多倍體與轉(zhuǎn)基因動物

第14章多倍體與轉(zhuǎn)基因動物多倍體與轉(zhuǎn)基因動物共26頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!14.1多倍體動物動物多倍體比較少，原因：（1）高等動物遠(yuǎn)源雜交能力很弱，很難形成雜種個體；（2）多倍體動物高度不育，染色體異常通常會千萬胚胎死亡，很難得到多倍體后代。

但低等脊椎動物如魚類、兩棲類和爬行類。多倍體與轉(zhuǎn)基因動物共26頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!多倍體動物

產(chǎn)生原理：染色體的加倍可以通過保留受精卵第二極體即抑制卵子的第二次成熟分裂或抑制受精卵的第 一次卵裂來實現(xiàn)。魚類精子入卵的時期是第二次減數(shù)分裂的中期，刺激卵子繼續(xù)完成第二次分裂。卵中原有的二組染色體中一組作為第二極體排出受精卵成為正常的二倍體。如果在精子入卵時第二極體不能正常排出，則精卵原核結(jié)合成為三倍體受精卵。如果卵子受精后，照常排出第二極體形成單倍體卵，單倍的卵原核與單倍的精原核結(jié)合就形成二倍的受精卵，這時再抑制受精卵的次卵裂，則產(chǎn)生四倍體。多倍體與轉(zhuǎn)基因動物共26頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!（1）溫度休克法：即用略高于或略低于致死溫度的冷或熱休克來誘導(dǎo)三倍體(抑制第二極體排放)或四倍體(抑制次卵裂)的方法。根據(jù)處理溫度的高低分為熱休克法和冷休克法。一般冷水性魚類如蛙科魚類，宜用熱休克，溫度范圍為28℃-36℃;溫水性魚類宜用冷休克，溫度范圍為0-5℃左右。優(yōu)缺點：簡便、廉價，但誘導(dǎo)率較低。多倍體與轉(zhuǎn)基因動物共26頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!B化學(xué)法細(xì)胞松弛素誘導(dǎo)法：細(xì)胞松弛素B(CB)導(dǎo)致極體的保留是通過阻止卵子微絲環(huán)的收縮和極體的分離來實現(xiàn)的。CB處理比其他方法能更有效地誘導(dǎo)三倍體的形成。6-甲氨基嘌呤誘導(dǎo)法：

6–DMAP是一種蛋白激素酶抑制劑。當(dāng)6–DMAP與微管蛋白二聚體結(jié)合以后對微管正常的結(jié)構(gòu)和功能起到了抗有絲分裂的作用，因此可以產(chǎn)生三倍體。C生物法：主要是遠(yuǎn)緣雜交法瑞齊（Rasch）等于1965首先證明了三倍體脊椎動物可通過四倍體個體與二倍體個體雜交產(chǎn)生?；瘜W(xué)法缺點：成功率較低，且對胚胎及操作者有毒性，影響存活。多倍體與轉(zhuǎn)基因動物共26頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!（4）DNA含量測定：染色體組數(shù)與DNA含量成正比。測定單個細(xì)胞的DNA含量，根據(jù)細(xì)胞DNA比較來推斷出細(xì)胞的倍性。如果發(fā)現(xiàn)雜種的DNA含量是其親本的一倍半，就可以確定這些雜種是三倍體。DNA含量測定法快速準(zhǔn)確，能測出嵌合體，但是缺點是需要專門儀器。（3）核體積測量法：一般而言，細(xì)胞核大小與染色體數(shù)目成比例，為了維持恒定的核質(zhì)比例，隨著細(xì)胞核的增大，細(xì)胞大小也按比例增加。因此多倍體細(xì)胞及細(xì)胞核通常要比二倍體大一些。一般通過測定紅細(xì)胞核體積的大小可以鑒定染色體的倍性。缺點是比較費時、準(zhǔn)確性不高。多倍體與轉(zhuǎn)基因動物共26頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!2.轉(zhuǎn)基因動物培育方法（1）

原核期胚胎顯微注射法：幾百KB大片段、應(yīng)用廣泛目的DNA制備（無需構(gòu)建載體）DNA注入原核胚（受精卵雄核）胚胎體外培養(yǎng)胚胎移植（移植前鑒定）發(fā)育出生、鑒定多倍體與轉(zhuǎn)基因動物共26頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!原核期胚胎顯微注射法改進(jìn)為體外受精轉(zhuǎn)基因法多倍體與轉(zhuǎn)基因動物共26頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!（3）精子載體法：精子與外源DNA混合培養(yǎng)，DNA可被吸收進(jìn)入精子頭部，然后再與卵細(xì)胞受精后發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物。（4）逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法：見11.10。（5）卵細(xì)胞顯微注射法：將外源DNA克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上，再顯微注射到MII中期卵細(xì)胞（無核膜），再體外受精，胚胎移植，發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物。多倍體與轉(zhuǎn)基因動物共26頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!Chapter14細(xì)胞工程Copyright?2011WangWeidong,Allrightsreserved.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)－國內(nèi)首例綠色熒光蛋白“轉(zhuǎn)基因”克隆豬

綠色熒光蛋白－豬胎兒成纖維細(xì)胞－克隆多倍體與轉(zhuǎn)基因動物共26頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!目的基因的鑒定：檢查動物體內(nèi)是否有外源基因的存在，以判明是否是轉(zhuǎn)基因動物?？捎镁酆厦告湻磻?yīng)(PCR)、斑點雜交(Dotblot),Southern印跡分析等多種方法進(jìn)行檢測。目的蛋白的鑒定：有活性的目的蛋白的檢測非常重要。檢測方法主要有：

(1)SDS－聚丙烯酰胺凝膠(SDS)(2)酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)(3)Western印跡分析3轉(zhuǎn)基因動物鑒定多倍體與轉(zhuǎn)基因動物共26頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!5轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器（乳腺是最理想的藥物蛋白生產(chǎn)場所）（1）概念：將外源基因置于乳腺特異性調(diào)節(jié)序列之下，使之在乳腺中表達(dá)，然后通過回收乳汁獲得重要價值的生物活性蛋白的技術(shù)。多倍體與轉(zhuǎn)基因動物共26頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳研究所：（1）1998年中國首頭轉(zhuǎn)基因羊。乳汁中表達(dá)人凝血因子IX蛋白。人凝血因子IX是治療血友病的藥物。（2）1999年，帶有人血清白蛋白基因的轉(zhuǎn)基因試管?！疤咸稀苯瞪?。多倍體與轉(zhuǎn)基因動物共26頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!（2）關(guān)鍵環(huán)節(jié)使用合適的乳汁蛋白基因調(diào)控元件，構(gòu)建合理有效的乳腺組織特異性表達(dá)載體。目前應(yīng)用于乳腺特異性表達(dá)載體構(gòu)建的乳蛋白基因及調(diào)控序列的主要有：乳清酸蛋白(WAP）基因及其調(diào)控序列。酪蛋白(Icasein)基因及其調(diào)控序列。β-乳球蛋白(β-lactoglobulin)基因及其調(diào)控序列。乳白蛋白(α-lactalbumin)基因及其調(diào)控序列。多倍體與轉(zhuǎn)基因動物共26頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!1多倍體動物培育方法A物理方法機制主要是通過破壞微管形成，使由微管蛋白聚合成的微管解體或阻止微管的聚合過程，使染色體失去移動的動力，人為抑制染色體向兩極移動，形成多倍體細(xì)胞。多倍體與轉(zhuǎn)基因動物共26頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!（2）水靜壓法：采用較高的水靜壓（如65kg/cm2）可抑制卵母細(xì)胞第二極體的釋放或者抑制次卵裂誘導(dǎo)產(chǎn)生多倍體的方法。原理：靜水壓處理破壞了有絲分裂器中的紡錘絲即紡錘體和星體，從而暫時阻斷了有絲分裂的進(jìn)程。該方法處理程序標(biāo)準(zhǔn)化易于掌握，處理時間短(3-5min)，誘導(dǎo)率較高，對受精卵損傷較小。但需專門的設(shè)備如水壓機等。此外，靜水壓處理還使染色體發(fā)生了不同程度的凝縮，,還可能使受精卵的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些物理和化學(xué)變化，造成發(fā)育受阻，因此在生產(chǎn)中應(yīng)用較少。多倍體與轉(zhuǎn)基因動物共26頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!2多倍體動物的鑒定人工誘導(dǎo)處理過的群體可能是由多倍體、二倍體甚至是多倍體與二倍體構(gòu)成的嵌合體等混合群體，所以需要篩選出需要的多倍體。（2）核仁染色觀察法：一般而言，細(xì)胞核仁數(shù)量與染色體組數(shù)目（倍性）成正比例，通過銀染法檢測胚胎細(xì)胞核仁數(shù)量及分布情況可以鑒定多倍體，直觀、可靠。（1）染色體計數(shù)法：將細(xì)胞固定制片、染色后觀察染色體個數(shù)。由于染色體制片技術(shù)比較成熟，因此該方法仍是目前鑒定多倍體倍性的一種直觀、可靠的方法，缺點是比較費時。多倍體與轉(zhuǎn)基因動物共26頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁!14.2轉(zhuǎn)基因動物1.轉(zhuǎn)基因動物（transgenicanimal）：是指在基因組內(nèi)穩(wěn)定地整合外源基因，并且外源基因可以穩(wěn)定地遺傳給后代的基因工程動物。利用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)人類藥用蛋白、異體器官等非常規(guī)畜牧產(chǎn)品，是目前世界上轉(zhuǎn)基因動物研究的熱點之一。多倍體與轉(zhuǎn)基因動物共26頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁!1980年，Gordon等人首先育成轉(zhuǎn)人生長素基因小鼠。世界個轉(zhuǎn)基因動物。生長速度快2－4倍、體形大一倍的轉(zhuǎn)基因“碩鼠”。發(fā)表在1982年的nature雜志上。原核期胚胎顯微注射法多倍體與轉(zhuǎn)基因動物共26頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁!（2）胚胎干細(xì)胞方法胚胎干細(xì)胞（ES）是一種含正常二倍染色體的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞，因此只要將外源DNA導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞就可以實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。多倍體與轉(zhuǎn)基因動物共26頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁!Chapter14細(xì)胞工程Copyright?2011WangWeidong,Allrightsreserved.反轉(zhuǎn)錄病毒感 染法多倍體與轉(zhuǎn)基因動物共26頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁!Chapter14細(xì)胞工程Copyright?2011WangWeidong,Allrightsreserved.

Geneticallymodifiedanimal

.glofish./GloFish?fluorescentfish,thefirstgenetically modifiedanimaltobesoldasapet多倍體與轉(zhuǎn)基因動物共26頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁!（1）快速生長與肉質(zhì)改善。如轉(zhuǎn)生長素基因的豬生長快，瘦肉率也高。（2）增加羊毛產(chǎn)量和性能。細(xì)菌基因SAT和DAS可以促進(jìn)合成Cys，將該基因轉(zhuǎn)入羊腸胃道上皮細(xì)胞，可提高羊毛產(chǎn)量。若將毛角蛋白II中間細(xì)絲基因轉(zhuǎn)入綿羊基因組中，所產(chǎn)羊毛光澤亮麗、毛脂含量高暖和。（3）抗凍動物品種培育。將魚抗凍蛋白基因AFP轉(zhuǎn)入不耐寒魚或其他動物。4轉(zhuǎn)基因改良動物的應(yīng)用多倍體與轉(zhuǎn)基因動物共26頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁!1987年Gordon等將組織型纖溶酶原激活劑(tPA)與小鼠乳清酸蛋白(WAP)基因的啟動子構(gòu)成重組基因，成功地培育出了37只在乳汁中能表達(dá)tPA的轉(zhuǎn)基因小鼠.2006年6月2日，世界上個利用轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的基因工程蛋白藥物——重組人抗凝血酶Ⅲ（商品名：ATryn）上市獲得批準(zhǔn)。目前，α1-抗胰蛋白酶(AAT)、人乳球蛋白、凝血因子III、IV、VIII、纖維蛋白原、降鈣素、SOD、紅細(xì)胞生成素、IGF-1等成功表達(dá)，多種藥用蛋白已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗階段。多倍體與轉(zhuǎn)基因動物共26頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁!Chapter14細(xì)胞工程Copyright?2011WangWeidong,Allrightsreserved.?1998年上海醫(yī)學(xué)研究所與復(fù)旦大學(xué)遺傳所合作獲得在 乳腺腫表達(dá)有生物活性的人凝血因子I