間接紅細胞凝集試驗診斷血吸蟲病

間接紅細胞凝集試驗診斷血吸蟲病第1頁，共28頁。間接紅細胞凝集試驗

（Indirecthaemagglutinationtest,IHA）

以紅細胞為載體吸附預先制備的特異性抗原或抗體作為試劑檢測標本中的相應抗體或抗原血清學方法特點：抗原與其抗體之間的特異性反應紅細胞凝集現象第2頁，共28頁。國外最早于1955年應用于檢測馬抗血清國內陶義訓等（1958）首先應用于診斷日本血吸蟲病楊贊元等（1976）應用冰凍干燥方法制備試劑第3頁，共28頁。一、基本概念

（一）凝集反應

是指細菌、細胞等顆粒性抗原加入相應抗體，并在適量電解質存在的條件下，兩者特異性結合且進一步凝聚成肉眼可見的小塊。

凝集反應分為直接凝集和間接凝集反應。第4頁，共28頁。（二）間接紅細胞凝集試驗

原理日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原載體顆粒綿羊、家兔、雞的紅細胞及O型人紅細胞致敏的新鮮紅細胞保存時間短，且易變脆、溶血和污染，只能使用2～3天致敏前將紅細胞醛化，可長期保存而不溶血常用的醛類有甲醛、戊二醛、丙酮醛第5頁，共28頁。（三）間接血凝的類型

IHA：用抗原致敏紅細胞檢測標本中抗體反向間接血凝試驗：用特異性抗體致敏紅細胞檢測標本中的相應抗原間接血凝抑制試驗反向間接血凝抑制試驗第6頁，共28頁。（正向）間接凝集反應第7頁，共28頁。反向間接凝集反應第8頁，共28頁。間接凝集抑制反應第9頁，共28頁。（一）血吸蟲蟲卵抗原制備

分離蟲卵→脫水、脫酯干燥→研磨成細粉→凍融→超聲粉碎→普通離心→高速離心。經離心后的上清液，即為蟲卵抗原原液，保存于-20℃中備用。二、凍干致敏紅細胞的制備第10頁，共28頁。理想抗原敏感性高，特異性強，能區(qū)別不同感染度，能區(qū)別現在感染還是過去感染，價廉。但目前還沒有，今后可能依靠雜交瘤技術、DNA技術而獲得理想的抗原。第11頁，共28頁。取人“O”型血紅細胞3份（不同個體）混合，用生理鹽水洗滌。置冰浴內，將戊二醛溶液慢慢滴入紅細胞懸液中，邊加邊搖，醛化1h。用1/10000的柳硫汞蒸餾水配成10%的紅細胞懸液，置于4℃?zhèn)溆?。（二）紅細胞醛化第12頁，共28頁。醛化紅細胞優(yōu)點克服了個體差異，保證實驗重復性延長紅細胞的保存時間，在4℃可保存1年避免操作過程中因振蕩、低滲、凍融使紅細胞破裂、溶血第13頁，共28頁。取1/10000鞣酸溶液與等量2.5%紅細胞懸液混勻，置于37℃中15min，并不斷搖動。洗滌，去除多余的鞣酸。（三）紅細胞鞣化第14頁，共28頁。鞣化紅細胞的優(yōu)點鞣化后紅細胞易吸附蛋白抗原。第15頁，共28頁。取蟲卵抗原原液1:100稀釋，與2.5%的鞣化紅細胞等量混合，置于37℃水浴中30min，并不斷搖動，然后離心，洗滌，去除多余抗原。用含有5%蔗糖及1%正常兔血清（56℃滅活）的pH7.2PBS保護液，配成10%濃度的致敏紅細胞懸液。致敏效果與抗原的活性及純度有關。（四）紅細胞致敏第16頁，共28頁。將上述致敏紅細胞懸液搖勻，分裝于2ml安瓿內。每支0.4ml，立即放入-40℃冰箱冰凍，待全部分裝完畢后，移入冰凍干燥機內，冰凍干燥約24h，干燥后封口，保存于4℃中備用。冰凍干燥具有高科技含量不是單純干燥，在冰凍狀態(tài)下使水分子升華，不使紅細胞破裂，不影響抗原活性。（五）致敏紅細胞的冰凍干燥第17頁，共28頁。三、操作步驟（一）取生理鹽水2ml，加入裝有冰凍干燥紅細胞的安瓿中，配成2.0%的紅細胞懸液，搖勻。（二）在“V”型微量血凝反應板的第1孔中加生理鹽水100μl,第2、3孔中各加25μl。第18頁，共28頁。（三）第1孔中加待檢血清25μl，混勻后吸出25μl加于第2孔中，在第2孔中混勻后，吸出25μl加于第3孔中，混勻后棄去25μl。此時第1、2、3孔中的血清稀釋度依次為1:5、1:10、1:20。（四）在第2、第3孔中各加致敏紅細胞懸液25μl，將反應板放在振蕩器上振蕩1min，室溫下靜置45min，觀察反應結果。第19頁，共28頁。四、反應標準（一）陰性反應：紅細胞全部下沉在凹底部，形成緊密的圓點，周圍整齊清晰。（二）陽性反應：待檢者血清以1:10稀釋度出現凝集反應為陽性起點第20頁，共28頁。（三）反應強度“-”：紅細胞全部下沉在凹底部，形成緊密的圓點，周圍整齊清晰“+”：多數紅細胞下沉在凹底部形成圓點，周圍可見少量凝集紅細胞“++”：凹底部可見明顯的紅點，凝集紅細胞在底部形成小薄層第21頁，共28頁?！?++”：凹底部可見很弱的紅點，紅細胞呈疏松的顆粒凝集“++++”：紅細胞呈明顯的顆粒凝集，均勻散布于凹底部周圍形成薄層，有時呈皺褶狀效價(滴度)：發(fā)生凝集現象最高的血清稀釋度。第22頁，共28頁。五、影響因素及注意事（一）試劑：保存、對照、效價、搖勻。（二）反應板：“V”型，底角應為90°。反復沖洗。（三）毛細吸管：校正、垂直。（四）血清樣本：新鮮為宜，保存在冰盒內。溶血樣本將影響測定結果的準確性。第23頁，共28頁。（五）生理鹽水：用于稀釋IHA試劑、陽參、陰參、血清樣本的生理鹽水必須保持無菌。（六）判斷反應結果：在判斷反應結果時應在反應板下面襯一張白紙，使反應結果更加清晰。先觀察空白對照、陰參、陽參，再觀察樣本。第24頁，共28頁。六、評價IHA的優(yōu)點：敏感性高，陽性符合率在90%以上，對糞檢陽性者可高達95%，假陽性率一般不超過4%。操作方便，用血量少，便于現場使用。試劑生產方便，成本低，符合國情。IHA的缺點：特異性欠強、與其它吸蟲有較高的交叉反應。交叉反應主要在肺吸蟲感染，可達50%以上。第25頁，共28頁。七、實用價值（一）可作為血吸蟲病的輔助診斷。無血治史者和治療史3年以上者，IHA陽性可給予擴大治療。（二）在血吸蟲病流行區(qū)，可作為查病的過篩方法。（三）可作為血清流行病學調查及疫情監(jiān)測的方法第26頁，共28頁。

謝謝大家！第27頁，共28頁。內容梗概間接紅細胞凝集試驗診斷血吸蟲病。間接紅細胞凝集試驗

（Indirecthaemagglutinationtest,IHA）。國外最早于1955年應用于檢測馬抗血清。是指細菌、細胞等顆粒性抗原加入相應抗體，并在適量電解質存在的條件下，兩者特異性結合且進一步凝聚成肉眼可見的小塊。凝集反應分為直接凝集和間接凝集反應。致敏的新鮮紅細胞保存時間短，且易變脆、溶血和污染，只能使用2～3天。經離心后的上清液，即為蟲卵抗原原液，保存于。用1/10000的柳硫汞蒸餾水配成10%的紅細胞懸液，置于4℃?zhèn)溆?。延長紅細胞的保存時間，在4℃可保存1年。取1/10000鞣酸溶液與等量2.5%紅細胞懸液混勻，置于37℃中15min，并不斷搖動。用含有5%蔗糖及1%正常兔血清（56℃滅活）的pH7.2PBS保護液，配成10%濃度的致敏紅細胞懸液。（