《CR法獲取目的基因》課件

2022/12/4PCR法獲取目的基因1第五章PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁(yè)!目錄PCR技術(shù)的創(chuàng)建PCR技術(shù)的原理PCR的反應(yīng)體系和條件PCR的類型和應(yīng)用PCR法獲取目的基因2022/12/42PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因3DNA，生命的藍(lán)圖《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁(yè)!一、PCR技術(shù)的創(chuàng)建——KaryB.Mullis1.Khorana等1971年提出在體外經(jīng)DNA變性、與適當(dāng)引物雜交、再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想。2.1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實(shí)現(xiàn)。3.1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)。4.1988年，臺(tái)PCR儀問(wèn)世。5.1989年美國(guó)《Science》雜志比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。6.1991年，HoffmanLaRoche以3億美元的代價(jià)從Cetus公司獲得全權(quán)開發(fā)權(quán)。2022/12/44PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁(yè)!DNA聚合酶引物引物1977年Sanger的測(cè)序技術(shù)M13噬菌體引物DNA聚合酶2022/12/45PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁(yè)!Taq

DNA聚合酶（來(lái)自于Thermusaquaticus，水生棲熱菌

)1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)2022/12/46PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁(yè)!（1）類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于寡核苷酸引物

（2）PCR過(guò)程：由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成①變性：94℃左右，使雙鏈DNA模板解離成為單鏈；②復(fù)性：55℃左右，引物與模板DNA單鏈互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合；③延伸：72℃左右，“模板-引物結(jié)合物”在DNA聚合酶作用下，以dNTP為原料，以靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成新的DNA鏈

（3）重復(fù)“變性--退火--延伸”的循環(huán)，可獲得大量的新DNA鏈，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板，從而指數(shù)級(jí)地獲得大量DNA產(chǎn)物，數(shù)小時(shí)內(nèi)可使目的基因的數(shù)量擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍。2022/12/47PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁(yè)!3.PCR技術(shù)的特點(diǎn)1）速度快，靈敏度高：經(jīng)過(guò)30輪循環(huán)，理論上目的產(chǎn)物的擴(kuò)增量達(dá)230個(gè)拷貝（109拷貝）2）特異性：引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵；引物設(shè)計(jì)的原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性，盡可能減少非特異性擴(kuò)增。3）操作簡(jiǎn)便易行：只需要數(shù)小時(shí)就可以用電泳法檢出1μg基因組DNA中僅含數(shù)個(gè)拷貝的模板序列。4）用途廣泛：生命學(xué)科、醫(yī)學(xué)工程、遺傳工程、疾病診斷、法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)2022/12/48PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁(yè)!PCR技術(shù)的基本過(guò)程(1)模板DNAdNTP引物BufferMg2+預(yù)變性模板DNAdNTP引物BufferMg2+TaqDNA聚合酶94℃5min2.基本程序2022/12/49PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁(yè)!PCR技術(shù)的基本過(guò)程(3)瓊脂糖凝膠電泳2022/12/410PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁(yè)!（1）PCR反應(yīng)成分模板（Template）①DNA模板濃度：一般為1g/mL左右；②單、雙鏈DNA；線狀DNA分子、環(huán)狀DNA分子均可；③DNA模板不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑等；模板的濃度和純度是影響PCR的重要因素：模板過(guò)多可能增加非特異性產(chǎn)物；純度不高會(huì)影響PCR的效率，甚至得不到產(chǎn)物。3.PCR反應(yīng)條件2022/12/411PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因12⑤引物內(nèi)部：尤其在3’端，不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）、二聚體（Dimer）；⑥兩引物之間：尤其在3’端，不能互補(bǔ)以防出現(xiàn)引物二聚體（crossdimer），減少產(chǎn)量；兩引物間最好不存在4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性；⑦引物5’端：對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大，可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、缺失或插入突變位點(diǎn)以及標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等。通常應(yīng)在5’端限制酶位點(diǎn)外再加3-4個(gè)保護(hù)堿基；⑧引物不產(chǎn)生falsepriming：不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ)，避免錯(cuò)誤引發(fā)PCR擴(kuò)增。3’5’3’5’限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列、啟動(dòng)子序列、定點(diǎn)突變、探針標(biāo)記《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因13反應(yīng)緩沖液（PCRbuffer）①組分：一般含10-50mmol/LTris·Cl(20℃下pH8.3-8.8)、50mmol/LKCl和適當(dāng)濃度的Mg2+；②Tris·Cl：在20℃時(shí)pH為8.3-8.8，但在實(shí)際PCR反應(yīng)中,pH為6.8-7.8；③50mmol/L的KCl：有利于引物的退火；④Buffer中加入5mmol/L的二硫蘇糖醇(DDT)或100μg/mL的牛血清白蛋白(BSA)，可穩(wěn)定酶活性；⑤加入T4噬菌體的基因32蛋白對(duì)擴(kuò)增較長(zhǎng)的DNA片段有利；⑥各種TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的一些緩沖液?！禖R法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁(yè)!dNTP（4種三磷酸脫氧核苷酸）①濃度：20-200μmol/L，dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度，濃度過(guò)高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入,濃度過(guò)低則降低反應(yīng)產(chǎn)量；理論上4種dNTP各20μmol/L,就足以在100μL反應(yīng)中合成2.6μg的DNA。當(dāng)dNTP終濃度大于50mmol/L時(shí)可抑制TaqDNA聚合酶的活性；②四種dNTP濃度應(yīng)相等，以減少合成中由于某種dNTP不足而導(dǎo)致的摻入錯(cuò)誤；③dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。④dNTP制備：應(yīng)用NaOH將dNTP溶液的pH調(diào)至7.0，并用分光光度計(jì)測(cè)定其準(zhǔn)確濃度。dNTP原液可配成5-10mmol/L并分裝，-20℃貯存。2022/12/414PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁(yè)!（2）循環(huán)參數(shù)①預(yù)變性：94℃5min②變性：94℃20s-45s（使雙鏈DNA解鏈為單鏈）③退火：溫度由引物的解鏈溫度Tm決定，時(shí)間為45s左右。提高溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合；降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。④延伸：一般為72℃，時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定。⑤循環(huán)次數(shù)：主要取決于模板DNA的濃度，一般為25-35次。次數(shù)過(guò)多，導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低，錯(cuò)誤摻入率增加。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)。⑥延伸補(bǔ)齊：72℃，5min—10min2022/12/415PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因164.注意事項(xiàng)PCR應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有脫氧核糖核酸污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行，最好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)空間。純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。PCR試劑配制應(yīng)使用最高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。PCR的樣品應(yīng)在冰浴上融解，并且要充分混勻?！禖R法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因17陰性對(duì)照:每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對(duì)照。它包括①標(biāo)本對(duì)照:經(jīng)確認(rèn)的陰性標(biāo)本②試劑對(duì)照:在PCR反應(yīng)混合物中不加模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測(cè)試劑是否污染（能控制貯存試劑可能出現(xiàn)的污染或加樣器被DNA模板的氣溶膠污染）?！禖R法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因18預(yù)混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能，PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好，然后小量分裝，-20℃保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機(jī)會(huì)。另外，PCR試劑，PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭，小離心管應(yīng)一次性使用。設(shè)立適當(dāng)?shù)年?yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因196.實(shí)驗(yàn)舉例

本實(shí)驗(yàn)以含有小鼠基因T10的質(zhì)粒pCMV-Myc-T10為模板，擴(kuò)增約800bp的產(chǎn)物?！禖R法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因20InsertEcoR1Xho1pCMV-Myc-T10《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因21PCR混合(50μl):模板:1μl(10ng)P1:1μl(10mmol/L)P2:1μl(10mmol/L)dNTPs:4μl(2.5mmol/L)Taqpolymerase:0.5μl(5U/μl)10×緩沖液（Mg2+）:5μlddH2O:37.5μl

《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因22PCR產(chǎn)物分析取3-5μlPCR產(chǎn)物，采用1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物的量，檢測(cè)引物擴(kuò)增的特異性，并可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)脫氧核糖核酸的量粗略計(jì)算PCR產(chǎn)物的總量。PCR結(jié)果：脫氧核糖核酸標(biāo)記PCR產(chǎn)品1.0kb學(xué)生實(shí)驗(yàn)結(jié)果(4μl)《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁(yè)!

高濃度引物低濃度引物2022/12/423PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因243.熱起動(dòng)PCR(hotstartPCR)

熱起動(dòng)PCR是除了設(shè)計(jì)好的引物之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。盡管TaqDNA聚合酶的最佳延伸溫度在72℃，但聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行PCR反應(yīng)配制過(guò)程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時(shí)會(huì)產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會(huì)被有效擴(kuò)增。進(jìn)行反應(yīng)之前，先不加Taq酶，等溫度上升到72℃后再加入Taq酶。PlatinumDNA聚合酶用于自動(dòng)熱起動(dòng)PCR。常溫活性被封閉，94—95℃加熱幾分鐘后才激活其酶活性?！禖R法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁(yè)!5.反向PCR(reversePCR)

目的：是用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段，對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。

用途：探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長(zhǎng)cDNA的克隆；建立基因組步移文庫(kù)。已知序列未知序列未知序列2022/12/425PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第25頁(yè)!7.LP-PCR（Labelledprimers)目的：利用同位素、熒光素等對(duì)PCR引物進(jìn)行標(biāo)記，用以直觀檢測(cè)目的基因。用途：特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷；可同時(shí)檢測(cè)多種基因成分。病毒1病毒2病毒3病毒42022/12/426PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第26頁(yè)!8.錨定PCR（anchoredPCR,A-PCR）PCR技術(shù)需了解靶基因片段兩個(gè)末端的序列對(duì)于未知序列和具有不同末端序列怎么辦？2022/12/427PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第27頁(yè)!9.PCR固相分析法模板生物素化引物PCR擴(kuò)增探針親和固相介質(zhì)檢測(cè)探針信號(hào)可用于基因芯片的制作2022/12/428PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第28頁(yè)!

（2）原位PCR的作用

鑒定細(xì)胞內(nèi)特異序列一般采用原位雜交（ISH），但在每個(gè)細(xì)胞中目的片段的拷貝數(shù)少于10的情況下，該方法的敏感度就明顯下降。而標(biāo)準(zhǔn)的PCR則可擴(kuò)增出細(xì)胞內(nèi)單拷貝的序列，敏感度很高，但卻未能與細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究相結(jié)合。

ISPCR則可把這兩者結(jié)合起來(lái)，成為細(xì)胞學(xué)診斷中一種嶄新的檢測(cè)技術(shù)。利用該法可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒感染、細(xì)胞內(nèi)基因重排以及分析細(xì)胞內(nèi)RNA的表達(dá)產(chǎn)物。2022/12/429PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第29頁(yè)!11.反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR)逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶mRNAcDNA雜合雙鏈PCR擴(kuò)增2022/12/430PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第30頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因31（1）熒光定量PCR標(biāo)記方法內(nèi)摻式染料

SYBRGreenI序列特異性探針

Taqman MolecularBeacons（分子信標(biāo)）

DualProbes(FRET)熒光共振能量轉(zhuǎn)移引物特異性探針 Amplifluor(Intergen)《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第31頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因32全新4通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀

普通梯度PCR儀《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第32頁(yè)!五、PCR技術(shù)的應(yīng)用1.基因克隆重組DNA質(zhì)粒DNA基因片段2022/12/433PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第33頁(yè)!2.遺傳病的診斷

基因缺失、插入或置換等地中海貧血珠蛋白鏈合成不平衡2022/12/434PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第34頁(yè)!PCR-RFLP法：

限制性內(nèi)切酶3.惡性腫瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因2022/12/435PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第35頁(yè)!正常突變電泳2022/12/436PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第36頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因37六、PCR法獲取目的基因1.T載體克隆PCR獲取的目的基因由TaqDNA聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物中，其3’末端總是會(huì)帶有一個(gè)非模板依賴型的突出堿基，而且這個(gè)堿基幾乎總是A，因?yàn)門aqDNA聚合酶對(duì)dATP具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基的存在，克隆時(shí)可以使用T載體克隆目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第37頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因382.設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)克隆PCR獲取的目的基因3’5’限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列目的基因的PCR片段3’5’限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列經(jīng)限制酶切割得到的具有粘性末端的線性載體經(jīng)限制酶切割得到粘性末端體外連接獲得目的基因的克隆《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第38頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因39PCR引物設(shè)計(jì)primerpremier《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第39頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因40PCR技術(shù)PolymeraseChainReaction多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第40頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因41KaryB.Mullis（1944－）.karymullis.三篇重要論文TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction(ScientificAmerican,1990,262(4):56-61,64-5)Primer-directedEnzymaticAmplificationofDNAwithaThermostableDNAPolymerase(Science,1988,239(4839):487-91

)SpecificSynthesisofDNAInVitroviaaPolymeraseCatalyzedChainReaction(MethodsinEnzymology,1987,155:335-50)《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第41頁(yè)!1983年Mullis的構(gòu)思94℃55℃37℃2022/12/442PCR法獲取目的基因1983年春夏之交的一個(gè)晚上，Mullis開車去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用兩個(gè)引物去擴(kuò)增模板DNA的想法。他開車時(shí),感覺(jué)兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車和對(duì)面開來(lái)的車象是DNA聚合酶，面對(duì)面地合成DNA。缺點(diǎn):DNA聚合酶不能耐受高溫，每個(gè)循環(huán)需額外添加DNA聚合酶。《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第42頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因43二、PCR技術(shù)的原理

1.PCR技術(shù)的原理在微量離心管中,加入適量的緩沖液,微量的模板DNA,四種脫氧核苷酸,耐熱性DNA聚合酶,一對(duì)合成DNA的引物,通過(guò)高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個(gè)階段的循環(huán)合成DNA，每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍。一般樣品經(jīng)過(guò)30次循環(huán),可使基因的拷貝數(shù)達(dá)到數(shù)百萬(wàn)。

《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第43頁(yè)!加熱變性復(fù)性復(fù)溫2.PCR技術(shù)依賴于DNA的變性和復(fù)性DNA的變性：加熱或強(qiáng)酸、堿性作用可以使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂,雙鏈解離,形成單鏈DNADNA的復(fù)性（退火）：解除變性的條件后,變性的單鏈DNA可以重新結(jié)合起來(lái),形成雙鏈,其原有的特性和活性可以恢復(fù)

2022/12/444PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第44頁(yè)!三、PCR技術(shù)的反應(yīng)體系和條件H2O

35

μL10×PCR反應(yīng)緩沖液

5

μL25mmol/LMgCl2

4

μL4種dNTP

4

μL上游引物（引物１）

0.5

μL下游引物（引物２）

0.5

μL模板DNA

(約1ng)

0.5

μLTaq酶0.5

μL

1.反應(yīng)體系（總體積：50L）2022/12/445PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第45頁(yè)!PCR技術(shù)的基本過(guò)程(2)Taq酶模板DNAdNTP引物BufferMg2+

循環(huán)儀94℃55℃72℃72℃5～7min循環(huán)25～35次2022/12/446PCR法獲取目的基因Taq酶模板DNAdNTP引物BufferMg2+

《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第46頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因47注意事項(xiàng)EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性，配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套,并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗。沾染了EB的實(shí)驗(yàn)垃圾需專門回收處理。觀察DNA離不開紫外透射儀，可是紫外光對(duì)DNA分子有切割作用。從膠上回收DNA時(shí)，應(yīng)盡量縮短光照時(shí)間并采用長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈(300-360nm），以減少紫外光切割DNA。每加完一個(gè)樣品要更換tip頭，以防止互相污染，注意上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第47頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因48引物（Primer）濃度：0.1-0.5mol/L，濃度過(guò)高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配,反應(yīng)特異性下降。PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對(duì)上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關(guān)鍵。引物設(shè)計(jì)可遵循下列原則：①引物長(zhǎng)度：約16-30bp，太短影響引物與模板的配對(duì)；②四種堿基隨機(jī)分布，在3’端不存在連續(xù)3個(gè)G或C，這樣易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)（falsepriming）；③引物中G+C含量：通常為40-60%，可按下式粗略估計(jì)引物的解鏈溫度——Tm＝4(G+C)+2(A+T)；④引物3’端：關(guān)鍵堿基，必須與模板完全配對(duì)，最好對(duì)應(yīng)密碼子的或第二位核苷酸，以減少由于密碼子擺動(dòng)產(chǎn)生的不配對(duì)?！禖R法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第48頁(yè)!Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)①濃度：0.5-2.5U/50L體系，所用的酶量可根據(jù)DNA、引物及其它因素的變化進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑鰷p，酶量增加使反應(yīng)特異性下降，酶量過(guò)少影響反應(yīng)產(chǎn)量；

②TaqDNA聚合酶活性的半衰期：92.5℃130min；95℃40min；97℃5min；

③TaqDNA聚合酶的酶活性單位定義：74℃下，30min，摻入

10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量；

④TaqDNA聚合酶的出錯(cuò)率：一般PCR中出錯(cuò)率為1×10-5/bp，在利用PCR克隆和進(jìn)行序列分析時(shí)應(yīng)注意。

⑤類型：TaqDNA聚合酶——普通型，PCR產(chǎn)物末端為A；

PfuDNA聚合酶(Pyrococcusfuriosus)——高保真，出

錯(cuò)率為1×10-6/bp，PCR產(chǎn)物為平末端。2022/12/449PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第49頁(yè)!Mg2+①濃度：0.5mmol/L-2mmol/L，Mg2+濃度過(guò)低會(huì)降低Taq酶活性；Mg2+濃度過(guò)高影響反應(yīng)特異性。對(duì)于一種新的PCR反應(yīng)，可以用0.1-5mmol/L的梯度進(jìn)行Mg2+預(yù)備實(shí)驗(yàn),選出最適的濃度；②Mg2+的作用：DNA聚合酶的激活劑，可影響酶的活性和真實(shí)性,還影響引物退火和解鏈溫度，影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。在PCR反應(yīng)混合物中，應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負(fù)電荷的基團(tuán)（如磷酸基團(tuán)、EDTA等可能影響Mg2+離子濃度的物質(zhì)），以保證最適Mg2+濃度；③dNTP可與Mg2+結(jié)合：使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。2022/12/450PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第50頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因51《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第51頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因52《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第52頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因53陽(yáng)性對(duì)照:在建立PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽(yáng)性對(duì)照，它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。陽(yáng)性對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本，如以重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，其含量宜低不宜高(100個(gè)拷貝以下)。但陽(yáng)性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽(yáng)性標(biāo)本，對(duì)檢測(cè)或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí)，在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽(yáng)性對(duì)照?！禖R法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第53頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因545.防止污染的方法合理分隔實(shí)驗(yàn)室:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行，特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開。最好能劃分①標(biāo)本處理區(qū);②PCR反應(yīng)液制備區(qū);③PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū);④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)專用，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。吸樣槍:吸樣槍污染是一個(gè)值得注意的問(wèn)題。由于操作時(shí)不慎將樣品或模板吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源，因而加樣或吸取模板時(shí)要十分小心。吸樣要慢，吸樣時(shí)盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染?！禖R法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第54頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因55減少PCR循環(huán)次數(shù)，只要PCR產(chǎn)物達(dá)到檢測(cè)水平就適可而止。選擇質(zhì)量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來(lái)核酸的進(jìn)入，打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。

《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第55頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因56PCR儀、臺(tái)式離心機(jī)、滅菌的微量離心管、凝膠電泳系統(tǒng)等TaKaRaTaq(5U/μl)10×PCR緩沖器(含Mg2+)dNTP混合(各2.5mmol/L)模板(10ng，質(zhì)粒)引物（P1和P2,10mmol/L)實(shí)驗(yàn)儀器及材料10×PCR緩沖液：(100mmol/LTris-HCl,pH8.3,500mmol/LKCl,15mmol/LMgCl2)《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第56頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因57P1:5’TTCCAAGCTTCACCATGGCATCAATGCAGAAGC保護(hù)性堿基HindIIITm=4（G＋C）＋2（A＋T）＝4×12＋2×11＝70℃.P2:5’TCGCGGATCCAGTGGCAGCTTGCTAATCTCATTG

保護(hù)性堿基BamHITm=4（G＋C）＋2（A＋T）＝4×11＋2×13＝70℃.《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第57頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因58PCR條件：

94℃變性5min后開始以下循環(huán)

94℃變性反應(yīng)45sec；

65℃退火反應(yīng)45sec；

72℃延伸反應(yīng)1min；進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃反應(yīng)7min；

4℃冷卻恒定?！禖R法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第58頁(yè)!1.不對(duì)稱PCR

目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長(zhǎng)度的單鏈DNA。

方法：采用兩種不同濃度的引物，分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01μmol/L：0.5μmol/L，關(guān)鍵是限制性引物的絕對(duì)量。

用途：制備核酸序列測(cè)定的模板制備雜交探針

四、PCR的類型2022/12/459PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第59頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因602.降落PCR(touch-downPCR)

多循環(huán)的反應(yīng)程序使退火溫度越來(lái)越低。開始的退火溫度選擇為高于Tm值，隨著循環(huán)進(jìn)行，退火溫度逐漸降低到Tm值，并最終低于這個(gè)水平。選擇初始復(fù)性溫度的原則：起始復(fù)性溫度應(yīng)該比引物的Tm值高出5-10度，然后每個(gè)循環(huán)遞減1-2度。原理：隨著退火溫度的降低，特異性逐步降低，但特異性條帶在溫度較高時(shí)已經(jīng)擴(kuò)增出來(lái)，其濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)非特異性條帶，隨著退火溫度的降低，特異性條帶優(yōu)先被擴(kuò)增。《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第60頁(yè)!2022/12/4PCR法獲取目的基因614.嵌套PCR(nestedprimerPCR)采用兩對(duì)引物進(jìn)行PCR，其中第二對(duì)引物位于對(duì)引物內(nèi)P1上P1下P2上P2下用途：驗(yàn)證次PCR產(chǎn)物的特異性；進(jìn)行特殊PCR，如合成探針模板?！禖R法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第61頁(yè)!PCR法獲取目的基因6.多重PCR（復(fù)合PCR）目的：用于檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。電泳引物123412342022/12/462《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第62頁(yè)!標(biāo)記引物ＰＣＲ觀察PCR產(chǎn)物2022/12/463PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第63頁(yè)!cDNA末端核酸轉(zhuǎn)移酶3’GG…GG5’CC…CC錨定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC錨定PCR首先合成鏈cDNA，然后再添加一同聚物尾巴（polydG)，與同聚物尾巴配對(duì)的3’錨定引物（帶有限制性內(nèi)切位點(diǎn)polydC)一起作PCR擴(kuò)增2022/12/464PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第64頁(yè)!10.原位PCR（1）原位PCR的概念

原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（InStillPCR，ISPCR）是由Haase等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細(xì)胞作為一個(gè)微小的反應(yīng)體系來(lái)擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段，在不破壞細(xì)胞的前提下，利用一些特定的檢測(cè)手段來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位，適用于檢測(cè)病理切片中含量較少的靶序列。2022/12/465PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第65頁(yè)!（3）操作步驟①細(xì)胞或組織固定：細(xì)胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后使得一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）能夠進(jìn)入細(xì)胞②PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片段③原位雜交檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物A.陽(yáng)性對(duì)照B.陰性對(duì)照C.原位檢測(cè)mRNA表達(dá)2022/12/466PCR法獲取目的基因《CR法獲取目的基因》課件共76頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第66頁(yè)!2022/12/4PCR