發(fā)酵2項(xiàng)目二：培養(yǎng)基滅菌課件

項(xiàng)目二培養(yǎng)基及設(shè)備滅菌2006年8月15日,國家食品藥品監(jiān)督管理局召開新聞發(fā)布會(huì)，通報(bào)了對(duì)安徽華源生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液（欣弗）引發(fā)的藥品不良事件調(diào)查結(jié)果：現(xiàn)已查明，安徽華源生物藥業(yè)有限公司違反規(guī)定生產(chǎn)，是導(dǎo)致這起不良事件的主要原因。經(jīng)查，該公司2006年6月至7月生產(chǎn)的克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液未按批準(zhǔn)的工藝參數(shù)滅菌，降低滅菌溫度，縮短滅菌時(shí)間，增加滅菌柜裝載量，影響了滅菌效果。經(jīng)中國藥品生物制品檢定所對(duì)相關(guān)樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明，無菌檢查和熱源檢查不符合規(guī)定。

由此可見，當(dāng)前無論是食品、藥品或生物產(chǎn)品，在生產(chǎn)過程都要重視滅菌和消毒工作，確保安全。引言概述滅菌：是指用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物包括營養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽孢和孢子的方法。消毒：是指用物理或化學(xué)方法殺死物料、容器、器具內(nèi)外的病原微生物的措施。一般只能殺死營養(yǎng)細(xì)胞而不能殺死細(xì)菌芽孢。巴氏消毒法消毒牛奶加熱60℃維持30min。在工業(yè)中一般都籠統(tǒng)地稱為殺菌或滅菌。滅菌是為了保證進(jìn)行純培養(yǎng)（純種）發(fā)酵。物理滅菌熱力滅菌（如干熱滅菌、濕熱滅菌、流通蒸汽滅菌）、射線滅菌、超聲波消毒和微波消毒等?；瘜W(xué)滅菌液體滅菌（如75%乙醇、1%聚維酮碘溶液、0.1%～0.2%新潔爾滅、2%左右的酚或煤酚皂溶液）和氣體滅菌（如臭氧、環(huán)氧乙烷、甲醛、丙二醇、甘油和過氧乙酸蒸汽等）。單元知識(shí)一滅菌方法熱力滅菌干熱滅菌、濕熱滅菌射線滅菌紫外線、陰極射線、X射線、γ射線超聲波消毒和微波消毒等

物理滅菌干熱滅菌：是指相對(duì)濕度在20％以下的高熱，有火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌。濕熱滅菌：又成為高壓蒸汽滅菌。在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)生產(chǎn)中，對(duì)于培養(yǎng)基、管道、設(shè)備的滅菌，通常采用蒸汽加熱到一定的溫度，并保溫一段時(shí)間的滅菌方法，稱之為濕熱滅菌。熱力滅菌火焰灼燒滅菌?；鹧孀茻m用于接種環(huán)、接種針和金屬用具如鑷子等，試管口和瓶口，涂布用玻璃棒。熱空氣滅菌。利用高溫干燥空氣（160－170℃

）加熱滅菌1－2h，適用于玻璃器皿和培養(yǎng)皿等。原理加熱使蛋白質(zhì)變性，與水的含量有關(guān)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞含水量越大，凝固越快。干熱法通常用紫外線、高能量的電磁波等原理：紫外線波長在260nm殺菌力強(qiáng)。此段波長易被細(xì)胞中核酸吸收，可產(chǎn)生臭氧和過氧化氫。殺菌效力與強(qiáng)度和時(shí)間的乘積成正比。射線滅菌利用頻率在20～200kHz的聲波作用下，使細(xì)菌細(xì)胞機(jī)械破裂和原生質(zhì)迅速游離，達(dá)到消毒目的。如超聲洗手器，用于手的消毒。超聲洗滌機(jī)，用于注射器的清潔和初步的消毒處理。超聲波消毒原理：應(yīng)用化學(xué)制劑破壞細(xì)菌代謝機(jī)能殺菌劑如重金屬離子；抑菌劑如磺胺類及多數(shù)抗生素。注意：與藥品的濃度高低，時(shí)間長短，微生物種類以及微生物所處的環(huán)境有關(guān)。常用化學(xué)殺菌劑有：乙醇、醋酸、石碳酸福爾馬林、升汞、高錳酸鉀、新潔爾滅等化學(xué)滅菌0.%~0.25%KMnO4溶液、0.5%~1%漂白粉溶液、75%酒精、0.25%新潔爾滅、10%甲醛溶液、苯酚溶液、來蘇爾化學(xué)滅菌化學(xué)物質(zhì)名稱有效濃度化學(xué)物質(zhì)名稱有效濃度新潔爾滅(苯扎溴銨)0.25%甲醛37%杜滅芬0.25%戊二醛2%高錳酸鉀0.1%-0.25%苯酚0.1%-0.15%漂白粉5%過氧乙酸0.02%-0.2%酒精75%焦碳酸二乙酯0.01%-0.1%煤酚皂（來蘇爾）1%—5%

化學(xué)滅菌是指從培養(yǎng)基中殺滅有生活能力的細(xì)菌營養(yǎng)體及其孢子，或從中將其除去。工業(yè)規(guī)模的液體培養(yǎng)基滅菌，殺滅雜菌比除去雜菌更為常用。工業(yè)上培養(yǎng)基滅菌使用的方法是濕熱滅菌。濕熱滅菌簡便、有效、經(jīng)濟(jì)。達(dá)到要求的無菌程度（N=10-3）即滅菌1000次，有一次是失敗的，殘留了一個(gè)活菌體。要求滅菌后達(dá)到絕對(duì)無菌是很難做到的，也是不必要的。因此在工程設(shè)計(jì)中常取N=10-3。這是工業(yè)上對(duì)培養(yǎng)基要求達(dá)到無菌程度標(biāo)準(zhǔn)。單元知識(shí)二培養(yǎng)基滅菌概述對(duì)數(shù)殘留定律：在滅菌過程中，微生物在高溫高濕的環(huán)境中的熱死亡速率與任一瞬間殘存的活菌數(shù)成正比。熱死動(dòng)力學(xué)方程

-dN/dt=KNN--殘存的活菌數(shù)（個(gè)）t--滅菌時(shí)間（min）

K--殺菌速率常數(shù)（min-1）或叫死亡速率常數(shù)。K是判斷微生物受熱死亡難易程度的基本依據(jù)。

dN/dt--菌的瞬時(shí)變化率，即死亡速率。理論滅菌時(shí)間的確定一、微生物的熱死動(dòng)力學(xué)K值因不同的微生物種類不同、不同的生理狀態(tài)、不同的外界環(huán)境，差別很大，實(shí)質(zhì)上，K值是微生物熱阻的一種表示形式，熱阻是指微生物在某一特定條件（主要是溫度和加熱方式）下的致死時(shí)間。微生物的熱阻越大，K值也越大。例如：芽孢在121℃時(shí)，K=60/s；營養(yǎng)體，在121℃，k=60～6*1010/s。

需注意的幾個(gè)問題對(duì)于NS，如果取NS=0，那么t=∞，這顯然是與現(xiàn)實(shí)情況不符。通常取NS=10-3，這個(gè)數(shù)值理解可以理解為滅菌1000次，有一次是失敗的，殘留了一個(gè)活菌體。要求滅菌后達(dá)到絕對(duì)無菌是很難做到的，也是不必要的。因此在工程設(shè)計(jì)中常取N=10-3。這是工業(yè)上對(duì)培養(yǎng)基要求達(dá)到無菌程度標(biāo)準(zhǔn)。這個(gè)數(shù)值的取值的大小，也間接反應(yīng)了該生產(chǎn)過程中的技術(shù)管理水平。N0，NS如何取值？需注意的幾個(gè)問題微生物的熱死滅動(dòng)力學(xué)接近一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，滅菌溫度與菌死亡的反應(yīng)速度常數(shù)關(guān)系可用K=Ae-E/RTK----殺菌速率常數(shù)（死亡速率常數(shù)）（min-1）A----頻率因子（阿累尼烏斯常數(shù)），因菌種的不同而異。E-----活化能（J/mol）T-----絕對(duì)溫度（K）T=t+273.15R-----氣體常數(shù)8.36J/mol.K(或1.98cal/mol.K)e=2.718阿累尼烏斯方程分子在所指的條件下進(jìn)行反應(yīng)所必需具備的能量，這個(gè)能量是活化能，活化能在這里指微生物被殺滅必須獲得的能量。從阿累尼烏斯方程，可以得出活化能E的大小對(duì)K值有重大影響，其他條件相同時(shí)E愈高，K值愈低，熱死速率愈慢。K是E和T的函數(shù)，K對(duì)T的變化率與E有關(guān)。反應(yīng)的活化能E愈高，溫度T的變化對(duì)K的影響愈大。同一種微生物在不同的溫度下，k值也不同。由滅菌時(shí)間公式和阿累尼烏斯方程可以看出，滅菌溫度越高，k值越大，需滅菌時(shí)間越短。如嗜熱脂肪芽孢桿菌Fs1518在104℃時(shí)滅菌k值為0.03421min-1，而在131℃時(shí)k值15min-1。二、高溫短時(shí)滅菌法濕熱滅菌時(shí)，微生物被熱死的同時(shí)，培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分也遭到了一定的破壞。特別是氨基酸和維生素。培養(yǎng)基組分的破壞，是由兩個(gè)基本類型的反應(yīng)引起的：培養(yǎng)基中不同營養(yǎng)成分間的相互作用；對(duì)熱不穩(wěn)定的組分如氨基酸和維生素等的分解。在熱的作用下某些營養(yǎng)成分還可能因受熱而相互之間發(fā)生反應(yīng)，造成培養(yǎng)基中原有營養(yǎng)成分的數(shù)量變化，因而影響培養(yǎng)基質(zhì)量。二、高溫短時(shí)滅菌法例如：還原糖與氨基酸、肽、蛋白質(zhì)等發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成5-羥甲基糠醛和類黑精。在對(duì)嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子進(jìn)行殺滅時(shí)，達(dá)到相同滅菌效果（N/N0=10-16）時(shí)，不同的滅菌溫度對(duì)維生素B1損失影響很大。二、高溫短時(shí)滅菌法滅菌溫度（?C）達(dá)到滅菌程度的時(shí)間（min）維生素B1的損失（%）100110120130140150843757.60.8510.1070.01599.9989271031滅菌溫度、時(shí)間和維生素B1損失的關(guān)系二、高溫短時(shí)滅菌法達(dá)到相同滅菌效果，T越高，所需t越短采用高溫短時(shí)（HTST）滅菌效果好，既能達(dá)到滅菌的效果，又可以減少營養(yǎng)成分的破壞。

二、高溫短時(shí)滅菌法pH值6.0~8.0時(shí)，微生物耐熱性好，最不易死亡pH<6.0時(shí)，微生物比較容易死亡。所以培養(yǎng)基的pH越低，所需的時(shí)間也越短，濕熱滅菌效果好。pH值三、影響培養(yǎng)基滅菌的因素高濃度的有機(jī)物會(huì)包于細(xì)胞周圍，形成一層薄膜，影響熱的傳導(dǎo)。而高濃度的鹽類、色素則削弱其耐熱性，滅菌較易。培養(yǎng)基成分三、影響培養(yǎng)基滅菌的因素

泡沫泡沫中的空氣形成隔熱層，使熱量難以滲透進(jìn)去，殺死其中的雜菌。顆粒小，容易滅菌，顆粒大，則難滅菌。顆粒三、影響培養(yǎng)基滅菌的因素分批滅菌連續(xù)滅菌空罐滅菌將培養(yǎng)基置于反應(yīng)器中用蒸汽加熱，達(dá)到預(yù)定滅菌溫度后維持一定時(shí)間，再冷卻到發(fā)酵溫度，然后接種發(fā)酵將培養(yǎng)基在罐外連續(xù)進(jìn)行加熱、維持和冷卻然后進(jìn)入空消后的發(fā)酵罐的殺菌方法就是連續(xù)滅菌。四、滅菌操作分批滅菌包括升溫、保溫、降溫三個(gè)過程分批滅菌分批滅菌分批滅菌操作要點(diǎn)打開所有的排氣閥門，三路進(jìn)蒸汽當(dāng)培養(yǎng)基的溫度升到滅菌溫度時(shí)，進(jìn)入保溫操作階段，此時(shí)要求與反應(yīng)器相連的所有管道處于兩個(gè)狀態(tài)：進(jìn)汽或出汽，目的是對(duì)管道進(jìn)行滅菌。保溫期間，要求罐壓：0.09-0.10MPa，溫度：118—121℃，時(shí)間：30min。滅菌結(jié)束后，需要立即引入無菌空氣，保證罐內(nèi)壓力后方可冷卻，目的是防止培養(yǎng)基的冷卻使罐內(nèi)形成負(fù)壓，易染菌。分批滅菌的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)分批滅菌不需其他設(shè)備，操作簡單易行。省去了連消設(shè)備和操作，節(jié)省了動(dòng)力。染菌的危險(xiǎn)性較小人工操作較方便對(duì)培養(yǎng)基中固體物質(zhì)含量較多時(shí)更為適宜缺點(diǎn)升溫慢、降溫也慢，增加了發(fā)酵前的準(zhǔn)備時(shí)間，延長了發(fā)酵周期，設(shè)備利用低，而且無法采用高溫短時(shí)滅菌。加熱、維持、降溫連續(xù)滅菌生培養(yǎng)液先在板式換熱器2內(nèi)進(jìn)行預(yù)熱，此處用到熱集成，即滅菌后的培養(yǎng)液作為加熱介質(zhì)，把熱量傳遞給生培養(yǎng)基，同時(shí)使滅菌后的培養(yǎng)液得到初步冷卻。在板式換熱器3內(nèi)預(yù)熱后的培養(yǎng)液被加熱到滅菌溫度。加熱源為蒸汽在維持段維持一段時(shí)間，完成滅菌在板式換熱器2處被預(yù)冷。在板式換熱器1處，經(jīng)過預(yù)冷的培養(yǎng)液繼續(xù)被冷卻水進(jìn)一步冷卻至設(shè)定溫度。連續(xù)滅菌連續(xù)滅菌連續(xù)滅菌連續(xù)滅菌連續(xù)滅菌優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)高產(chǎn)量縮短滅菌周期，營養(yǎng)成分破壞少蒸汽負(fù)荷均勻，鍋爐利用率高，操作方便發(fā)酵罐利用率高較易自動(dòng)控制，降低勞動(dòng)強(qiáng)度糖受蒸汽的影響較少缺點(diǎn)設(shè)備比較復(fù)雜，投資較大通入飽和蒸汽于未加培養(yǎng)基的罐體內(nèi)進(jìn)行濕熱滅菌。培養(yǎng)基的滅菌如果是采用連續(xù)滅菌法，則發(fā)酵