基于高通量測序的菌群結(jié)構(gòu)譜研究課件

基于高通量測序的菌群譜研究

——中醫(yī)藥方向1基于高通量測序的菌群譜研究

——中醫(yī)藥方向1主要內(nèi)容一、中醫(yī)藥微生態(tài)概述二、菌群譜的檢測方法三、生物信息分析內(nèi)容及意義四、案例解析2主要內(nèi)容一、中醫(yī)藥微生態(tài)概述二、菌群譜的檢測方法三、生物信息3344建議“6+2”模式，即人體、環(huán)境、農(nóng)作物、家養(yǎng)動物腸道、工業(yè)以及海洋等6個領(lǐng)域的微生物組研究，加上微生物組研究方法及應(yīng)用技術(shù)平臺和微生物組數(shù)據(jù)儲存及功能挖掘兩個方向。

2016年年7月，50多位院士專家支持中科院微生物所的倡議，向國務(wù)院建議盡快啟動中國微生物組計劃，并得到積極回應(yīng)。5中國微生物組計劃建議“6+2”模式，即人體、環(huán)境、農(nóng)作物、家養(yǎng)動物腸腸道微生態(tài)成人胃腸道微生物重量超過1kg，約編碼330萬個特異基因，是人類基因組編碼基因數(shù)的150多倍；人類第二套基因組；人類是超級生物體。6腸道微生態(tài)成人胃腸道微生物重量超過1kg，約編碼330萬個特人類腸道優(yōu)勢菌7資料來自HakanssonA等的文章人類腸道優(yōu)勢菌7資料來自HakanssonA等的文章人類腸道優(yōu)勢菌8資料來自HakanssonA等的文章人類腸道優(yōu)勢菌8資料來自HakanssonA等的文章人類腸道優(yōu)勢菌9資料來自HakanssonA等的文章人類腸道優(yōu)勢菌9資料來自HakanssonA等的文章腸道微生物的功能及相關(guān)疾病10腸道微生物的功能及相關(guān)疾病10中醫(yī)藥微生態(tài)研究歷史和進展早在公元4世紀(jì)，中醫(yī)師葛洪曾用糞便懸浮液治療食物中毒和嚴(yán)重腹瀉；公元16世紀(jì)，李時珍在《本草綱目》中有用糞便治病的記載；20世紀(jì)，我國微生態(tài)學(xué)創(chuàng)始人魏曦教授曾預(yù)言：“微生態(tài)學(xué)很可能成為打開中醫(yī)奧秘大門的一把金鑰匙”；2012年，上海交大趙立平教授在《Science》上發(fā)表題為《我的微生物組和我》的新聞報道，介紹了其如何把中醫(yī)藥學(xué)和菌群研究結(jié)合，并以此與肥胖斗爭的故事。這開啟了中醫(yī)藥與菌群關(guān)系研究的新紀(jì)元；2014年，上海交大趙立平教授和中國中醫(yī)科學(xué)研究院仝小林教授等，在國際微生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的頂級學(xué)術(shù)期刊《TheISMEJournal》發(fā)表題為《一種中草藥復(fù)方緩解2型糖尿病時的腸道菌群改變》的研究成果；2015年，臺灣長庚大學(xué)學(xué)者在《NatureCommunications》發(fā)表題為《靈芝通過調(diào)節(jié)腸道菌群的組成而降低小鼠肥胖》的研究成果；2016年，臺灣長庚大學(xué)學(xué)者在《Nature》子刊發(fā)表題為《植物和蘑菇對抗肥胖和糖尿病的分子機制》的綜述；2017年，香港浸會大學(xué)陳虎彪教授和江蘇省中醫(yī)藥研究院李松林研究員等的綜述《UnderstandingtheMolecularMechanismsoftheInterplayBetweenHerbalMedicinesandGutMicrobiota》在線發(fā)表在WileyOnlineLibrary；11中醫(yī)藥微生態(tài)研究歷史和進展早在公元4世紀(jì)，中醫(yī)師葛洪曾用糞便人參皂苷Rb1腸道生物轉(zhuǎn)化過程中腸道菌群的關(guān)鍵作用資料來自JunXu等的文章12人參皂苷Rb1腸道生物轉(zhuǎn)化過程中腸道菌群的關(guān)鍵作用資料來自J與草藥代謝相關(guān)的腸道菌群資料來自JunXu等的文章13與草藥代謝相關(guān)的腸道菌群資料來自JunXu等的文章13與草藥代謝相關(guān)的腸道菌群資料來自JunXu等的文章14與草藥代謝相關(guān)的腸道菌群資料來自JunXu等的文章14與草藥代謝相關(guān)的腸道菌群資料來自JunXu等的文章15與草藥代謝相關(guān)的腸道菌群資料來自JunXu等的文章15與草藥代謝相關(guān)的腸道菌群資料來自JunXu等的文章16與草藥代謝相關(guān)的腸道菌群資料來自JunXu等的文章16草藥通過靶向腸道菌群的潛在治療機制資料來自JunXu等的文章17草藥通過靶向腸道菌群的潛在治療機制資料來自JunXu等的文草藥靶向治療腸道菌群資料來自JunXu等的文章18草藥靶向治療腸道菌群資料來自JunXu等的文章18草藥靶向治療腸道菌群資料來自JunXu等的文章19草藥靶向治療腸道菌群資料來自JunXu等的文章19草藥靶向治療腸道菌群資料來自JunXu等的文章20草藥靶向治療腸道菌群資料來自JunXu等的文章20草藥靶向治療腸道菌群資料來自JunXu等的文章21草藥靶向治療腸道菌群資料來自JunXu等的文章21草藥與哺乳動物腸道菌群的互作網(wǎng)絡(luò)資料來自JunXu等的文章22草藥與哺乳動物腸道菌群的互作網(wǎng)絡(luò)資料來自JunXu等的文章草藥與菌群的互作方式（1）腸道菌群將草藥化學(xué)成分生物轉(zhuǎn)化成代謝物質(zhì)，而這些物質(zhì)的生物利用度、生物活性及毒性與其前體不同；（2）草藥化學(xué)成分改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，從而改善其功能失調(diào)狀態(tài)及相關(guān)的病理條件；（3）腸道菌群介導(dǎo)草藥多種化學(xué)成分之間的相互作用；23草藥與菌群的互作方式（1）腸道菌群將草藥化學(xué)成分生物轉(zhuǎn)化成代中醫(yī)藥微生態(tài)研究的機遇和挑戰(zhàn)中醫(yī)藥微生態(tài)研究是我們難得的歷史性的機遇，建議投入更多的團隊和資源，而且需要頂層設(shè)計；挑戰(zhàn)（1）對于與腸道菌群相關(guān)的中醫(yī)藥化學(xué)成分，需要更多的整體化學(xué)特征的研究：是否發(fā)酵的金銀花；（2）對于中醫(yī)藥靶標(biāo)腸道菌群，需要更多的微生物學(xué)的研究：麝香草酚；（3）需要靠譜的中醫(yī)藥腸道微生態(tài)研究模型：人源化老鼠；24機遇中醫(yī)藥微生態(tài)研究的機遇和挑戰(zhàn)中醫(yī)藥微生態(tài)研究是我們難得的歷史二、菌群結(jié)構(gòu)譜的檢測方法25二、菌群結(jié)構(gòu)譜的檢測方法25菌群結(jié)構(gòu)譜的檢測方法在細(xì)菌的進化過程中，rRNA基因的進化相對保守，被認(rèn)為是衡量生命進化歷史最理想的標(biāo)尺。rRNA結(jié)構(gòu)既具保守性又具高變性。保守性反映生物物種的親緣關(guān)系，高變性則揭示生物物種的特征核酸序列，是屬種鑒定的分子基礎(chǔ)。25菌群結(jié)構(gòu)譜的檢測方法在細(xì)菌的進化過程中，rRN菌群結(jié)構(gòu)譜檢測方法羅氏454(2005)Hiseq2500(2014)Miseq(2011)19901960DGGET-RFLPClonelibrary分子生物學(xué)手段Pacbio(2009)培養(yǎng)基培養(yǎng)法高通量測序時代RT-PCR27菌群結(jié)構(gòu)譜檢測方法羅氏454Hiseq2500Miseq19菌群結(jié)構(gòu)譜的檢測方法28菌群結(jié)構(gòu)譜的檢測方法28基因組DNA提取設(shè)計并合成含接頭引物PCR擴增及產(chǎn)物純化PCR產(chǎn)物定量及均一化Miseq高通量測序MiseqPE文庫制備菌群結(jié)構(gòu)譜的檢測方法高保真酶；最低循環(huán)數(shù)；精確定量29基因組DNA提取設(shè)計并合成含接頭引物PCR擴增及產(chǎn)物純化PC樣品采集：采樣方法、生物學(xué)重復(fù)、樣品保存…測序前準(zhǔn)備

：DNA抽提，PCR…平臺選擇

：illuminaMiseq/Hiseq；Pacbio區(qū)域選擇

：細(xì)菌（V3-V4…）；真菌（ITS…）；古菌（V3-V5…）測序量：30000…所需分析：標(biāo)準(zhǔn)分析+高級分析

準(zhǔn)備30樣品采集：采樣方法、生物學(xué)重復(fù)、樣品保存…準(zhǔn)備30三、生物信息分析內(nèi)容及意義31三、生物信息分析內(nèi)容及意義31生物信息分析內(nèi)容及意義

樣本自身所含微生物的多樣性程度（Alpha多樣性）樣本間微生物多樣性比較（

Beta多樣性）環(huán)境因子的影響（對樣本或者微生物）菌群代謝功能預(yù)測32生物信息分析內(nèi)容及意義?樣本自身所含微生物的多樣性程度（A錯誤率與質(zhì)量值換算的公式：Q=-10log10(E)

Fastaq文件：@HWI-ST531R:144:D11RDACXX:4:1101:1212:19461:N:0:ATTCCTATNATGACTCAAGCGCTTCCTCAGTTTAATGAAGCTAACTTCAATGCTGAGATCGTT+HWI-ST531R:144:D11RDACXX:4:1101:1212:19461:N:0:ATTCCT?A#AFFDFFHGFFHJJGIJJJIICHIIIIJJGGHIIJJIIJIIJIHGI@FEHIIJBFFHGJJIIHHHDFFFF信息分析內(nèi)容33錯誤率與質(zhì)量值換算的公式：Q=-10log10(E)OTU聚類OTU（OperationalTaxonomicUnits）是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進行分析，人為給某一個分類單元（品系，屬，種、分組等）設(shè)置的同一標(biāo)志。要了解一個樣品測序結(jié)果中的菌種、菌屬等數(shù)目信息，就需要對序列進行歸類操作（cluster）。通過歸類操作，將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組，一個小組就是一個OTU。可根據(jù)不同的相似度水平（通常為97%），對所有序列進行OTU劃分。有效數(shù)據(jù)優(yōu)化數(shù)據(jù)信息分析內(nèi)容34OTU聚類OTU（Operational分類學(xué)分析Qiime分類學(xué)分析（/scripts/assign_taxonomy.html）將序列與greengene等數(shù)據(jù)庫比對某OTU的種屬信息：同一個OTU中的不同序列的最近祖先的種屬信息OTUnameABOTUsizesuperkingdomphylumclass…OTU1100150250BacteriaProteobacteriaBetaproteobacteria…OTU250100150BacteriaProteobacteriaGammaproteobacteria………………………35分類學(xué)分析Qiime分類學(xué)分析（http://qiime.o稀釋性曲線36稀釋性曲線36RankAbundance曲線37RankAbundance曲線37Specaccum物種累積曲線38Specaccum物種累積曲線38單個樣品的群落結(jié)構(gòu)組分圖39單個樣品的群落結(jié)構(gòu)組分圖39單個樣品的群落結(jié)構(gòu)組分圖40單個樣品的群落結(jié)構(gòu)組分圖40OTU分布VENN圖多樣品相似度樹狀圖41OTU分布VENN圖多樣品相似度樹狀圖41多個樣品的菌群結(jié)構(gòu)譜柱形圖42多個樣品的菌群結(jié)構(gòu)譜柱形圖42菌群結(jié)構(gòu)譜Heatmap圖43菌群結(jié)構(gòu)譜Heatmap圖43

PCA44PCA44ABC物種差異顯著性分析45ABC物種差異顯著性分析45LEfSE46LEfSE46LEfSE::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::47LEfSE:::::::::::::::::::::::::RDA/CCA48RDA/CCA48優(yōu)勢物種互作關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析49優(yōu)勢物種互作關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析49菌群代謝功能預(yù)測ABC50菌群代謝功能預(yù)測ABC50四、案例解析51四、案例解析51案例分析52案例分析52實驗設(shè)計：檢測高脂飲食組，以及高脂飲食+靈芝水提物干預(yù)組小鼠腸道菌群譜變化，同時用正常飲食組，以及正常飲食+靈芝水提物干預(yù)組作為對照；采集并統(tǒng)計多項生理生化指標(biāo)；通過向高飲食組移植其他組分的糞便來驗證，并檢查糞便菌群譜變化；分離并驗證靈芝水提物活性物質(zhì)。測序策略：采用羅氏454平臺，對16SrRNA

V3-V5區(qū)測，引物為338F-907R。

結(jié)論：

靈芝水提物通過調(diào)節(jié)腸道菌群譜而緩解小鼠肥胖?！鹅`芝通過調(diào)節(jié)腸道菌群譜緩解小鼠肥胖》53實驗設(shè)計：檢測高脂飲食組，以及高脂飲食+靈芝水提物干54①正常飲食組②正常飲食+喂食8%靈芝水提物組③高脂飲食組④高脂飲食+喂食2%靈芝水提物組⑤高脂飲食+喂食4%靈芝水提物組⑥高脂飲食+喂食8%靈芝水提物組實驗設(shè)計采集統(tǒng)計多項生理生化指標(biāo)檢測分析菌群譜變化情況發(fā)現(xiàn)靈芝水提物不僅可以降低高脂飲食小鼠體重、炎癥和胰島素抵抗，還可以降低腸道菌群的厚壁菌／擬桿菌門比值和內(nèi)毒素濃度，同時維持腸屏障完整性。①向高脂飲食組移植正常飲食組糞便②向高脂飲食組移植正常飲食+喂食8%靈芝水提物組③向高脂飲食組移植高脂飲食組糞便④向高脂飲食組移植高脂飲食+喂食8%靈芝水提物組采集統(tǒng)計多項生理生化指標(biāo)檢測分析菌群譜變化情況發(fā)現(xiàn)將喂養(yǎng)靈芝水提物的小鼠糞便移植給高脂飲食小鼠，與直接喂食靈芝水提物效果類似。①正常飲食組②正常飲食+喂食8%靈芝水提物組③正常飲食+喂食30萬Da以上靈芝粗提物組④正常飲食+喂食10-30萬Da靈芝粗提物組⑤正常飲食+喂食10萬Da以下靈芝粗提物組⑥正常飲食+喂食某不明確芝粗提物組⑦高脂飲食組⑧高脂飲食+喂食8%靈芝水提物組⑨高脂飲食+喂食30萬Da以上靈芝粗提物組⑩高脂飲食+喂食10-30萬Da靈芝粗提物組?高脂飲食+喂食10萬Da以下靈芝粗提物組?高脂飲食+喂食某不明確靈芝粗提物組靈芝水提物通過調(diào)節(jié)腸道菌群譜而緩解小鼠肥胖單獨用大于30萬Da的靈芝粗提物喂養(yǎng)高脂飲食小鼠，與直接喂食靈芝水提物效果類似。采集統(tǒng)計多項生理生化指標(biāo)54①正常飲食組實驗設(shè)計采集統(tǒng)計多項生理生化指標(biāo)檢測分析菌群靈芝水提物對高脂飲食小鼠體重等指標(biāo)的影響55靈芝水提物對高脂飲食小鼠體重等指標(biāo)的影響55靈芝水提物對高脂飲食小鼠肝臟重量等指標(biāo)的影響56靈芝水提物對高脂飲食小鼠肝臟重量等指標(biāo)的影響56靈芝水提物對高脂飲食小鼠白介素等基因表達(dá)的影響57靈芝水提物對高脂飲食小鼠白介素等基因表達(dá)的影響57靈芝水提物對高脂飲食小鼠白介素等基因表達(dá)的影響58靈芝水提物對高脂飲食小鼠白介素等基因表達(dá)的影響58靈芝水提物對高脂飲食小鼠肌動蛋白等豐度的影響59靈芝水提物對高脂飲食小鼠肌動蛋白等豐度的影響59靈芝水提物對高脂飲食小鼠腸道菌群譜的影響60靈芝水提物對高脂飲食小鼠腸道菌群譜的影響60靈芝水提物對高脂飲食小鼠腸道菌群譜的影響61靈芝水提物對高脂飲食小鼠腸道菌群譜的影響61靈芝水提物對高脂飲食小鼠腸道菌群譜的影響62靈芝水提物對高脂飲食小鼠腸道菌群譜的影響62靈芝水提物對高脂飲食小鼠腸道菌群譜的影響……….63靈芝水提物對高脂飲食小鼠腸道菌群譜的影響…………移植不同來源的糞便對肥胖小鼠體重等指標(biāo)的影響64移植不同來源的糞便對肥胖小鼠體重等指標(biāo)的影響64移植不同來源的糞便對肥胖小鼠白介素等基因表達(dá)的影響65移植不同來源的糞便對肥胖小鼠白介素等基因表達(dá)的影響65移植不同來源的糞便對肥胖小鼠白介素等基因表達(dá)及翻譯的影響66移植不同來源的糞便對肥胖小鼠白介素等基因表達(dá)及翻譯的影響66移植不同來源的糞便對肥胖小鼠腸道菌群譜的影響67移植不同來源的糞便對肥胖小鼠腸道菌群譜的影響67移植不同來源的糞便對肥胖小鼠腸道菌群譜的影響68移植不同來源的糞便對肥胖小鼠腸道菌群譜的影響68移植不同來源的糞便對肥胖小鼠腸道菌群譜的影響69移植不同來源的糞便對肥胖小鼠腸道菌群譜的影響69移植不同來源的糞便對肥胖小鼠腸道菌群譜的影響………………70移植不同來源的糞便對肥胖小鼠腸道菌群譜的影響……71717272靈芝水提物不同分子量組分對肥胖小鼠體重等指標(biāo)的影響73靈芝水提物不同分子量組分對肥胖小鼠體重等指標(biāo)的影響73靈芝水提物不同分子量組分對肥胖小鼠肝臟重量等指標(biāo)的影響74靈芝水提物不同分子量組分對肥胖小鼠肝臟重量等指標(biāo)的影響74基于高通量測序的菌群譜研究

——中醫(yī)藥方向1基于高通量測序的菌群譜研究

——中醫(yī)藥方向1主要內(nèi)容一、中醫(yī)藥微生態(tài)概述二、菌群譜的檢測方法三、生物信息分析內(nèi)容及意義四、案例解析2主要內(nèi)容一、中醫(yī)藥微生態(tài)概述二、菌群譜的檢測方法三、生物信息3344建議“6+2”模式，即人體、環(huán)境、農(nóng)作物、家養(yǎng)動物腸道、工業(yè)以及海洋等6個領(lǐng)域的微生物組研究，加上微生物組研究方法及應(yīng)用技術(shù)平臺和微生物組數(shù)據(jù)儲存及功能挖掘兩個方向。

2016年年7月，50多位院士專家支持中科院微生物所的倡議，向國務(wù)院建議盡快啟動中國微生物組計劃，并得到積極回應(yīng)。5中國微生物組計劃建議“6+2”模式，即人體、環(huán)境、農(nóng)作物、家養(yǎng)動物腸腸道微生態(tài)成人胃腸道微生物重量超過1kg，約編碼330萬個特異基因，是人類基因組編碼基因數(shù)的150多倍；人類第二套基因組；人類是超級生物體。6腸道微生態(tài)成人胃腸道微生物重量超過1kg，約編碼330萬個特人類腸道優(yōu)勢菌7資料來自HakanssonA等的文章人類腸道優(yōu)勢菌7資料來自HakanssonA等的文章人類腸道優(yōu)勢菌8資料來自HakanssonA等的文章人類腸道優(yōu)勢菌8資料來自HakanssonA等的文章人類腸道優(yōu)勢菌9資料來自HakanssonA等的文章人類腸道優(yōu)勢菌9資料來自HakanssonA等的文章腸道微生物的功能及相關(guān)疾病10腸道微生物的功能及相關(guān)疾病10中醫(yī)藥微生態(tài)研究歷史和進展早在公元4世紀(jì)，中醫(yī)師葛洪曾用糞便懸浮液治療食物中毒和嚴(yán)重腹瀉；公元16世紀(jì)，李時珍在《本草綱目》中有用糞便治病的記載；20世紀(jì)，我國微生態(tài)學(xué)創(chuàng)始人魏曦教授曾預(yù)言：“微生態(tài)學(xué)很可能成為打開中醫(yī)奧秘大門的一把金鑰匙”；2012年，上海交大趙立平教授在《Science》上發(fā)表題為《我的微生物組和我》的新聞報道，介紹了其如何把中醫(yī)藥學(xué)和菌群研究結(jié)合，并以此與肥胖斗爭的故事。這開啟了中醫(yī)藥與菌群關(guān)系研究的新紀(jì)元；2014年，上海交大趙立平教授和中國中醫(yī)科學(xué)研究院仝小林教授等，在國際微生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的頂級學(xué)術(shù)期刊《TheISMEJournal》發(fā)表題為《一種中草藥復(fù)方緩解2型糖尿病時的腸道菌群改變》的研究成果；2015年，臺灣長庚大學(xué)學(xué)者在《NatureCommunications》發(fā)表題為《靈芝通過調(diào)節(jié)腸道菌群的組成而降低小鼠肥胖》的研究成果；2016年，臺灣長庚大學(xué)學(xué)者在《Nature》子刊發(fā)表題為《植物和蘑菇對抗肥胖和糖尿病的分子機制》的綜述；2017年，香港浸會大學(xué)陳虎彪教授和江蘇省中醫(yī)藥研究院李松林研究員等的綜述《UnderstandingtheMolecularMechanismsoftheInterplayBetweenHerbalMedicinesandGutMicrobiota》在線發(fā)表在WileyOnlineLibrary；11中醫(yī)藥微生態(tài)研究歷史和進展早在公元4世紀(jì)，中醫(yī)師葛洪曾用糞便人參皂苷Rb1腸道生物轉(zhuǎn)化過程中腸道菌群的關(guān)鍵作用資料來自JunXu等的文章12人參皂苷Rb1腸道生物轉(zhuǎn)化過程中腸道菌群的關(guān)鍵作用資料來自J與草藥代謝相關(guān)的腸道菌群資料來自JunXu等的文章13與草藥代謝相關(guān)的腸道菌群資料來自JunXu等的文章13與草藥代謝相關(guān)的腸道菌群資料來自JunXu等的文章14與草藥代謝相關(guān)的腸道菌群資料來自JunXu等的文章14與草藥代謝相關(guān)的腸道菌群資料來自JunXu等的文章15與草藥代謝相關(guān)的腸道菌群資料來自JunXu等的文章15與草藥代謝相關(guān)的腸道菌群資料來自JunXu等的文章16與草藥代謝相關(guān)的腸道菌群資料來自JunXu等的文章16草藥通過靶向腸道菌群的潛在治療機制資料來自JunXu等的文章17草藥通過靶向腸道菌群的潛在治療機制資料來自JunXu等的文草藥靶向治療腸道菌群資料來自JunXu等的文章18草藥靶向治療腸道菌群資料來自JunXu等的文章18草藥靶向治療腸道菌群資料來自JunXu等的文章19草藥靶向治療腸道菌群資料來自JunXu等的文章19草藥靶向治療腸道菌群資料來自JunXu等的文章20草藥靶向治療腸道菌群資料來自JunXu等的文章20草藥靶向治療腸道菌群資料來自JunXu等的文章21草藥靶向治療腸道菌群資料來自JunXu等的文章21草藥與哺乳動物腸道菌群的互作網(wǎng)絡(luò)資料來自JunXu等的文章22草藥與哺乳動物腸道菌群的互作網(wǎng)絡(luò)資料來自JunXu等的文章草藥與菌群的互作方式（1）腸道菌群將草藥化學(xué)成分生物轉(zhuǎn)化成代謝物質(zhì)，而這些物質(zhì)的生物利用度、生物活性及毒性與其前體不同；（2）草藥化學(xué)成分改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，從而改善其功能失調(diào)狀態(tài)及相關(guān)的病理條件；（3）腸道菌群介導(dǎo)草藥多種化學(xué)成分之間的相互作用；23草藥與菌群的互作方式（1）腸道菌群將草藥化學(xué)成分生物轉(zhuǎn)化成代中醫(yī)藥微生態(tài)研究的機遇和挑戰(zhàn)中醫(yī)藥微生態(tài)研究是我們難得的歷史性的機遇，建議投入更多的團隊和資源，而且需要頂層設(shè)計；挑戰(zhàn)（1）對于與腸道菌群相關(guān)的中醫(yī)藥化學(xué)成分，需要更多的整體化學(xué)特征的研究：是否發(fā)酵的金銀花；（2）對于中醫(yī)藥靶標(biāo)腸道菌群，需要更多的微生物學(xué)的研究：麝香草酚；（3）需要靠譜的中醫(yī)藥腸道微生態(tài)研究模型：人源化老鼠；24機遇中醫(yī)藥微生態(tài)研究的機遇和挑戰(zhàn)中醫(yī)藥微生態(tài)研究是我們難得的歷史二、菌群結(jié)構(gòu)譜的檢測方法25二、菌群結(jié)構(gòu)譜的檢測方法25菌群結(jié)構(gòu)譜的檢測方法在細(xì)菌的進化過程中，rRNA基因的進化相對保守，被認(rèn)為是衡量生命進化歷史最理想的標(biāo)尺。rRNA結(jié)構(gòu)既具保守性又具高變性。保守性反映生物物種的親緣關(guān)系，高變性則揭示生物物種的特征核酸序列，是屬種鑒定的分子基礎(chǔ)。25菌群結(jié)構(gòu)譜的檢測方法在細(xì)菌的進化過程中，rRN菌群結(jié)構(gòu)譜檢測方法羅氏454(2005)Hiseq2500(2014)Miseq(2011)19901960DGGET-RFLPClonelibrary分子生物學(xué)手段Pacbio(2009)培養(yǎng)基培養(yǎng)法高通量測序時代RT-PCR27菌群結(jié)構(gòu)譜檢測方法羅氏454Hiseq2500Miseq19菌群結(jié)構(gòu)譜的檢測方法28菌群結(jié)構(gòu)譜的檢測方法28基因組DNA提取設(shè)計并合成含接頭引物PCR擴增及產(chǎn)物純化PCR產(chǎn)物定量及均一化Miseq高通量測序MiseqPE文庫制備菌群結(jié)構(gòu)譜的檢測方法高保真酶；最低循環(huán)數(shù)；精確定量29基因組DNA提取設(shè)計并合成含接頭引物PCR擴增及產(chǎn)物純化PC樣品采集：采樣方法、生物學(xué)重復(fù)、樣品保存…測序前準(zhǔn)備

：DNA抽提，PCR…平臺選擇

：illuminaMiseq/Hiseq；Pacbio區(qū)域選擇

：細(xì)菌（V3-V4…）；真菌（ITS…）；古菌（V3-V5…）測序量：30000…所需分析：標(biāo)準(zhǔn)分析+高級分析

準(zhǔn)備30樣品采集：采樣方法、生物學(xué)重復(fù)、樣品保存…準(zhǔn)備30三、生物信息分析內(nèi)容及意義31三、生物信息分析內(nèi)容及意義31生物信息分析內(nèi)容及意義

樣本自身所含微生物的多樣性程度（Alpha多樣性）樣本間微生物多樣性比較（

Beta多樣性）環(huán)境因子的影響（對樣本或者微生物）菌群代謝功能預(yù)測32生物信息分析內(nèi)容及意義?樣本自身所含微生物的多樣性程度（A錯誤率與質(zhì)量值換算的公式：Q=-10log10(E)

Fastaq文件：@HWI-ST531R:144:D11RDACXX:4:1101:1212:19461:N:0:ATTCCTATNATGACTCAAGCGCTTCCTCAGTTTAATGAAGCTAACTTCAATGCTGAGATCGTT+HWI-ST531R:144:D11RDACXX:4:1101:1212:19461:N:0:ATTCCT?A#AFFDFFHGFFHJJGIJJJIICHIIIIJJGGHIIJJIIJIIJIHGI@FEHIIJBFFHGJJIIHHHDFFFF信息分析內(nèi)容33錯誤率與質(zhì)量值換算的公式：Q=-10log10(E)OTU聚類OTU（OperationalTaxonomicUnits）是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進行分析，人為給某一個分類單元（品系，屬，種、分組等）設(shè)置的同一標(biāo)志。要了解一個樣品測序結(jié)果中的菌種、菌屬等數(shù)目信息，就需要對序列進行歸類操作（cluster）。通過歸類操作，將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組，一個小組就是一個OTU。可根據(jù)不同的相似度水平（通常為97%），對所有序列進行OTU劃分。有效數(shù)據(jù)優(yōu)化數(shù)據(jù)信息分析內(nèi)容34OTU聚類OTU（Operational分類學(xué)分析Qiime分類學(xué)分析（/scripts/assign_taxonomy.html）將序列與greengene等數(shù)據(jù)庫比對某OTU的種屬信息：同一個OTU中的不同序列的最近祖先的種屬信息OTUnameABOTUsizesuperkingdomphylumclass…OTU1100150250BacteriaProteobacteriaBetaproteobacteria…OTU250100150BacteriaProteobacteriaGammaproteobacteria………………………35分類學(xué)分析Qiime分類學(xué)分析（http://qiime.o稀釋性曲線36稀釋性曲線36RankAbundance曲線37RankAbundance曲線37Specaccum物種累積曲線38Specaccum物種累積曲線38單個樣品的群落結(jié)構(gòu)組分圖39單個樣品的群落結(jié)構(gòu)組分圖39單個樣品的群落結(jié)構(gòu)組分圖40單個樣品的群落結(jié)構(gòu)組分圖40OTU分布VENN圖多樣品相似度樹狀圖41OTU分布VENN圖多樣品相似度樹狀圖41多個樣品的菌群結(jié)構(gòu)譜柱形圖42多個樣品的菌群結(jié)構(gòu)譜柱形圖42菌群結(jié)構(gòu)譜Heatmap圖43菌群結(jié)構(gòu)譜Heatmap圖43

PCA44PCA44ABC物種差異顯著性分析45ABC物種差異顯著性分析45LEfSE46LEfSE46LEfSE::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::47LEfSE:::::::::::::::::::::::::RDA/CCA48RDA/CCA48優(yōu)勢物種互作關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析49優(yōu)勢物種互作關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析49菌群代謝功能預(yù)測ABC50菌群代謝功能預(yù)測ABC50四、案例解析51四、案例解析51案例分析52案例分析52實驗設(shè)計：檢測高脂飲食組，以及高脂飲食+靈芝水提物干預(yù)組小鼠腸道菌群譜變化，同時用正常飲食組，以及正常飲食+靈芝水提物干預(yù)組作為對照；采集并統(tǒng)計多項生理生化指標(biāo)；通過向高飲食組移植其他組分的糞便來驗證，并檢查糞便菌群譜變化；分離并驗證靈芝水提物活性物質(zhì)。測序策略：采用羅氏454平臺，對16SrRNA

V3-V5區(qū)測，引物為338F-907R。

結(jié)論：

靈芝水提物通過調(diào)節(jié)腸道菌群譜而緩解小鼠肥胖?！鹅`芝通過調(diào)節(jié)腸道菌群譜緩解小鼠肥胖》53實驗設(shè)計：檢測高脂飲食組，以及高脂飲食+靈芝水提物干54①正常飲食組②正常飲食+喂食8%靈芝水提物組③高脂飲食組④高脂飲食+喂食2%靈芝水提物組⑤高脂飲食+喂食4%靈芝水提物組⑥高脂飲食+喂食8%靈芝水提物組實驗設(shè)計采集統(tǒng)計多項生理生化指標(biāo)檢測分析菌群譜變化情況發(fā)現(xiàn)靈芝水提物不僅可以降低高脂飲食小鼠體重、炎癥和胰島素抵抗，還可以降低腸道菌群的厚壁菌／擬桿菌門比值和內(nèi)毒素濃度，同時維持腸屏障完整性。①向高脂飲食組移植正常飲食組糞便②向高脂飲食組移植正常飲食+喂食8%靈芝水提物組③向高脂飲食組移植高脂飲食組糞便④向高脂飲食組移植高脂飲食+喂食8%靈芝水提物組采集統(tǒng)計多項生理生化指標(biāo)檢測分析菌群譜變化情況發(fā)現(xiàn)將喂養(yǎng)靈芝水提物的小鼠糞便移植給高脂飲食小鼠，與直接喂食靈芝水提物效果類似。①正常飲食組②