培養(yǎng)基的制備與滅菌3課件

實驗目錄實驗一:培養(yǎng)基的制作與滅菌技術(shù)(3學時）實驗二:血球計數(shù)板檢測靈芝孢子粉數(shù)量(3學時）實驗三:土壤微生物的分離與計數(shù)(稀釋平板法)(3學時）實驗四:微生物的純化,培養(yǎng)與保種技術(shù)(3學時）實驗五:微生物菌落形態(tài)觀察(1學時）實驗六:微生物大小的測定(2學時）實驗七:革蘭氏染色(3學時）實驗一培養(yǎng)基的制備與滅菌一、目的與要求：1、了解培養(yǎng)基的配制原理，掌握制備培養(yǎng)基的過程。2、學習高壓蒸汽滅菌操作技術(shù)。3、了解干熱滅菌操作要點。

二、原理及說明:培養(yǎng)基是按照微生物生長繁殖所需要的各種營養(yǎng)物質(zhì)，用人工方法配制而成的營養(yǎng)基質(zhì)。一般來說，培養(yǎng)基包括有水份、碳源、氮源、無機鹽類以及生長素等五大類營養(yǎng)成份。此外還得有適宜的PH值，一定的滲透壓（即濃度）以及氧化還原電位等。2、培養(yǎng)基的配制（1）原料稱量、溶解：按下列培養(yǎng)基的配方準確稱取各成分，在容器中加所需水量的一半，然后依次將各種原料加入水中，用玻棒攪拌使之溶解。配制固體培養(yǎng)基時，預先將瓊脂稱好洗凈，然后將液體培養(yǎng)基煮沸，再把瓊脂放入，繼續(xù)加熱至瓊脂完全融化。（2）調(diào)節(jié)PH值用精密的pH試紙測定，并用1%氧化鈉或5%鹽酸調(diào)節(jié)到所需的pH值。（3）過濾和澄清：趁熱用紗布將培養(yǎng)基進行過濾，除去沉渣、顆粒，使之澄清透明。（4）分裝：過濾后根據(jù)不同需要，立即趁熱裝入試管或三角瓶等容器中，分裝如圖：培養(yǎng)基的分裝注意事項：（1）不要使培養(yǎng)基沾在管口，如沾上，需用干凈的紗布擦干凈。（2）液體培養(yǎng)基：分裝高度以試管的1/4左右為宜。（3）固體培養(yǎng)基：分裝試管，其裝量為管高的1/6~1/5滅菌后制成斜面。分裝三角瓶容量之一半為宜。（4）半固體培養(yǎng)基：分裝試管一般以試管高度的1/3為宜，滅菌后，垂直待凝成半固體深層瓊脂。（8）滅菌滅菌是指殺死物品上或環(huán)境中的所有微生物。滅菌方法可分為四種：物理滅菌、機械滅菌、化學滅菌和生物滅菌。物理滅菌：1、熱力滅菌：2、紫外光滅菌：一般應用于無菌室和接種箱的滅菌。原理與區(qū)別基本原理：即通過不同的加熱方法，使微生物體內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性，從而達到滅菌的目的,蛋白質(zhì)的凝固變性與蛋白質(zhì)中含水量的多少有關(guān)，含水量較多者，其凝固所需要的溫度低，反之，含水份較少者需要高溫才能使蛋白質(zhì)凝固。因此殺滅芽孢比殺滅營養(yǎng)體所需的溫度高。干熱滅菌與濕熱滅菌的區(qū)別：在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，因為在濕熱情況下菌體吸收水分，使蛋白質(zhì)易于凝固，同時水蒸汽穿透力強，水蒸汽的導熱性也強。而且當蒸汽與被滅菌的物體接觸凝為水時，又可放出熱量，使被滅菌物體溫度迅速增高，從而增加滅菌效力。高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌鍋是一個耐高壓又密閉的金屬鍋。它是利用在密閉條件下產(chǎn)生高壓蒸汽來達到滅菌的效果。其溫度在100oC以上，有強大的殺菌能力。因此它是一種用途廣泛，效率高的滅菌工具。分類：1、臥式2、立式具體操作步驟：（1）加入適量自來水于滅菌鍋中（至水位線）（2）擺入上述包裝好的待滅菌的培養(yǎng)基，注意：不要擺得太擠，以免影響蒸汽流通和滅菌效果。（3）加蓋旋緊螺旋，使蒸汽鍋密閉不漏氣（對角線均勻擰旋）（4）打開放氣閥，打開電源，自開始產(chǎn)生蒸汽后10min（此時蒸汽鍋內(nèi)的冷空氣由排氣閥排盡）關(guān)緊放氣閥，讓溫度隨蒸汽壓力上升而上升，當達所需壓力時（15磅/平方英寸）控制熱源維持所需時間（30min）然后停止加熱，讓其自然冷卻。（5）待壓力降至0磅時，打開排氣閥，再打開鍋蓋，取出滅菌物。注意：壓力未降至0磅時，切勿打開鍋蓋，否則突然降壓，招致培養(yǎng)基沸騰，沾濕棉塞，甚至沖出管外。（6）自鍋中取出滅菌好的培養(yǎng)基，放置稍冷卻后擺成斜面，而后至37oC恒溫箱培養(yǎng)24h，無菌生長，方可保存?zhèn)溆?。應用此法滅菌是否徹底的一個重要關(guān)鍵是在壓力上升之前，必須將鍋內(nèi)的冷空氣完全排盡，否則雖然壓力表已指15磅/平方英寸（1.055kg/cm2,121.6℃）時，但鍋內(nèi)的溫度還只有100oC，結(jié)果往往造成滅菌不徹底。斜面擺放示意圖：移液管、培養(yǎng)皿的干熱滅菌：（1）在移液管尾部塞上少許脫脂棉花，然后用報紙條包好。（2）用報紙條包好干燥的培養(yǎng)皿。（3）將已包好的移液管、培養(yǎng)皿放入電烘箱干熱滅菌。干熱滅菌是在恒溫電箱中進行，它是利用高熱空氣來達到滅菌效果，因此稱干熱滅菌。適合玻璃器皿和金屬用具的滅菌。帶有膠皮的物品，含水份的物質(zhì)，培養(yǎng)基等不可用這種方法。操作步驟：（1）將待滅菌物品包扎好，均勻放入烘箱內(nèi)，注意不要擺的太擠，以免妨礙氣流流通。（2）打開鼓風機、開啟電源，當溫度100oC時，關(guān)閉通氣孔，調(diào)溫度至160oC，借恒溫調(diào)節(jié)器的自動控制調(diào)節(jié)器，保持此溫度1~2小時。（3）中斷電源，待溫度降至60oC以下時，打開箱門，取出滅菌物品。培養(yǎng)基配制步驟與配方：1、稱藥:量小不易稱量,可先配成高濃度的溶液再按比例稀釋2、溶化:不易溶解的,可先用小容器溶解,或溶于其他溶劑3、pH值:用1%NaOH或用1%HCl調(diào),當配大量培養(yǎng)基時可用10%NaOH或用10%HCl調(diào),配制酸度高(低于pH值3-4)時,應該在凝固前將適量經(jīng)過滅菌過的酸加在培養(yǎng)基中,否則不凝固4、過濾5、分裝6、做棉塞P587、包裝8、滅菌滅菌對培養(yǎng)基的影響酸度的變化,碳水化合物的水解,葡萄糖發(fā)生的反應,沉淀的產(chǎn)生梅拉特反應:葡萄糖與氨基酸反應而使氨基酸失效鐵離子與磷酸鹽很容易生成沉淀,常需分開滅菌思考作業(yè)題：1、總結(jié)一下，配制培養(yǎng)基應注意哪些問題。2、高壓滅菌的關(guān)鍵是什么？3、干燥滅菌為何要比濕熱高溫蒸汽滅菌所需的溫度高，時間長?4、為何配制培養(yǎng)基后要調(diào)節(jié)PH值？培養(yǎng)基配制步驟與配方：NA牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(培養(yǎng)細菌)：牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5g瓊脂20g水1000mlPH7.0~7.2

121oC滅菌20分鐘淀粉硝酸鉀培養(yǎng)基（高澤氏1號）淀粉20.0g、硝酸鉀1.0g、磷酸二氫鉀0.5g、硫酸鎂0.5g、氯化鈉0.5g、