漸提高中性鹽的飽和度，使另一種蛋白質組分鹽析出來。影響鹽析效果的因素第十六頁，共五十三頁。鹽析用鹽量的確定-飽和度：目標蛋白質在鹽析沉淀操作之前，所需的中性鹽的濃度可通過實驗確定。對多數(shù)蛋白質，當達到85%飽和度時，溶解度都小于0.lmg／L，通常為兼顧收率與純度，飽和度的操作范圍在40%-60%之間。第十七頁，共五十三頁。分段鹽析(fractionalsaltingout)硫酸銨的飽和度/%沉淀的蛋白質硫酸銨的飽和度/%沉淀的蛋白質20纖維蛋白質>50白蛋白28～33優(yōu)球蛋白80肌紅蛋白33～50擬球蛋白可在較低飽和度下先除去雜蛋白，然后在較高的飽和度下，沉淀目標蛋白質，稱為分段鹽析。分段鹽析時，可選擇稀一些的蛋白質溶液，使共沉淀作用減至最低限度。表1血漿蛋白的分段鹽析結果第十八頁，共五十三頁。第十九頁，共五十三頁。2、蛋白質種類和濃度組成相近的蛋白質，分子量越大，沉淀所需鹽的量越少；蛋白質分子不對稱性越大，也越易沉淀。不同濃度的同種蛋白質溶液要產生沉淀所要求的臨界鹽濃度不同。蛋白質濃度大時，用鹽少，沉淀作用強，蛋白質溶解損失小。

一般常將蛋白質的含量控制在2～3%為宜。影響鹽析效果的因素第二十頁，共五十三頁。對起始濃度為30g/L的碳氧肌紅蛋白溶液，目標蛋白在硫酸銨飽和度為58-65％之間沉淀出來；當稀釋10倍時，飽和度達到66%時才開始沉淀，而相應的沉淀范圍為66-73%飽和度。第二十一頁，共五十三頁。硫酸銨鹽析過程

目標蛋白的最適飽和度是多少？204060800100總蛋白目標蛋白質上清液蛋白濃度第二十二頁，共五十三頁。3、pH值為提高鹽析效率，多將溶液pH值調到目標蛋白的等電點處。在水中或稀鹽液中的蛋白質等電點與高鹽濃度下所測的結果是不同的，需根據實際情況調整溶液pH值，以達到最好的鹽析效果。

影響鹽析效果的因素第二十三頁，共五十三頁。在進行鹽折時，必須控制pH圖中直線都相互平行pH值第二十四頁，共五十三頁。鹽析影響因素：4、溫度的影響在高鹽濃度下，大部分蛋白質的溶解度隨溫度上升而下降。在一般情況下，鹽析可在室溫下進行，只有某些對溫度比較敏感的酶要求在0-4℃進行。第二十五頁，共五十三頁。鹽析法特點成本低，操作簡單、安全；在中性溫和的環(huán)境中，不會引起蛋白質變性；鹽析后要透析或超濾去鹽；只是作為初步的分離純化，還需要結合其它的純化方法。第二十六頁，共五十三頁。等電點沉淀法等電點沉淀：在低離子強度下，調pH至等電點，使蛋白質所帶凈電荷為零，降低了靜電斥力，而疏水力能使分子間相互吸引，形成沉淀。

pH=pI第二十七頁，共五十三頁。等電點沉淀法注意事項本法適用于疏水性較強的蛋白質；

例如：酪蛋白在等電點時能形成粗大的凝聚物。但對一些親水性強的蛋白質。如明膠，則在低離子強度的溶液中，調pH在等電點并不產生沉淀。蛋白質的等電點易受鹽離子的影響發(fā)生變化；

自然界中，蛋白質較易結合陰離子，使等電點向酸側移動。

低離子強度下，pH約等于等電點。第二十八頁，共五十三頁。在調節(jié)等電點時，要注意防止酶的失活或蛋白變性。一般使用可用乙酸、碳酸等弱酸和碳酸鈉等弱堿。蛋白質在等電點附近鹽溶作用明顯，必須控制溶液較高的離子強度。等電點沉淀法往往不能獲得高的回收率，通常與其他沉淀方法結合使用；第二十九頁，共五十三頁。定義：在含有溶質的水溶液中加入一定量親水的有機溶劑，降低溶質的溶解度，使其沉淀析出。優(yōu)點：1）分辨能力比鹽析法高；2）沉淀不用脫鹽；3）離心收集較為容易；4）溶劑沸點較低，除去回收方便。缺點：1）容易引起變性失活；2）操作要求在低溫下進行；3）有機溶劑易揮發(fā)，需有防護。

有機溶劑沉淀法第三十頁，共五十三頁。有機溶劑沉淀法機理第三十一頁，共五十三頁。有機溶劑沉淀法原理

A降低溶劑介電常數(shù)B破壞水化膜C相反力第三十二頁，共五十三頁。表2一些有機溶劑的介電常數(shù)

溶劑介電常數(shù)溶劑介電常數(shù)水802.5M尿素8420%乙醇705M尿素9140%乙醇60丙酮2260%乙醇48甲醇33100%乙醇24丙醇232.5M甘氨酸137第三十三頁，共五十三頁。常用的有機溶劑水溶性要好介電常數(shù)要小致變性作用要小毒性要小、揮發(fā)性適中容易獲取

常用的有機溶劑：乙醇、甲醇和丙酮

第三十四頁，共五十三頁。

1、溫度

使用有機溶劑沉淀時，操作必須在低溫下進行，有機溶劑要預冷，并緩緩加入伴隨不斷攪拌，一是防止溶液局部升溫，二是為了防止局部過濃引起變性作用和分辨率下降。溫度還會影響有機溶劑對蛋白質的沉淀能力。

大多數(shù)蛋白質在乙醇-水體系中溶解度隨溫度降低而減少，低溫對提高收率也是有利的。

有機溶劑沉淀法的影響因素第三十五頁，共五十三頁。2、pH值：許多蛋白質在等電點附近有較好的沉淀效果。

3、樣品濃度：樣品較稀時，將增加有機溶劑投入量，降低了樣品的回收率；樣品太濃，會增加共沉作用。一般認為蛋白質的初濃度以0.5～2％為好，粘多糖則以1～2％較合適。

4、中性鹽濃度：較低濃度的中性鹽存在有利于沉淀作用，減少蛋白質變性。

一般中性鹽濃度以0.01～0.05mol/L為好，常用的中性鹽為氯化鈉等。有機溶劑沉淀法的影響因素第三十六頁，共五十三頁。例：

調pH4.2上清液胰島素粗品溶液

30%丙酮沉淀（雜蛋白）上清液調pH6.0上清液Zn2+

胰島素鋅鹽↓第三十七頁，共五十三頁。

舉例：固體發(fā)酵生產α-淀粉酶的提取工藝研究

α-淀粉酶（米曲霉）菌體+水過濾水抽提清液

加乙醇（70%）攪拌α-淀粉酶↓

*pH影響

收率酶活

6.5pH

*

適宜的pH5.6~6.0

*

溫度影響

酶活

收率

1020T℃

*

適宜的溫度10~20℃

第三十八頁，共五十三頁。水溶性非離子型聚合物機理：與有機溶劑相似，破壞蛋白質的水化膜。常用非離子性聚合物：聚乙二醇（PEG）：是一種水溶性的高分子聚合物，分子量4,000以上的PEG可以用來沉淀蛋白質。

還有葡聚糖、右旋糖酐硫酸酯等。優(yōu)缺點：1.可在室溫下進行2.沉淀顆粒大，易于收集3.能夠穩(wěn)定蛋白質4.PEG難去除用聚乙二醇等非離子性聚合物一般用來沉淀核酸（如質粒）和酶。第三十九頁，共五十三頁。多聚電解質沉淀

機理：架橋與靜電，與絮凝劑類似。離子型多糖聚合物，酸性多糖、羧甲基纖維素、海藻酸鈉。合成的離子聚合物：聚丙烯酸聚苯乙烯季胺鹽聚甲基丙烯酸聚乙烯亞胺第四十頁，共五十三頁。此類沉析劑有以下三種：（1）高價金屬鹽：Cu2+，Ag2+，Zn2+，Ca2+

與酸性基團結合；（2）苦味酸鹽、單寧酸鹽、鞣質等，與堿性基 團結合；（3）無機復合鹽：磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽等優(yōu)點：以上鹽類復合物的溶解度很低，極容易沉淀析出。缺點：容易導致活性蛋白的不可逆變性，需采用較溫和的條件。成鹽類復合物沉淀第四十一頁，共五十三頁。１）金屬離子沉淀金屬離子的沉淀作用是由于它們能與蛋白質分子中的特殊部位（如羧基、氨基、咪唑基和巰基）起反應造成的。

例如Zn2+易與組氨酸殘基中咪唑基結合，從而降低蛋白質的溶解度。第四十二頁，共五十三頁。①能與羧基、胺基等含氮化合物以及含氮雜環(huán)化合物強烈結合的一些金屬離子，如：Mn2+、Fe2+

、Ｃo2+、Ni2+

、Ｃu2+、Zn2+、

Cd2+;②能與羧酸結合而不與含氮化合物結合的一些金屬離子，如：Ca2+

、Ba2+、Mg2+

、Pb2+;③能巰基化合物強烈結合的一些金屬離子，如：Ｈg2+

、Ag2+

、Pb2+。第四十三頁，共五十三頁。選擇性變性沉淀法選擇性變性沉淀法：選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜質變性沉淀下來，而與目的物分開。第四十四頁，共五十三頁。分離核酸沉淀劑：酚、氯仿、十二烷基磺酸鈉等目的：使核酸和蛋白質分離，蛋白質變性沉淀，核酸則存在于水溶液中。例如：在核酸提取液中加入氯仿-戊醇或氯仿-辛醇，振蕩一段時間、使蛋白質在氯仿-水的界面上形成沉淀而被除去，核酸仍然留在水溶液中。在對氨基水楊酸等陰離子化合物存在下，用苯酚-水溶液提取核酸，而蛋白質在苯酚層中形成沉淀而被除去。第四十五頁，共五十三頁。分離多糖沉淀劑：CTAB(十六烷基三甲基季銨鹽溴化物)CPC（十六烷基氯化吡啶）原理：季銨基團上的陽離子與多糖上的陰離子形成形成季銨絡合物，降低離子強度，絡合物析出，但當離子強度增加到一定范圍時，絡合物解離，最后溶解。第四十六頁，共五十三頁。沉淀劑：三氯乙酸例如用2.5%三氯乙酸處理胰蛋白酶、抑肽酶或細胞色素c粗提取液，均可除去大量雜蛋白，而對所提取的酶活力沒有影響。但使用前，必須對酶的酸堿穩(wěn)定性有足夠了解，使用時一般應注意環(huán)境條件溫和（如低溫段時間）分離蛋白質第四十七頁，共五十三頁。各種沉淀方法應用范圍鹽析法：多用于各種蛋白質和酶的分離純化。有機溶劑沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸產品的分離純化，有時也用于蛋白質沉淀。等電點沉淀法：用于氨基酸、蛋白質等兩性物質的沉淀。但單獨應用較少，多與其它方法結合使用。非離子聚合物沉淀法：用于分離生物大分子。生成鹽類復合物沉淀：多用于小分子物質的沉淀。選擇性沉淀：多用于除去某些不耐熱的和在一定條件下易變性的雜蛋白。第四十八頁，共五十三頁。親和沉淀

affinityprecipitation

原理：是一種將生物專一性識別與沉淀分離相結合的分離純化技術。