金免疫標(biāo)記技術(shù)

任務(wù)九

金免疫標(biāo)記技術(shù)知識(shí)目標(biāo)技能目標(biāo)素質(zhì)目標(biāo)1.掌握金免疫標(biāo)記技術(shù)原理和分類(lèi)2.了解標(biāo)記物的制備3.了解金免疫檢測(cè)的臨床應(yīng)用1.會(huì)金免疫標(biāo)記物的制備操作2.會(huì)熟練操作金免疫檢測(cè)過(guò)程樹(shù)立嚴(yán)肅認(rèn)真、實(shí)事求是、高度負(fù)責(zé)的科學(xué)態(tài)度，具有良好的職業(yè)素質(zhì)和崇高的職業(yè)道德。

任務(wù)目標(biāo)任務(wù)對(duì)象肺炎支原體抗體檢測(cè)

任務(wù)過(guò)程

復(fù)習(xí)提問(wèn)

案例導(dǎo)入

講解與示教學(xué)生操作討論分析

評(píng)價(jià)、考核

課后思考題教學(xué)環(huán)節(jié)2′30′2′10′40′5′1′

患兒，女，11歲，間斷發(fā)熱1周，伴咳嗽3天。體溫最高39。1度，病程第2天查血常規(guī)正常，診斷“呼吸道感染”并靜滴“阿奇霉素”3天，無(wú)明顯改變，即而出現(xiàn)咳嗽，為陣發(fā)性刺激性咳嗽，少痰，胸片提示：雙肺紋理增粗，右上肺片影。復(fù)查血常規(guī)仍正常?；純悍尾扛腥鞠的姆N病原體所致？如何快速診斷？案例導(dǎo)入

斑點(diǎn)金免疫層析法演示

肺炎支原體診斷試劑盒講解與示教

二用采血針采指尖血一洗凈雙手四立即加1-2滴緩沖液

三將1滴指尖血滴入加樣孔操作步驟5：15分鐘讀取結(jié)果

？？結(jié)果？？結(jié)果老師糾正點(diǎn)評(píng)

學(xué)生操作一位學(xué)生操作演示學(xué)生分組再操作討論分析膠體金標(biāo)記技術(shù)(Immunogoldlabelingtechnique)

是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。討論分析膠體金標(biāo)記技術(shù)討論分析（一）金免疫檢測(cè)原理膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱(chēng)為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。討論分析Geobegan等將膠體金標(biāo)記抗體用于普通光鏡下檢測(cè)B淋巴細(xì)腦表面膜免疫球蛋白，建立了光鏡水平的免疫金染色。Faulk和Taylor首創(chuàng)膠體金標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)膠體金標(biāo)記技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展應(yīng)用于免疫轉(zhuǎn)印、流式細(xì)胞術(shù)、液相免疫測(cè)定、固相斑點(diǎn)金／銀染色及斑點(diǎn)金免疫滲濾測(cè)定法等多種標(biāo)記免疫檢測(cè)方法1971年1978年近年來(lái)討論分析討論分析枸櫞酸三鈉還原法鞣酸—枸櫞酸鈉還原法根據(jù)不同的還原劑可以制備大小不同的膠體金顆粒。常用來(lái)制備膠體金顆粒的方法膠體金的制備

1．枸櫞酸三鈉還原法（1）10nm膠體金粒的制備：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸櫞酸三鈉水溶液3ml，加熱煮沸30min，冷卻至4℃，溶液呈紅色。（2）15nm膠體金顆粒的制備：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸櫞酸三鈉水溶液2ml，加熱煮沸15min～30min，直至顏色變紅。冷卻后加入0.1Mol/LK2CO30.5ml，混勻即可。（3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm膠體金顆粒的制備：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加熱煮沸。根據(jù)需要迅速加入1％枸櫞酸三鈉水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，繼續(xù)煮沸約5min，出現(xiàn)橙紅色。這樣制成的膠體金顆粒則分別為15nm、18～20nm、30nm和50nm討論分析2．鞣酸—枸櫞酸鈉還原法

A液：1％HAuCl4水溶液1ml加入79ml雙餾水中混勻。

B液：1％枸櫞酸三鈉4ml，1％鞣酸0.7ml，0.1Mol/LK2CO3液0.2ml，混合，加入雙餾水至20ml。將A液、B液分別加熱至60℃，在電磁攪拌下迅速將B液加入A液中，溶液變藍(lán)，繼續(xù)加熱攪拌至溶液變成亮紅色。此法制得的金顆粒的直徑為5nm。如需要制備其它直徑的金顆粒，則按表15-1所列的數(shù)字調(diào)整鞣酸及K2CO3的用量

討論分析（1）玻璃器皿必須徹底清洗，最好是經(jīng)過(guò)硅化處理的玻璃器皿，或用第一次配制的膠體金穩(wěn)定的玻璃器皿，再用雙餾水沖洗后使用。否則影響生物大分子與金顆粒結(jié)合和活化后金顆粒的穩(wěn)定性，不能獲得預(yù)期大小的金顆粒。（2）試劑配制必須保持嚴(yán)格的純凈，所有試劑都必須使用雙餾水或三餾水并去離子后配制，或者在臨用前將配好的試劑經(jīng)超濾或微孔濾膜（0.45μm）過(guò)濾，以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質(zhì)。制備高質(zhì)量膠體金的注意事項(xiàng)

討論分析（3）配制膠體金溶液的pH以中性（pH7.2）較好。（4）氯金酸的質(zhì)量要求上乘，雜質(zhì)少。最好是進(jìn)口的。（5）氯金酸配成1％水溶液在4℃可保持?jǐn)?shù)月穩(wěn)定，由于氯金酸易潮解，因此在配制時(shí)，最好將整個(gè)小包裝一次性溶解。制備高質(zhì)量膠體金的注意事項(xiàng)討論分析

缺點(diǎn)金標(biāo)法

優(yōu)點(diǎn)

靈敏度不如酶標(biāo)技術(shù)一般作為定性，不易定量。討論分析自帶質(zhì)控對(duì)照簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用符號(hào)顯示結(jié)果快速：全部檢測(cè)過(guò)程僅需3-20分鐘。示蹤劑：以膠體金為指示劑，本身形成免疫分析過(guò)程后的顏色標(biāo)記討論分析可單份檢測(cè)，穩(wěn)定性好斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)夾心法競(jìng)爭(zhēng)法雙抗原夾心法雙抗體夾心法討論分析分類(lèi)

雙抗體夾心法G區(qū)：金標(biāo)特異性抗體(兔型)C區(qū)：羊抗兔IgT區(qū)：特異性抗體

吸水紙標(biāo)本討論分析討論分析競(jìng)爭(zhēng)法標(biāo)本G區(qū)：金標(biāo)特異性抗體(兔型)C區(qū)：羊抗兔IgT區(qū)：標(biāo)準(zhǔn)抗原

吸水紙陽(yáng)性結(jié)果討論分析標(biāo)本G區(qū)：金標(biāo)特異性抗體(兔型)C區(qū)：羊抗兔IgT區(qū)：標(biāo)準(zhǔn)抗原吸水紙陰性結(jié)果討論分析討論分析

斑點(diǎn)金免疫滲濾測(cè)定法（dotimmuno－goldfiltrationassay,DIGFA）此法原理是在硝酸纖維膜下墊有吸水性強(qiáng)的墊料，即為滲濾裝置。在加抗原（抗體）后，迅速加抗體（抗原），再加金標(biāo)記第二抗體，由于有滲濾裝置，反應(yīng)很快，在數(shù)分鐘內(nèi)即可顯出顏色反應(yīng)。此方法已成功地應(yīng)用于人的免疫缺陷病病毒（HIV）的檢查和人血清中甲胎蛋白的檢測(cè)。討論分析以雙抗體夾心法HCG