CR試劑盒的選用和質(zhì)檢

臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心李金明PCR或RT-PCR試劑盒的組成核酸提取試劑核酸擴(kuò)增或逆轉(zhuǎn)錄-核酸擴(kuò)增試劑產(chǎn)物檢測試劑（有些使用全自動分析儀的PCR方法因其核酸擴(kuò)增和檢測同時(shí)完成，故無專門的產(chǎn)物檢測試劑）影響PCR試劑盒質(zhì)量的因素內(nèi)在因素:原材料、核酸提取方法、方法學(xué)設(shè)計(jì)影響PCR試劑盒質(zhì)量的因素：

擴(kuò)增所需的原材料寡核苷酸引物和探針緩沖液和dNTP聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等PCR反應(yīng)混合物

Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaqDNA多聚酶rTthDNA多聚酶AmpErase

生物素標(biāo)記的引物和或和寡核苷酸引物和探針其對試劑盒質(zhì)量的影響首先是純度。純度的判斷可根據(jù)260/280吸光度比值來判斷，如?2.0，則需重新純化。另一種方法是將其在聚丙烯酰胺凝膠上電泳，如出現(xiàn)一條以上的帶或遷移位置錯誤，則需重新純化。是否有污染。結(jié)合特異性（濃度）dNTP和緩沖液dNTP（包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP或dUTP）的濃度緩沖液：在儲存和擴(kuò)增循環(huán)中穩(wěn)定、作為聚合酶活性所必須的Mg＋＋（或用于rTth的Mn＋＋）的濃度以及pH等逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶酶的濃度酶的活性核酸擴(kuò)增方法PCRRT－PCR轉(zhuǎn)錄依賴的擴(kuò)增（TMA）連接酶鏈反應(yīng)（LCR）鏈替代擴(kuò)增（SDA）等影響PCR試劑盒質(zhì)量的因素：

核酸提取核酸提取的有效性核酸提取的簡便性影響響PCR試劑劑盒盒質(zhì)質(zhì)量量的的因因素素：：產(chǎn)產(chǎn)物物檢檢測測雜交交固固相相特異異探探針針及及其其標(biāo)標(biāo)記記物物影響響PCR試劑劑盒盒質(zhì)質(zhì)量量的的因因素素內(nèi)在在因因素素:原原材材料料、、核核酸酸提提取取方方法法、、方方法法學(xué)學(xué)設(shè)設(shè)計(jì)計(jì)外在在因因素素：：試試劑劑盒盒的的運(yùn)運(yùn)輸輸和和貯貯存存外外在在因因素素：：試試劑劑盒盒的的運(yùn)運(yùn)輸輸和和貯貯存存試劑劑盒盒的的運(yùn)運(yùn)輸輸和和貯貯存存PCR試試劑劑盒盒的的有有效效期期一一般般為為6個(gè)個(gè)月月，，這這是是指指在在適適當(dāng)當(dāng)?shù)牡馁A貯存存溫溫度度下下。。核核酸酸擴(kuò)擴(kuò)增增部部分分的的試試劑劑一一般般要要貯貯存存于于-20℃℃下下；；產(chǎn)產(chǎn)物物檢檢測測部部分分試試劑劑則則貯貯存存于于2～～8℃℃。。試劑劑盒盒從從廠廠家家到到用用戶戶手手中中，，均均要要經(jīng)經(jīng)歷歷運(yùn)運(yùn)輸輸及及運(yùn)運(yùn)輸輸中中的的貯貯存存，，任任一一環(huán)環(huán)節(jié)節(jié)的的不不當(dāng)當(dāng)，，均均會會影影響響試試劑劑盒盒的的臨臨床床使使用用質(zhì)質(zhì)量量。。PCR試劑劑盒盒的的分分類類定性性測測定定：：PCR-ELISA、、PCR-膜上上雜雜交交（（雜雜交交梳梳））、、熒熒光光PCR（（分分子子信信標(biāo)標(biāo)和和TaqMan等等））定量量測測定定：：PCR-ELISA、、TaqMan和和Amplisensor熒熒光光定定量量、、AmplicorPCR-ELISA定定量量等等。。PCR試劑劑盒盒的的選選用用原原則則參考考試試劑劑生生產(chǎn)產(chǎn)廠廠家家的的信信息息廣廣告告參考考同同行行對對有有關(guān)關(guān)試試劑劑盒盒的的使使用用效效果果參考考有有關(guān)關(guān)機(jī)機(jī)構(gòu)構(gòu)的的綜綜合合評評價(jià)價(jià)根據(jù)據(jù)使使用用目目的的根據(jù)據(jù)所所在在實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室室的的技技術(shù)術(shù)特特點(diǎn)點(diǎn)根據(jù)據(jù)所所在在醫(yī)醫(yī)院院患患者者的的承承受受能能力力PCR試劑劑盒盒的的質(zhì)質(zhì)檢檢外包包裝裝：：廠廠家家名名稱稱、、檢檢測測目目的的、、批批準(zhǔn)準(zhǔn)文文號號、、批批號號和和有有效效期期等等。。內(nèi)包包裝裝：：試試劑劑瓶瓶是是否否漏漏液液、、真真空空包包裝裝是是否否破破損損以以、、試試劑劑是是否否齊齊全全以以及及是是否否有有使使用用說說明明書書等等。PCR試劑劑盒盒的的質(zhì)質(zhì)檢檢(定定性性測測定定)性能能質(zhì)質(zhì)檢檢采用用血血清清（（樣樣本本））盤盤（（Panel））質(zhì)檢檢：PCR試試劑劑血血清清（（樣樣本本））盤盤由由一一定定數(shù)數(shù)量量的的原原血血清清陰陰、、陽陽性性樣樣本本、、2～～3份份純純化化核核酸酸（（DNA或或RNA或或cDNA））樣樣本本以以及及3～～5份份系系列列稀稀釋釋陽陽性性樣樣本本所所組組成成。。樣樣本本總總數(shù)數(shù)可可定定在在20份份左左右右。。原血血清清樣樣本本用用于于判判斷斷試試劑劑盒盒對對特特定定病病原原體體核核酸酸檢檢出出的的特特異異性性、、靈靈敏敏度度和和符符合合率率；；純純化化核核酸酸樣樣本本用用于于判判斷斷DNA擴(kuò)擴(kuò)增增或或逆逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄及及DNA擴(kuò)擴(kuò)增增的的有有效效性性；；系系列列稀稀釋釋陽陽性性樣樣本本用用于于判判斷斷試試劑劑的的測測定定下下限限。。試劑特異性、、靈敏度和符符合率計(jì)算算公式式試劑特異性、、靈敏度和符符合率計(jì)算算公式式靈敏度（％））＝(a/a+c)100%特異性（％））＝(d/b+d)100%符合率（％））＝(a+d/a+b+c+d)100%PCR試劑盒的質(zhì)檢檢(定量測定)樣本：已知濃濃度的高、中中、低三種濃濃度質(zhì)控物。。質(zhì)檢內(nèi)容：測測定的重復(fù)性性測定范圍抗干擾能力技術(shù)驗(yàn)收依據(jù)：《臨床檢驗(yàn)擴(kuò)擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室管理暫行行辦法》衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號《臨床基因擴(kuò)擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室工作規(guī)范范》衛(wèi)檢字2002第8號技術(shù)驗(yàn)收內(nèi)容容實(shí)驗(yàn)室設(shè)置和和設(shè)備設(shè)施和環(huán)境人員設(shè)備管理檢測方法標(biāo)本管理記錄報(bào)告質(zhì)量控制抱怨等十章共三十十八條實(shí)驗(yàn)室設(shè)置和和設(shè)備本章共七條。。實(shí)驗(yàn)室分區(qū)：：規(guī)范化分區(qū)區(qū)、明確的識識別標(biāo)記防污染：空氣氣流向、中央央空調(diào)、各區(qū)區(qū)間的封閉性性各區(qū)儀器設(shè)備備物品配備：：充分性、科科學(xué)性、專用用性（標(biāo)識））“生物安全柜柜”“可移動紫外外燈”“加樣器”設(shè)施和環(huán)境本章包括五條條；實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、、工作區(qū)域、、能源、照明明等；環(huán)境和實(shí)驗(yàn)條條件控制設(shè)施施：溫濕度計(jì)、不間斷或穩(wěn)壓壓電源等；實(shí)驗(yàn)室進(jìn)出的的限制和控制制：人員進(jìn)入控制制標(biāo)識、生物物傳染危險(xiǎn)性性標(biāo)識實(shí)驗(yàn)室“內(nèi)務(wù)務(wù)管理”（如如人員流動、、清潔等）制制度和相應(yīng)設(shè)設(shè)施；廢棄血清處理理、生物防護(hù)護(hù)等措施和相相應(yīng)設(shè)施設(shè)施和環(huán)境需需注意的問題題清潔程序或制制度清潔用具的專專用、清潔工工作的單一流流向、清潔方方法的具體性性生物防護(hù)及廢廢棄血清處理理對工作人員的保護(hù)和對環(huán)境的保護(hù)銳器使用規(guī)則生物傳染危險(xiǎn)險(xiǎn)性廢棄物出實(shí)驗(yàn)室前預(yù)處理人員本章包括三條條。人員數(shù)量足夠夠；有培訓(xùn)上上崗證培訓(xùn)計(jì)劃：室內(nèi)的定期期培訓(xùn)（記錄錄）人員技術(shù)（資資格、培訓(xùn)、、技能）檔案案。設(shè)備管理（1）本章包括三條條。主要儀器設(shè)備備應(yīng)得到正確確維護(hù)，應(yīng)有有設(shè)備維護(hù)程程序文件；以以及維護(hù)的記記錄加樣器、溫度度計(jì)、擴(kuò)增儀儀和酶標(biāo)儀等設(shè)設(shè)備應(yīng)有校準(zhǔn)準(zhǔn)程序文件、、有明顯標(biāo)識識表明其校準(zhǔn)準(zhǔn)狀態(tài)（此次次校準(zhǔn)時(shí)間及及下次應(yīng)校準(zhǔn)準(zhǔn)時(shí)間）；實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保存存每一臺儀器器設(shè)備的檔案案材料，對檔檔案材料的具具體內(nèi)容作了了詳細(xì)規(guī)定。。設(shè)備和質(zhì)控物物（2）每一臺設(shè)備的的檔案內(nèi)容包包括：（（a））設(shè)備名稱；；（b）制造造商名稱、型型號、序號等等；（c）接接收日期和啟啟用日期；（（d）目前放放置地點(diǎn)；（（e）接收時(shí)時(shí)的狀態(tài)；（（f）儀器使使用說明書有有復(fù)印件；（（g）校準(zhǔn)和和/或檢定的的日期和結(jié)果果及下次校準(zhǔn)準(zhǔn)和/或檢定定的日期；（（h）迄今所所進(jìn)行的維護(hù)護(hù)和今后維護(hù)護(hù)計(jì)劃的細(xì)節(jié)節(jié)；（i）損損壞、故障、、改裝或修理理的歷史。檢測方法法本章包括三條條。標(biāo)準(zhǔn)操作程序序（SOP））：儀器設(shè)備備操作和校準(zhǔn)程序；標(biāo)本收集處處理程序；擴(kuò)擴(kuò)增檢測工作作程序；儀器器試劑的選購購和質(zhì)檢程序序；消耗性材料的的購買、驗(yàn)收收、質(zhì)檢和貯貯存程序。SOP應(yīng)現(xiàn)行行有效及便于于使用。標(biāo)本管理理本章包括五條條。建立唯一編號識別別系統(tǒng)，避免標(biāo)本混混淆；標(biāo)本采集、運(yùn)運(yùn)送和保存程程序；標(biāo)本接收時(shí)的的狀態(tài)記錄；；標(biāo)本的適用性性和充分性；；標(biāo)本貯存的標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)操作程序序及貯存溫度度控制措施;標(biāo)本接收及安安全處置程序序；維護(hù)實(shí)驗(yàn)室誠誠實(shí)性的必要要措施。記錄本章包括三條條。有記錄管理制制度：適合自自身實(shí)際情況況，符合現(xiàn)行行規(guī)章制度；；（由誰管、在何何處管、保存存多長時(shí)間）原始記錄、計(jì)計(jì)算和導(dǎo)出數(shù)數(shù)據(jù)應(yīng)歸檔并并保存；記錄應(yīng)有有關(guān)關(guān)人員的簽字字；所有記錄和報(bào)報(bào)告都要妥善善保管并保密密。報(bào)告告檢測結(jié)果的報(bào)報(bào)告應(yīng)準(zhǔn)確、、清晰和客觀觀；定性測定報(bào)告告“陰性”或或“陽性”；；定量測定則則以拷貝數(shù)/ml或IU/ml報(bào)報(bào)告；避免二二者之間的混混淆；每份報(bào)告應(yīng)包包括以下信息息：標(biāo)題、唯唯一標(biāo)識、檢檢測標(biāo)本說明明、標(biāo)本特性性和狀態(tài)、標(biāo)標(biāo)本接收日期期和檢測日期期、檢測方法法、檢測和校校核人員簽字字及發(fā)出日期期、參考結(jié)果果或范圍；如對對報(bào)報(bào)告告有有效效性性有有疑疑問問，，實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室室應(yīng)應(yīng)立立即即通通知知臨臨床床相相關(guān)關(guān)科科室室予予以以改改正正的的程程序序；；有報(bào)報(bào)告告的的發(fā)發(fā)放放程程序序：：用電電話話、、傳傳真真、、電電子子郵郵件件報(bào)報(bào)告告結(jié)結(jié)果果時(shí)時(shí)的的保保密密原原則則。。質(zhì)量量控控制制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室室應(yīng)應(yīng)有有室室內(nèi)內(nèi)質(zhì)質(zhì)量量控控制制標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)操操作作程程序序質(zhì)控控物物來來源源、、濃濃度度、、批批號號陰性性質(zhì)質(zhì)控控的的設(shè)設(shè)置置所選選擇擇的的統(tǒng)統(tǒng)計(jì)計(jì)質(zhì)質(zhì)控控方方法法（（均均值值、、SD如如何何得得到到的的））失控控的的判判斷斷標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)失控控以以后后怎怎么么辦辦實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室室應(yīng)應(yīng)參參加加室室間間質(zhì)質(zhì)量量評評價(jià)價(jià)。。抱怨怨實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室室應(yīng)應(yīng)制制定定抱抱怨怨及及其其處處理理的的SOP；；可操操作作性性、、不不同同抱抱怨怨的的處處理理如抱抱怨怨涉涉及及到到工工作作是是