砷鹽檢查法操作規(guī)程

文件名稱砷鹽檢查法操作規(guī)程文件編碼版本號制訂人審核人批準(zhǔn)人制訂日期審核日期批準(zhǔn)日期頒發(fā)部門GMP辦公室實施日期分發(fā)部門質(zhì)量部變更記錄變更原因及目的：1.中國藥典版本的更新；2.生產(chǎn)能力的擴(kuò)容；3.為了更好的執(zhí)行《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》。目的：制訂砷鹽檢查法操作規(guī)程，明確其檢查法的操作。依據(jù)：《中華人民共和國藥典》2010年版；《中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》2010年版。范圍：砷鹽檢查法的操作。責(zé)任：質(zhì)檢室主任、化驗員。內(nèi)容：簡述1.1砷鹽檢查法（《中國藥典》2010年版二部附錄訓(xùn)J）適用于藥品中微量砷鹽（以A計）的限量檢查。S1.2砷鹽檢查法中的第一法（古蔡氏法）用作藥品中砷鹽的限量檢查；第二法（二乙基二硫代氨基甲酸銀法）既可檢查藥品中砷鹽的限量，又可以作砷鹽的含量測定；兩法并列，應(yīng)根據(jù)《中國藥典》品種項下規(guī)定的方法選用。古蔡氏法是利用金屬鋅與酸作用產(chǎn)生新生態(tài)的氫與藥品中微量亞砷酸鹽反應(yīng)生成具有揮發(fā)性的砷化氫，遇溴化汞試紙產(chǎn)生黃色至棕色的砷斑，與同一條件下定量標(biāo)準(zhǔn)砷溶液所產(chǎn)生的砷斑比較，以判定砷鹽的限量。二乙基二硫代氨基甲酸銀法是將生成的砷化氫氣體導(dǎo)入盛有二乙基二硫代氨基甲酸銀試液的管中，使之還原為紅色膠態(tài)銀，與同一條件下定量的標(biāo)準(zhǔn)砷溶液所制成的對照液比較，或在510nm的波長處測定吸光度，以判定含砷鹽的限度或測定含量。儀器與用具見下圖。

圖1第一法儀器裝置 圖2第二法儀器裝置（古蔡氏法） （二乙基二硫代氨基甲酸銀法）第一法儀器裝置說明：A為100ml標(biāo)準(zhǔn)磨口錐形瓶；B為中空的標(biāo)準(zhǔn)磨口塞；上連導(dǎo)氣管C（外徑8.0mm，內(nèi)徑6mm）,全長約180mm；D為具孔的有機(jī)玻璃旋塞，其上部為圓形平面，中央有一圓孔，孔徑與導(dǎo)氣管C的內(nèi)徑一致,其下部孔徑與導(dǎo)氣管C的外徑相適應(yīng)，將導(dǎo)氣管C的頂端套入旋塞下部孔內(nèi)，并使管壁與旋塞的圓孔相吻合，黏合固定；E為中央具有圓孔（孔徑6.0mm）的有機(jī)玻璃旋塞蓋，與D緊密吻合。第二法儀器裝置說明：A為100ml標(biāo)準(zhǔn)磨口錐形瓶；B為中空的標(biāo)準(zhǔn)磨口塞，上連導(dǎo)氣管C（一端外徑為8mm，內(nèi)徑為6mm；另一端長為180mm，外徑為4mm，內(nèi)徑為1.6mm，尖端內(nèi)徑為1mm）。D為平底玻璃管（長為180mm，內(nèi)徑為10mm，于5.0ml處有一刻度）。2.1第一法（古蔡氏法）按《中國藥典》規(guī)定：有機(jī)玻璃旋塞D和E的孔徑應(yīng)與導(dǎo)氣管C內(nèi)徑一致，以免生成的色斑直徑不同，影響比色的準(zhǔn)確度；B磨口瓶，C管頂端與D、E有機(jī)玻璃旋塞塞蓋間應(yīng)緊密吻合，以防砷化氫泄漏。2.2第二法（二乙基二硫代氨基甲酸銀法）按《中國藥典》規(guī)定：B磨口塞應(yīng)密閉，以防砷化氫泄漏；與標(biāo)準(zhǔn)磨口塞B相連的導(dǎo)氣管C一端長度應(yīng)不低于80mm，便于裝醋酸鉛棉花達(dá)80mm，另一端長度應(yīng)不低于180mm，尖端的內(nèi)徑不可超過1mm,以保證產(chǎn)生的砷化氫吸收完全；D管的標(biāo)準(zhǔn)管與樣品管要一致，管內(nèi)徑，色澤，刻線要相同。試藥與試液3.1標(biāo)準(zhǔn)砷溶液精密量取105°C干燥至恒重的三氧化二砷0.132g，置1000ml量瓶中，加20%氫氧化鈉溶液5ml溶解后，用稀硫酸適量中和，再加稀硫酸10ml，用水稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。臨用前，精密量取貯備液10ml，置1000ml量瓶中，加稀硫酸10ml，用水稀釋至刻度，搖勻，即得（每1ml相當(dāng)于1“g的As）。碘化鉀試液按《試液配制標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》規(guī)定，應(yīng)臨用新制。酸性氯化亞錫試液按《試液配制標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》規(guī)定，配成后3個月即不適用。乙醇制溴化汞試液按《試液配制標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》規(guī)定，應(yīng)置棕色磨口塞玻璃瓶內(nèi)，在暗處保存。溴化汞試紙取質(zhì)地較疏松的中速定量濾紙條浸入乙醇制溴化汞試液中，1h后取出，在暗處干燥，即得。本試紙宜置棕色磨口塞玻璃瓶內(nèi)保存。3.6鋅粒以能通過1號篩的細(xì)粒無砷鋅粒為宜，如使用鋅粒較大時，用量酌情增加，反應(yīng)時間亦應(yīng)延長為1h。醋酸鉛棉花取脫脂棉，浸入醋酸鉛試液與水的等容混合液中，濕透后，瀝去過多的溶液，并使之疏松，在100C以下干燥后，貯于磨口塞玻璃瓶中備用。二乙基二硫代氨基甲酸銀試液按《試液配制標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》規(guī)定。本液應(yīng)置棕色玻璃瓶中，密塞，置陰涼處保存。操作方法第一法（古蔡氏法）標(biāo)準(zhǔn)砷斑的制備4.1.1.1裝置的準(zhǔn)備取醋酸鉛棉花適量（60~100mg）撕成疏松狀，每次少量，用細(xì)玻璃棒均勻地裝入導(dǎo)氣管C中，松緊要適度，裝管高度60?80mm。用玻璃棒夾取溴化汞試紙1片（其大小以覆蓋D端口徑而不露出平面外為宜），置旋塞D頂端平面上，蓋住孔徑，蓋上旋蓋E并旋緊。4.1.1.2精密量取標(biāo)準(zhǔn)砷溶液加1,置A瓶中，加鹽酸5ml與水21ml，再加碘化鉀試液5ml與酸性氯化亞錫試液5滴，在室溫放置10分鐘后，加鋅粒2g,立即將準(zhǔn)備好的導(dǎo)氣管C密塞于A瓶上，并將A瓶置25?40°C水浴中反應(yīng)45分鐘，取出溴化汞試紙，即得。若供試品需經(jīng)有機(jī)破壞后再行檢砷，則應(yīng)精密量取標(biāo)準(zhǔn)砷溶液2ml代替供試品，照該品種項下規(guī)定的方法處理后，依法制備標(biāo)準(zhǔn)砷斑。4.1.2檢查法取按各品種項下規(guī)定方法制成的供試液，置A瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)砷斑的制備，自“再加碘化鉀試液5ml”起依法操作。將生成的砷斑與標(biāo)準(zhǔn)砷斑比較，即得。4.2第二法（二乙基二硫代氨基甲酸銀法）標(biāo)準(zhǔn)砷對照液的制備4.2.1.1裝置的準(zhǔn)備取醋酸鉛棉花適量（80?100mg），撕成疏松狀，每次少量，用玻璃棒均勻地裝入導(dǎo)氣管C中，松緊要適度，裝管高度約80mm。精密量取二乙基二硫代氨基甲酸銀試液5ml，置D管中。4.2.1.2精密量取標(biāo)準(zhǔn)砷溶液加l,置A瓶中，加鹽酸5ml與水21ml,再加碘化鉀試液5ml與酸性氯化亞錫試液5滴，在室溫放置10min后，加鋅粒2g,立即將準(zhǔn)備好的導(dǎo)氣管C與A瓶密塞，使生成的砷化氫氣體導(dǎo)入D管中，并將A瓶置25?40C水浴中反應(yīng)45min,取出D管，添加氯仿至刻度，混勻，即得。若供試品需經(jīng)有機(jī)破壞后再行檢砷，則應(yīng)精密量取標(biāo)準(zhǔn)砷溶液2ml代替供試品，照該品種項下規(guī)定的方法同法處理后，依法制備標(biāo)準(zhǔn)砷對照液。4.2.2檢查法準(zhǔn)備好C管裝置，取照該品種項下規(guī)定方法制成的供試液，置A瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)砷對照液的制備，自“再加碘化鉀試液5ml”起依法操作。將所得溶液與標(biāo)準(zhǔn)砷對照液同置白色背景上，從D管上方向下觀察，比較，即得。必要時，可將所得溶液與標(biāo)準(zhǔn)砷對照液分別轉(zhuǎn)移至1cm吸收池中，用分光光度計，在510nm的波長處，以二乙基二硫代氨基甲酸銀試液作空白，分別測定吸光度。注意事項使用儀器和試液等照本法檢查，均不應(yīng)生成砷斑，或經(jīng)空白試驗至多生成僅可辨認(rèn)的斑痕。新購置的儀器裝置，在使用前應(yīng)檢查是否符合要求?？蓪⑺褂玫膬x器裝置依法制備標(biāo)準(zhǔn)砷斑，所得砷斑應(yīng)呈色一致。同一套儀器應(yīng)能辨別出標(biāo)準(zhǔn)砷溶液1.5ml與2.0ml所呈砷斑的深淺。制備標(biāo)準(zhǔn)砷斑或標(biāo)準(zhǔn)砷對照液，應(yīng)與供試品檢查同時進(jìn)行。因砷斑不穩(wěn)定，反應(yīng)中應(yīng)保持干燥及避光，并立即比較。標(biāo)準(zhǔn)砷溶液應(yīng)于實驗當(dāng)天配制，標(biāo)準(zhǔn)砷貯備液存放時間一般不宜超過一年。5.4第一法（古蔡氏法）反應(yīng)靈敏度約為0.75mg（以A計），砷斑色澤S的深度隨砷化氫的量而定，《中國藥典》規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)砷斑為2ml標(biāo)準(zhǔn)砷溶液（相當(dāng)于2mg的A）所形成的色斑，此濃度得到的砷斑色度適中，清晰，便于分S辨。供試品規(guī)定含砷限量不同時，采用改變供試品取用量的方法來適應(yīng)要求，而不采用改變標(biāo)準(zhǔn)砷溶液取量的辦法。5.5藥品中存在的微量砷常以三價的亞砷酸鹽或五價的砷酸鹽存在，五價狀態(tài)的砷生成砷化氫比三價砷慢，故先加入碘化鉀和氯化亞錫為還原劑，使五價砷還原為三價砷。如供試品中存在銻鹽，將干擾砷鹽檢查，所以本法不適用供試品為銻鹽的砷鹽檢查。但在《中國藥典》規(guī)定的實驗條件下，100mg的銻存在不至于干擾測定。實驗中加入氯化亞錫不僅有效的抑制銻的干擾，防止銻化氫與溴化汞試紙作用生成銻斑或二乙基二硫代氨基甲酸銀試液反應(yīng)，干擾砷鹽檢查，還可與鋅作用，在鋅粒表面形成鋅錫齊，起去極化作用，從而使氫能均勻連續(xù)地發(fā)生，有利于砷斑的形成。5.7供試品和鋅粒中可能含有少量硫化物，在酸性溶液中產(chǎn)生HS氣體，2干擾實驗，故用醋酸鉛棉花吸收除去HS,因此，導(dǎo)氣管中的醋酸鉛棉花，要2保持疏松、干燥，不要塞入近下端。制備溴化汞試紙所用濾紙的質(zhì)量，對生成砷斑的色澤有影響，用定性濾紙，所顯砷斑色調(diào)較暗，深淺梯度無規(guī)律；用定量濾紙質(zhì)地疏松者，所顯砷斑色調(diào)鮮明，梯度規(guī)律，因此必須選用質(zhì)量較好，組織疏松的中速定量濾紙；溴化汞紙質(zhì)一般宜新鮮制備。鋅粒大小影響反應(yīng)速度，為使反應(yīng)速度及產(chǎn)生砷化氫氣體適宜，需選用粒徑2mm左右的鋅粒。反應(yīng)溫度一般控制在30°C左右，冬季可置水浴中。如反應(yīng)太快，宜適當(dāng)降低反應(yīng)溫度，使砷化氫氣體能被均勻吸收。如供試品為鐵鹽，需先加酸性氯化亞錫試液，將高鐵離子還原為低價鐵而除去干擾。如枸櫞酸鐵銨的砷鹽檢查。有機(jī)藥物中的砷鹽檢查可溶于水的脂肪族有機(jī)酸如枸櫞酸、乳酸及其鹽類，氨基已酸與葡萄糖酸鈣等，一般可不經(jīng)有機(jī)破壞而直接依法檢查砷鹽；多數(shù)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的有機(jī)藥物，因砷與雜環(huán)分子可能以共價鍵鍵合，需先行有機(jī)破壞，否則檢出結(jié)果偏低或難以檢出。有機(jī)破壞時，所用試劑的含砷量如超過lpg,除另有規(guī)定外，應(yīng)取同量的試劑加入砷標(biāo)準(zhǔn)液一定量，按供試品同樣處理，制備標(biāo)準(zhǔn)砷斑，再與供試品所生成砷斑的顏色比較。如供試品為硫化物、亞硫酸鹽或硫代磷酸鹽等，則在酸性溶液中可生成大量硫化氫或二氧化硫氣體，干擾檢查；可加硝酸使氧化成磷酸鹽以除去干擾，如硫代硫酸鈉的砷鹽檢查。在二乙基二硫代氨基甲酸銀法中，需要加入一定量的有機(jī)堿以中和反應(yīng)中的二乙基二硫代氨基甲酸；USP配制成0.5%二乙基二硫代氨基甲酸銀的吡啶溶液，其缺點是吡啶有惡臭；《中國藥典》2010年版采用含1.8%三乙胺和0.25%二乙基二硫代氨基甲酸銀的三氯甲烷溶液，呈色穩(wěn)定性及試劑穩(wěn)定性均好，低毒，無臭，與砷化氫產(chǎn)生的顏色在510nm的波長處有最大吸收。如遇室溫低，按法操作，標(biāo)準(zhǔn)砷對照液不顯色，可將D管置25?40C水浴加溫使顯色。二乙基二硫代氨基甲酸銀試液在配制后兩周內(nèi)穩(wěn)定。當(dāng)供試液中含砷（AS）0.75?7.5pg時顯色反應(yīng)的線性關(guān)系良好，2h內(nèi)穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。S本法操作時由于砷化氫氣體導(dǎo)入盛有準(zhǔn)確5ml的二乙基二硫代氨基甲酸銀試液中，在25?40C水浴中反應(yīng)45min后，有部分三氯甲烷揮發(fā)，比色前應(yīng)添加三氯甲烷至5.00ml，搖勻，因二乙基二硫代氨基甲酸銀試液帶淺黃綠色，測吸光度時要用此試液作空白。記錄與計算記錄必須記錄采用的方法，供試品取樣量，標(biāo)準(zhǔn)砷溶液取用量，操作過程，使用特殊試劑、試液的名稱和用量，實驗過程中出現(xiàn)的現(xiàn)象及實驗計算標(biāo)準(zhǔn)砷溶液濃度的計算lmol的三氧化二砷質(zhì)量為197.82g，含砷（A）2X74.92g，稱取三氧化S二砷0.132g溶于1000ml溶液中配成的貯備液，每1ml含A量為：S2x74.92x0.132x1000二。⑴疇197.8x1000貯備液定量稀釋100倍后所得標(biāo)準(zhǔn)砷溶液，每1ml含A量為1.0“g。S砷限量計算進(jìn)行限量檢查時，取標(biāo)準(zhǔn)砷溶液2.0ml制成對照液，與供試品溶液在相同條件下處理比較砷斑或吸收液的深淺，從而確定砷含量是否超過規(guī)定，砷限量可用下式計算：砷限量%二標(biāo)準(zhǔn)砷溶液體積（ml）x標(biāo)準(zhǔn)砷溶液濃度（g/ml）%100%供試品量（g）如取標(biāo)準(zhǔn)砷溶液2.0ml，標(biāo)準(zhǔn)砷溶液濃度0.000001g/ml,供試品取樣1.0g；則砷限量%=2x0.000001X100%=0.0002