北京大學(xué)色譜LC-3課件

4.2HPLC分離模式

1.正相LC(NP-LC）

2.反相LC(RP-LC)

3.反相離子對LC(IP-LC)

4.離子交換LC(IEC)

5.體積排阻色譜(SEC)

1NP-LC

在這一部分您將學(xué)習(xí):正相HPLC分離機(jī)理和應(yīng)用.

正相HPLC洗脫順序.

如何選擇正相色譜柱.

如何選擇正相色譜流動相.2OSiOSiOSiOOHHOROHHORO吸附色譜-正相機(jī)理氫鍵作用

偶極-偶極作用-絡(luò)合鍵合

溶質(zhì)取代溶劑

固定相

硅膠

氰基鍵合相

氨基鍵合相

二醇鍵合相

流動相有機(jī)溶劑3保留順序保留作用增大極性COHO酸OCNH2酰胺

OH

NH2醇、胺COCHO酮、醛、酯CORONO2硝基ROR醚F,Cl鹵素芳烴CH3烴極性最大的官能團(tuán)決定保留的強(qiáng)弱.5分離選擇性O(shè)CH3官能團(tuán)NO2異構(gòu)體k'k'C=NC-HBrBrBrBr0.61.82.75.53.86.9o6異構(gòu)體的正相色譜分離OFCH2OCH2CH3CH3CH=CCl2高效氟氯氰菊酯

4個異構(gòu)體反相色譜異構(gòu)體未分離正相色譜4個異構(gòu)體均被分離1.保棉磷2.三唑酮3.高效氟氯氰菊酯4.DEF7固定相SiOSiCH3CH3CH2CHOHCH2OHSiOSiCH3CH3(CH2)nCN正相色譜方法開發(fā)的首選固定相.極性最強(qiáng)SiOH最適合于異構(gòu)體分離SiOSiCH3CH3(CH2)nNH2

可替換的選擇性鍵合相的優(yōu)點

不必控制水

可以梯度洗脫

色譜柱平衡快

極性和選擇性范圍寬

柱容量大

色譜峰不像在裸硅膠柱上那樣拖尾8正戊烷二氯甲烷X=二甲苯T=甲苯B=苯X+T+BCH3H3CCH3=0.0=0.32分離原理10對各類化合物的溶劑強(qiáng)度芳烴鹵化物硫醇醚硝基化合物,酯,亞硝酸鹽,羰基化合物醇酚胺酸酰胺0.05-0.250.0-0.30.00.10.2-0.30.30.30.2-0.60.40.4-0.6-0.2-0.25-0.2-0.1-0.20.00.10.20.20.0-0.40.30.3-0.5化合物類型無水溶劑50%H2O飽和溶劑122.反相HPLC14在這一部分您將學(xué)習(xí):反相色譜機(jī)理.HPLC的應(yīng)用.關(guān)于反相色譜柱上的保留.HPLC如何選擇流動相.如何選擇反相色譜柱.15反相分離的定義和機(jī)理OOOOSiSiOSiSiOOHOHOO固定相比流動相的極性小.HO機(jī)理

分配

固定相

十八烷基硅烷

辛基硅烷

氰基

氨基

C4

流動相

水

有機(jī)溶劑

緩沖液

改性劑

16反相HPLC的應(yīng)用反相分離是下列應(yīng)用的首選方法:

分子量小于2000的中性、極性和非極性化合物.

同系物和苯系物.

弱酸弱減.

強(qiáng)酸強(qiáng)堿(離子對

HPLC).

蛋白質(zhì)和多肽.

很難分析:

胺

不溶于水的化合物1722反相HPLC的保留順序不飽和COHOCOHHHNH2CHH水溶性增加>碳數(shù)支鏈胺,醛,酮醇酚保留作用增大保留最弱保留最強(qiáng)羧酸318洗脫強(qiáng)度水/緩沖液水甲醇乙腈異丙醇四氫呋喃用于HPLC的溶劑20與水互溶

低黏度

低UV吸收

良好的溶解性能

不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)...乙腈（ACN）是最好的選擇反相HPLC中最好的有機(jī)溶劑?21Time(min)mAU1100100080060040020010152060%甲醇40%水900700500300100Time(min)80070060050040030020010010152060%異丙醇40%水mAU101520140012001000800600400200Time(min)mAU60%乙腈40%水溶劑強(qiáng)度23選擇反相色譜柱

反相填料類型

球形或無定型顆粒

色譜柱硬件

柱內(nèi)徑

填料粒度

柱長

孔徑和體積

表面積

鍵合相密度

單體鍵合或聚合鍵合填料

封端或其他處理工藝當(dāng)選擇反相色譜柱時，請自己回答這些問題...25反相色譜柱硅膠基SiOSiRCH3CH3R=CH2(CH2)16CH3C-18,

疏水性最強(qiáng)、保留最好、最耐用的色譜柱CH2(CH2)6CH3 C-8,耐用,保留作用比C18弱(CH3)3 C-3,C-4,蛋白質(zhì)和多肽,欠穩(wěn)定，保留作用弱CH2(CH2)2CH3 CNor(CH2)3CN 氰基,相當(dāng)耐用,最受歡迎的反相柱，適合于分離

混合官能團(tuán)物質(zhì)NH2or(CH2)3NH2

胺,弱陰離子交換樹脂,糖分析柱

選擇性不同聚合物基 苯乙烯-二乙烯基苯共聚物pH1-13穩(wěn)定,柱效低一些26300SB-C18條件:色譜柱:ZORBAX300SB,4.6x150mm

流動相:梯度,30min內(nèi)0-26%B.

A=含0.1%TFA的水

B=含0.1%TFA的乙腈

溫度:40°C

樣品:每種肽2μg

流速:1.0mL/min.

檢測:UV-210nm300SB-C8300SB-C3300SB-CN不同鍵合相上小肽的分離27a數(shù)據(jù)引自商業(yè)文獻(xiàn)或制造商提供b對于硅膠類型說明見正文cNA=無數(shù)據(jù)色譜柱參數(shù)舉例28單體鍵合相和聚合鍵合相+ClSiRCH3CH3SiOHSiOHSiOHSiOSiOSiOH

SiRCH3CH3

SiRCH3CH3單體鍵合SiOHSiOHSiOHClSiRClCl+H2OSiOSiOSiOH

SiRSiRSiOO聚合鍵合ROH30

立體保護(hù)(不封端)經(jīng)典ODS傳統(tǒng)(不封端)傳統(tǒng)(封端)*

化學(xué)鍵的酸解離(水解)是可能的殘留硅醇基的處理-封端和立體保護(hù)相313.離子對RP-LC32在這一部分您將學(xué)習(xí):如何用離子抑制劑控制弱酸性樣品的保留.如何使弱減樣品更容易分離.如何分離弱酸、弱減和中性化合物的混合物.如何用離子對HPLC分離強(qiáng)酸和強(qiáng)堿.33弱酸的分離RCOH+H2ORCO

+H3O+OOORCOHORCO和pH=pKa高pHORCO保留最弱低pHORCOH保留最強(qiáng)34保留作用隨pH的變化109876543210pHk’2486弱減弱酸pH=pKORCOHORCO35緩沖液

pKa

緩沖范圍

緩沖液

pKa

緩沖范圍

磷酸 甲酸 3.8 2.8-4.8

pK1 2.1 1.1-3.1 乙酸 4.8 3.8-5.8

pK2 7.2 6.2-8.2 Tris(三羥甲基氨基甲烷)

pK3 12.3 11.3-13.3 8.3 7.3-9.3

氨 9.2 8.2-10.2檸檬酸 硼酸 9.2 8.2-10.2

pk1 3.1 2.1-4.1 吡咯烷 10.5 9.5-11.5

pK2 4.7 3.7-5.7pK3 5.4 4.4-6.4緩沖液其他常用的流動相添加劑乙酸磷酸硫酸三氟乙酸(TFA)36嗎啡、可待因和脫氫嗎啡的分離(a)(b)(c)(a)(b)(c)色譜柱A色譜柱B色譜柱C色譜柱A色譜柱B色譜柱C流動相:(a)80vol%,(b)40vol%,和(c)40vol%乙腈的水溶液,pH均為6，含有

2mM

乙酸鈉緩沖液.流動相:(a)16vol%,(b)10vol%,and(c)7vol%乙腈的水溶液;降低

pH(3.5)并提高緩沖液濃度(25mM).LC-GC,6(1987)494緩沖液濃度37色譜柱:4.6x150mmZorbaxXDB-C8;沖洗:20%ACN/80%0.25M緩沖液,pH7,1.0mL/min;測試:60%ACN/40%0.01M磷酸鈉緩沖液,pH7.0,1.5mL/min;22°C甲苯的理論塔板數(shù),cm0.0000.0020.0040.0060.0080.010阿米替林的理論塔板數(shù),cm0.0000.0020.0040.0060.0080.010用緩沖液沖洗的柱體積數(shù)050001000015000200002500030000用緩沖液沖洗的柱體積數(shù)050001000015000200002500030000磷酸磷酸檸檬酸TRIS磷酸檸檬酸TRIS緩沖液類型對色譜柱穩(wěn)定性的影響38-Si-O-+R3NH+-Si-OH+R3N-Si-O-+HNR3-Si-O-+HNR3胺與硅醇基的相互作用---二次保留磷酸鈉（TEMED）哌嗪Minutes306090120150180建立了與殘留硅醇基的競爭緩沖液pH太低強(qiáng)相互作用阻斷劑作用不夠強(qiáng)三乙胺哌嗪TEMEDN,N,N’,N’,-四甲基乙二胺39色譜柱:4.6x150mm,ZorbaxXDB-C8;流速:1.0mL/min;24°C流動相: A:55%甲醇/45%0.025M磷酸鈉緩沖液,pH3.0 B:55%甲醇/45%0.05M1-甲基吡啶-HCL緩沖液,pH11.0pH3pH11AB1321231阿米洛利2咖啡因3芐噻嗪024681020181614120.000.020.040.100.080.060.000.020.040.060.080.100.12保留時間（Min）弱減-不同pH條件下的分離利尿劑藥物40常規(guī)硅膠柱封端硅膠柱封端色譜柱減少了二次保留作用酸性硅膠基體酸性較弱的硅膠基體41條件:LC:HewlettPackardSeriesII1090

儀器

色譜柱:ZorbaxEclipseXDB-C18,P/N:993967-902

流動相:ACN:pH6.0磷酸/檸檬酸緩沖液(10:90)緩沖液r:0.2MK2HPO4:0.1M檸檬酸(63:37)溫度:23°C;進(jìn)樣體積:10μL(0.1μg/μL);檢測UV:302nmZorbaxEclipseXDB-C18(4.6x150mm)

Flow=1mL/min.Originaltypeof

L1column(3.9x300mm)Flow=2mL/min.1212Rs=15.5Rs=10.8N=2400N=68001.葉酸(內(nèi)標(biāo)物)2.氨甲蝶呤用密集封端柱改善分離-分析氨甲蝶呤的美國藥典方法42分離變量初始選擇色譜柱尺寸粒度鍵合相15(或25)x0.46cm5或3.5μmC18或

C8流動相溶劑

A和

B%B緩沖液添加劑流速溫度樣品量體積質(zhì)量水相緩沖液/乙腈可變(k=0.5-20)25mM磷酸鉀,pH￡3需要時，25-50mMTEA或乙酸三乙胺1-2mL/min40°C￡50μL<25μg分離弱離子化化合物的初始實驗條件43離子對反相HPLC分離強(qiáng)酸和強(qiáng)堿SO3SO3NRRRH+Na+鍵合相離子對試劑樣品N+N+OCROH2PO4用烷基磺酸鹽分離堿三氟乙酸(TFA)七氟丁酸(HFTBA)己烷磺酸用季胺烷基三乙基胺分離酸三乙胺(TEA)磷酸四甲基銨(TMA)磷酸四丁基銨(TBA)乙酸三乙基銨(TEAA)壬胺44離子對反相HPLC分離陰離子流動相

A和B含有離子對試劑C和D是純緩沖液45優(yōu)化離子對HPLC051015200204060烷基硫酸酯[mM]容量因子DECYLOCTYLHEXYLBUTYL優(yōu)化參數(shù)

流動相的

pH

離子對試劑濃度

離子對試劑選擇

流動相組成464.離子交換色譜（IEC）47在這一部分您將學(xué)習(xí):離子交換HPLC分離機(jī)理.如何選擇離子交換固定相.流動相的pH如何影響分離結(jié)果.什么因素影響離子交換色譜的分離.離子色譜基礎(chǔ)知識.48離子交換機(jī)理ClClHHH++++NH+NHCH2COOCH2COO機(jī)理

樣品離子可逆地結(jié)合到帶電固定相上固定相

磺酸鹽(SCX)

季胺(SAX)

羧甲基(WCX)

二乙基氨基乙基(WAX)流動相

流動相

對離子

有機(jī)改性劑

49離子交換HPLC的應(yīng)用-銨和低分子量的胺-季胺化合物-鹵氧化物-弱有機(jī)酸-硅酸鹽-脂肪族和芳香族磺酸鹽-碳水化合物-氨基酸-蛋白質(zhì)-離子色譜能夠分離和檢測：

痕量離子型物質(zhì)，如：

F-,Br-,Cl-,NO2-,NO3-,HPO4-2,SO4-2,Li+,Na+,K+,Mg+2,Ca+2,Sr+2,Ba+2用于分離荷電分子:從小分子到蛋白質(zhì).50固定相的官能團(tuán)SO3SO3SO3Na+Na+Na+SCXCH2COONa+CH2COONaWCX++NCl+NClSAXWAX+NH+NHClCl強(qiáng)的離子交換劑在寬的pH范圍內(nèi)保持其帶電狀態(tài).弱的離子交換劑在有限的pH范圍內(nèi)保持其帶電狀態(tài).51pH對樣品的影響OHH+N

HHCHCCH3COCH3OH+N

HHCHCCH3COCH3OH

NHCHCCH3COCH3凈電荷=+1凈電荷=0凈電荷=-1pH=1pH=6pH=11pk1=2.29pK2=9.7252離子交換流動相對離子Mg2+>Ca2+>NH4+>Na+>K+陽離子交換陰離子交換SO4-2>HPO4-2>Cl->CH3COO-強(qiáng)陰離子交換劑pH<9弱陰離子交換劑pH<6強(qiáng)陽離子交換劑pH>3弱陽離子交換劑

pH>8水相緩沖液和/或鹽-任何常用的HPLC緩沖液(5mM到200mM)

鹽(0到1M)

完全離子交換容量的pH分離參數(shù):

流動相的

pH

對離子的選擇

對離子的濃度(離子強(qiáng)度)

有機(jī)改性劑

流速

溫度53強(qiáng)陰離子交換分離蛋白質(zhì)

不同的離子強(qiáng)度控制洗脫能力.

常用梯度洗脫.541.F-2.HCO3-3.Cl-4.NO2-5.Br-6.NO3-7.PO4-38.SO4-2離子色譜-無機(jī)離子電導(dǎo)檢測器泵離子交換柱抑制柱或膜Na2CO3無機(jī)陰離子陰離子交換劑樹脂-H++Na+HCO3-

樹脂-Na++H2CO3HCl無機(jī)陽離子陽離子交換劑樹脂-OH-+H+Cl-樹脂-Cl-+H2O1.Li+2.Na+3.NH4+4.K+5.Ca2+6.Mg2+陰離子陽離子55-離子色譜-單柱泵進(jìn)樣閥廢液流動池電導(dǎo)檢測器記錄儀色譜柱UV-檢測器單柱電導(dǎo)檢測器-使用很低容量的離子交換劑UV-檢測器-間接

UV檢測565.體積排阻色譜(SEC)57在這一部分您將學(xué)習(xí):關(guān)于體積排阻色譜的不同應(yīng)用.

關(guān)于分離機(jī)理.

分離優(yōu)化提示.58體積排阻色譜的原理機(jī)理:流出順序取決于分子的大小.固定相具有確定孔徑的交聯(lián)膠.必須與樣品無相互作用.流動相水相溶劑-凝膠過濾有機(jī)溶劑-凝膠滲透59應(yīng)用日用品,增稠劑化妝品,穩(wěn)定劑,草藥制劑,藥物釋放控制建筑產(chǎn)品,涂料,水泥添加劑汽油,添加劑汽車輪胎,橡膠形變印刷產(chǎn)品,有機(jī)調(diào)色技術(shù)電子線路板,石印樹脂凝膠滲透凝膠過濾多肽蛋白質(zhì)酶核酸類酯類60體積排阻色譜的一般應(yīng)用最常用于聚合物的平均分子量或分子量分布.提供復(fù)雜樣品的“指紋圖”，以區(qū)別“好”的和“壞”的材料.樣品純化方法.生物分子的定性和定量分析.分離小分子.61SEC的原理BC響應(yīng)柱填料孔保留時間ABCA62固定相的選擇保留時間孔徑太小孔徑太大選擇性滲透總排阻總滲透孔徑合適63校準(zhǔn)-測定分子量2,610,000111,00039,00019,50015,30010,9001,50065分子量（MW）:保留時間(min)保留時間(min)VzVpVZVpVM色譜柱流動相體積隙間體積固定相孔體積聚合物洗脫體積VeGPCK聚合物可接觸體積Log(MW*黏度)64GPC計算??Areai(Area/M)iiM=n數(shù)均分子量(AreaxM)ii??AreaiM=w重均分子量??AreaiM=v(AreaxM)iih1/h黏均分子量(AreaxM)ii??M=z(AreaxM)ii2Z-均分子量D=M/Mwn多分散性i(Area/Slope)iW=iArea/Slopeii?分子量