綜合實(shí)驗(yàn)1：檸檬酸發(fā)酵及產(chǎn)物提取

綜合實(shí)驗(yàn)1:檸檬酸發(fā)酵及產(chǎn)物提?。ㄒ唬幟仕岚l(fā)酵一、實(shí)驗(yàn)原理檸檬酸發(fā)酵為典型的有機(jī)酸發(fā)酵，淀粉質(zhì)原料經(jīng)淀粉酶作用水解為葡萄糖，葡萄糖經(jīng)EMP途徑氧化為丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步被氧化脫羧生成乙酰CoA，就一般能量代謝過(guò)程而言，生成的乙酰CoA與草酰乙酸縮合成檸檬酸后進(jìn)入三羥酸循環(huán)，通過(guò)三羥酸循環(huán)進(jìn)行有氧呼吸的能量代謝。但就檸檬酸產(chǎn)生菌而言，由于其順烏頭酸水合酶和異檸檬酸脫氫酶活性很低，而檸檬酸合成酶的活性很高，因而大量積累檸檬酸，草酰乙酸的提供則仍通過(guò)丙酮酸羧化而成，檸檬酸的生成途徑如下式：2C6H12O6+302_2C6Ha+4互0國(guó)內(nèi)目前檸檬酸發(fā)酵所采用的原料主要是山芋干及廢糖蜜。二、實(shí)驗(yàn)器材（一）材料菌種：黑曲霉2.蔗糖、硫酸銨等（二）主要儀器設(shè)備旋轉(zhuǎn)式搖床、超凈工作臺(tái)、15L發(fā)酵罐等三、操作步驟種子培養(yǎng)基制備：馬鈴薯培養(yǎng)基配方:（1000ml）馬鈴薯（去皮）200g葡萄糖（或蔗糖）20g瓊脂15?25g水1000ml自然?日種子液培養(yǎng)：將已滅菌的種子培養(yǎng)基接入一環(huán)斜面抱子于35°C±1°C、250r.p.m條件下培養(yǎng)24?36h。種子培養(yǎng)液質(zhì)量要求：鏡檢菌絲生長(zhǎng)健壯，結(jié)成菊花形小球，球直徑不超過(guò)00如，每毫升含菌球數(shù)在1?2萬(wàn)之間，無(wú)異味、無(wú)雜菌污染；pH2?2.5；酸度1.5?2.0%。發(fā)酵培養(yǎng)基制備:蔗糖15%，硫酸銨0.4%，磷酸二氫鉀0.1%，7水合硫酸鎂0.025%。上罐滅菌（操作同實(shí)驗(yàn)一）發(fā)酵：將培養(yǎng)好的種子液按發(fā)酵培養(yǎng)液體積的5%接入到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于35C±1C、200r/min條件下發(fā)酵4天。分別在0，24，48，72，96小時(shí)測(cè)定一下參數(shù)。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)種子液進(jìn)行鏡檢，畫(huà)下菌絲形態(tài)，并測(cè)定菌球直徑及粗略估算每ml種子液中的菌球數(shù)。測(cè)定成熟發(fā)酵液的酸度，并就發(fā)酵結(jié)束后的菌體形態(tài)作出描述。計(jì)算檸檬酸發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率，即每100克葡萄糖經(jīng)轉(zhuǎn)化所能生成的檸檬酸克數(shù)，檸檬酸酵的理論轉(zhuǎn)化率按下列反應(yīng)計(jì)算應(yīng)為106.7%?？偡磻?yīng)式：2C<H“O<+3Oc-2CHO+4H0612626872180192理論轉(zhuǎn)化率=192/180=106.7%（二）生長(zhǎng)曲線測(cè)定將烘干的離心管稱重，記錄重量取10ml發(fā)酵液離心，5000rpm，10min（上清液留作下步用），將試管倒置10min,80°C烘干1h。稱重，計(jì)算菌絲體干重。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌絲體重量為縱坐標(biāo)作圖。（三）酸度測(cè)定一產(chǎn)物生成曲線試劑:0.1%酚歐指示劑,0.1429MNaOH溶液酸度：100ml發(fā)酵液中檸檬酸的克數(shù)。酸度的測(cè)定方法：取發(fā)酵液1ml，加入19ml蒸^水，以酚歐為指示劑用0.1429M的NaOH溶液滴定至粉紅色，所消耗的NaOH毫升數(shù)，即為發(fā)酵液酸度。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，酸度為縱坐標(biāo)作圖。（二）還原糖的測(cè)定一糖利用曲線一、實(shí)驗(yàn)原理在NaOH和丙三醇存在下，3,5一二硝基水楊酸（DNS）與還原糖共熱后被還原生成氨基化合物。在過(guò)量的NaOH堿性溶液中此化合物呈桔紅色，在540nm波長(zhǎng)處有最大吸收，在一定的濃度范圍內(nèi)，還原糖的量與光吸收值呈線性關(guān)系，利用比色法可測(cè)定樣品中的含糖量。OHNO2OHNH2HOOcg^^>+還原糖一?HOOC—~~'no2no2（DNS）（3—氨基一5一硝基水楊酸）？三、試劑和器材1、試劑6.5gDNS溶于200-300ml去離子水，配制2mol/lNaOH溶液325ml，3.45g甘油（丙三醇）三者混合定容至1000ml即可。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取干燥恒重的葡萄糖200mg，加少量蒸餾水溶解后，以蒸餾水定容至100ml，即含葡萄糖為2.0mg/ml。2、材料發(fā)酵液3、器材WFJUV-2000型分光光度計(jì)，水浴鍋，電爐，試管。四、操作方法1、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取5支15mmx180mm試管，按下表加入2.0mg/m】葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和蒸餾水。管號(hào)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液/ml蒸餾水/ml葡萄糖含量mg/mlOD540001010.20.80.420.40.60.830.60.41.240.80.21.65102在上述試管中分別加入DNS試劑2.0ml，于沸水浴中加熱2min進(jìn)行顯色，取出后用流動(dòng)水迅速冷卻，各加入蒸餾水12.0ml，搖勻，在540nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蔗糖酸解取2m^M后的上清液，置于干凈的試管中，加/2ml2M鹽酸搖勻，置于沸水浴中水解25min，使蔗糖水解成單糖。水解液用2ml2MNaOH調(diào)至中性，全量倒入100ml容量瓶中，定容。3、樣品中含糖量的測(cè)定取4支試管，分別按下表加入試劑:試管序號(hào)空白還原糖0123樣品溶液/ml1蒸餾水1113,5-二硝基水楊酸試劑/ml2222加完試劑后，于沸水浴中加熱2min進(jìn)行顯色，取出后用流動(dòng)水迅速冷卻（自來(lái)水沖洗），各加入蒸餾水12.0ml，搖勻，在540nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值。測(cè)定后，取樣品的光吸收平均值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的糖量。（如果測(cè)量的OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高值，稀釋后重新測(cè)量，注意計(jì)算稀釋率）。3、結(jié)果處理發(fā)酵液含糖量（g/ml）=[（AxN）/1000]*100A:為由吸光度查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的還原糖的毫克數(shù)N：為稀釋倍數(shù)。（三）檸檬酸的提取一一檸檬酸鈣的制備一、實(shí)驗(yàn)原理在成熟的檸檬發(fā)酵液中大部分是檸檬酸，但還含有部分山芋粉渣、菌絲體以及其它的代謝產(chǎn)物的雜質(zhì)。檸檬酸的提取是檸檬酸生產(chǎn)中極為重要的工序，檸檬酸的提取方法有鈣鹽沉淀法、離子交換法、電滲折法及萃取法等，目前廣泛用于國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的是鈣鹽沉淀法，其原理是利用檸檬酸與碳酸鈣反應(yīng)形成不溶性的檸檬酸鈣而將檸檬酸從發(fā)酵液中分離出來(lái)，并利和硫酸酸解從而獲得檸檬酸粗液，經(jīng)活性炭、離子交換樹(shù)脂的脫色及脫鹽，再經(jīng)濃縮，結(jié)晶干燥等精制后獲得檸檬酸成品，其中和及酸解反應(yīng)式如下：中和：2C6H8O7?H2O+3CaCO3-Ca（CHO）.-4HOI+3COf+HO36572222酸解：C°（CHO）c-4HO+3HSO+4HO—2CHO-HO+3CaSO-2HOIa365722242687242本實(shí)驗(yàn)以提取檸檬酸鈣鹽為主。二、實(shí)驗(yàn)器材（一）實(shí)驗(yàn)材料1.檸檬酸發(fā)酵液、輕質(zhì)碳酸鈣（200目）、0.1429N氫氧化鈉溶液、1%酚酞指示劑（二）儀器設(shè)備1.制備式離心分離機(jī)、滴定管、烘箱三、實(shí)驗(yàn)步驟發(fā)酵液預(yù)處理：將成熟的檸檬酸發(fā)酵液加熱至80°C，保溫10?20分鐘，趁熱進(jìn)行離心分離，取濾液備用并記錄濾液總體積。發(fā)酵液總酸的測(cè)定：取濾液1ml，加5ml蒸餾水于潔凈三角瓶人加入1滴酚酞指示劑用0.1429NNaOH滴定于初顯紅色為止，記下NaOH的消耗量。中和：將發(fā)酵濾液加熱至70C，同時(shí)加入發(fā)酵液總酸量72%的輕質(zhì)碳酸鈣進(jìn)行中和至pH5.8，殘酸0.2%?0.3%，并于85C條件下攪拌并保溫30min。離心