枯草桿菌搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)α

枯草桿菌搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)a-淀粉酶實驗方

案枯草芽孢桿菌產(chǎn)a-淀粉酶發(fā)酵試驗一、 實驗原理以枯草芽抱桿菌（BacilusSubtilisBF—7658）為實驗菌株，通過種子擴大培養(yǎng)，選出生長力旺盛的菌株進行液體搖瓶發(fā)酵。通過測定不同發(fā)酵時間生產(chǎn)的酶活，來初步估計發(fā)酵最佳時期和終點。淀粉酶是能夠分解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱，包括a-淀粉酶、—淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶。芽抱桿菌主要用來產(chǎn)生a-淀粉酶和異淀粉酶，其中a-淀粉酶又稱淀粉1,4-糊精酶，能夠切開淀粉鏈內(nèi)部的a-1，4-糖苷鍵，將淀粉水解為麥芽糖、含有6個葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖；而異淀粉酶又稱淀粉a-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支鏈淀粉分子分枝點處的a -6-糖苷鍵，將支鏈淀粉的整個側(cè)鏈切下變成直鏈淀粉。通過發(fā)酵實驗，我們可以以酶活為依據(jù)，初步估計發(fā)酵的最佳時期和發(fā)酵終點。二、 實驗材料（一） 實驗菌株：以枯草芽抱桿菌（二） 培養(yǎng)基：1、種子培養(yǎng)液：葡萄糖1%、胰蛋白胨：1%,、酵母提取物：0.5%、NaCI（氯化鈉）：1%調(diào)pH7.2，若配置固體培養(yǎng)基，則再加入1.5%瓊脂。2、 產(chǎn)淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)液：玉米粉2.0% 、蛋白胨1.5% 、CaCb0.02%、MgSQO.02%、NaCI0.25% 、K2HPO0.2%、檸檬酸鈉0.2%、硫酸銨0.075%、NqHPO0.2%調(diào)節(jié)pH值7.0（三） 0.02M磷酸緩沖液（pH6.0）（四） 實驗儀器離心機、水浴鍋、250m「角瓶、試管三、實驗過程1、 分別按培養(yǎng)基配方配制種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。2、 種子斜面及種子液準備挑取單菌落從平板轉(zhuǎn)接于新鮮種子斜面培養(yǎng)基， 37C,24h作菌種（3支/組）。將配好的種子培養(yǎng)液按每瓶50mL分裝于250mL三角瓶中滅菌（100KPa20min）。在無菌操作條件下，將活化的菌株接種于以上培養(yǎng)液中（每支斜面接兩瓶），37r120r/min振蕩培養(yǎng)16h作種子液。 （6瓶/組）3、 發(fā)酵培養(yǎng)A、 按15-20%的接種量接種于裝有50mL已滅菌菌發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中。37E培養(yǎng)48h。B、在無菌操作條件下，每4h取樣2mL測定酶活。40-48h酶活降低后結(jié)束實驗。4、 發(fā)酵結(jié)束后，用顯微鏡檢查是否染菌。5、 待測酶液的制備：稱取1g~2g酶粉（精確至0.0001g）或準確吸取酶液1.00mL,用少量磷酸緩沖液充分溶解，將上清液小心傾入容量瓶中，若有剩余殘渣，再加少量磷酸緩沖液充分研磨，最終樣品全部移入容量瓶中，用磷酸緩沖液定容至刻度，搖勻。用四層紗布過濾，濾液待用。注:待測中溫a-淀粉酶酶液酶活力控制酶濃度在3.4u/mL~4.5u/mL范圍內(nèi)，待測耐高溫淀粉酶活力控制酶濃度在60u/mL~65u/mL范圍內(nèi)。&酶活力的測定吸取10.0mL可溶性淀粉溶液于試管中，加入磷酸緩沖液2.5mL,搖勻后，置于60C±0.2C（耐高溫a-淀粉酶制劑置于70C±0.2C）恒溫水浴中預(yù)熱8min;加入0.5mL稀釋好的待測酶液，立即計時，搖勻，準確反應(yīng)5min；立即用移液管吸取1.0mL反應(yīng)液，加到預(yù)先盛有0.5mL鹽酸溶液和5.00mL稀碘液的試管中，搖勻，并以0.5mL鹽酸溶液和5.00mL稀碘液為空白，于660nm波長下，用10mnit色皿迅速測定其吸光度（A）。根據(jù)吸光度查表A.1，求得測試酶液的濃度。7、酶活力計算（1）中溫a-淀粉酶制劑的酶活力按下式計算：X1=cXn式中：%—樣品的酶活力，u/mL或u/gc—測試酶樣濃度，u/mL或u/gn—樣品的稀釋倍數(shù)（可通過反應(yīng)時間和加入固定化酶的量來控制）。注：所得結(jié)果表示至整數(shù)。允許差：平行試驗相對誤差不得超過5%(2)耐高溫a-淀粉酶制劑的酶活力按下式計算：茨=cXnX16.67式中：人一樣品的酶活