DNA重組技術(shù)的基本工具概述經(jīng)典課件

專題一基因工程專題一基因工程

假如你是一位育種專家，你能培育出下面幾種“生物”嗎？請(qǐng)問(wèn)你準(zhǔn)備用什么方法？假如你是一位育種專家，你能培育出下面幾種“生物”嗎？請(qǐng)問(wèn)你這些定向改造基因的設(shè)想能實(shí)現(xiàn)嗎？經(jīng)過(guò)多年的努力，科學(xué)家終于在20世紀(jì)70年代創(chuàng)立了可以定向改造生物的新技術(shù)

——基因工程這些定向改造基因的設(shè)想能實(shí)現(xiàn)嗎？經(jīng)過(guò)多年的努力，科學(xué)家終于在一.基因工程的概念DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平定向改造生物基因重組

基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的。因此又叫做DNA重組技術(shù)。

一.基因工程的概念DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平定1.1DNA重組技術(shù)的基本工具三種基本工具剪刀針線運(yùn)輸車限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶運(yùn)載體1.1DNA重組技術(shù)的基本工具三種基本工具剪刀針線運(yùn)輸車問(wèn)題探討：蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲(chóng)棉問(wèn)題探討：蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲(chóng)棉基因工程培育抗蟲(chóng)棉的簡(jiǎn)要過(guò)程普通棉花(無(wú)抗蟲(chóng)特性)蘇云金芽孢桿菌（有抗蟲(chóng)性狀）提取抗蟲(chóng)基因棉花細(xì)胞(含抗蟲(chóng)基因)棉花植株(有抗蟲(chóng)特性)重組DNA導(dǎo)入形成培育抗蟲(chóng)棉的關(guān)鍵步驟有哪些？基因工程培育抗蟲(chóng)棉的簡(jiǎn)要過(guò)程普通棉花(無(wú)抗蟲(chóng)特性)蘇云金芽孢基因工程培育抗蟲(chóng)棉的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲(chóng)基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來(lái)關(guān)鍵步驟二：抗蟲(chóng)基因與DNA“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲(chóng)基因進(jìn)入棉花細(xì)胞“分子手術(shù)刀”—限制性核酸內(nèi)切酶“分子縫合針”—DNA連接酶“分子運(yùn)輸車”—基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體基因工程培育抗蟲(chóng)棉的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲(chóng)基因從蘇云金芽⒈主要來(lái)源：（1）限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”原核生物限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。簡(jiǎn)稱：限制酶分布：主要在原核生物中你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？二.基因工程的工具⒈主要來(lái)源：（1）限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”原核生物原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來(lái)病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。限制酶在原核生物中的作用原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中T磷酸二酯鍵1234512345A2、作用特點(diǎn)：T磷酸二酯鍵1234512345A2、作用特點(diǎn)：DNA重組技術(shù)的基本工具概述經(jīng)典課件2、作用特點(diǎn)：識(shí)別特定核苷酸序列,切斷兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。具有特異性。一種限制酶一般只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點(diǎn)上切割DNA分子。（1）限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”3、限制酶識(shí)別序列大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由6個(gè)核苷酸組成少數(shù)的識(shí)別序列由4、5或8個(gè)核苷酸組成2、作用特點(diǎn)：識(shí)別特定核苷酸序列,切斷兩個(gè)具有特異性。一種限思考與探究P72、為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？

通過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化，含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開(kāi)。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。思考與探究P72、為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？

限制酶所識(shí)別的序列，無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線（如圖），中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向、對(duì)稱、重復(fù)排列的。想一想限制酶所識(shí)別的序列有什么特點(diǎn)？限制酶所識(shí)別的序列，無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿限制酶所識(shí)別的序列的特點(diǎn)

中心軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。EcoRⅠSmaⅠ3、限制性核酸內(nèi)切酶的作用特點(diǎn)能識(shí)別特定核苷酸序列；（專一性）限制酶所識(shí)別的序列的特點(diǎn)中心軸線兩側(cè)的雙鏈DNA3、限制性核酸內(nèi)切酶的作用特點(diǎn)：②從特定部位的兩

個(gè)核苷酸之間切開(kāi)。（切點(diǎn)：磷酸二酯鍵）T1234512345A（專一性）3、限制性核酸內(nèi)切酶的作用特點(diǎn)：T1234512345DNA重組技術(shù)的基本工具概述經(jīng)典課件SmaⅠ平末端平末端4.限制酶的作用結(jié)果：SmaⅠ平末端平末端4.限制酶的作用結(jié)果：

EcoRⅠ黏性末端黏性末端4.限制酶的作用結(jié)果：EcoRⅠ黏性末端黏性末端4.限制酶的作用結(jié)果：

EcoRⅠ黏性末端黏性末端重復(fù)演示EcoRⅠ黏性末端黏性末端重復(fù)演示

EcoRⅠ黏性末端黏性末端

大腸桿菌(E.coli)的一種限制酶EcoRΙ能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開(kāi)。EcoRⅠ黏性末端黏性末端大腸桿菌什么叫黏性末端？

被限制酶切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。什么叫黏性末端？被限制酶切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切SmaⅠ平末端平末端限制酶SmaΙ能識(shí)別GGGCCC序列，并在G和C之間切開(kāi)。SmaⅠ平末端平末端限制酶SmaΙ能識(shí)別GGGCCC序平末端

當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開(kāi)時(shí)，切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。平末端當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開(kāi)時(shí)，切開(kāi)的……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同來(lái)源的DNA片段混合將不同種來(lái)源的DNA片段連接起來(lái)生物A基因片段生物B基因片段……G

AATTC…………CTTAA

G…………G

AATTC…………CTTAA

G……酶切……GAATTC…………GAATTC……EcoRⅠ……GAA（1）限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”4.作用結(jié)果：產(chǎn)生黏性末端或平末端（1）限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”4.作用結(jié)果：產(chǎn)生黏要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性(平)末端？要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性(平)末端。如果把兩種來(lái)源不同的DNA用同一種限制酶來(lái)切割，會(huì)怎樣呢？

會(huì)產(chǎn)生相同的黏性(平)末端，然后讓兩者的黏性(平)末端黏合起來(lái)，就似乎可以合成重組的DNA分子了。思考?要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾（2）“分子縫合針”——DNA連接酶①作用:

把切下來(lái)的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來(lái).②作用原理：恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵（2）“分子縫合針”——DNA連接酶①作用:

可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，E·co

T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，但效率較低T4DNA連接酶T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，但效③類型：E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來(lái)源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點(diǎn)差別（2）“分子縫合針”——DNA連接酶③類型：E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來(lái)源功能大腸DNA連接酶尋根問(wèn)底P6DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?DNA連接酶尋根問(wèn)底P6DNA連接酶與DNA聚合酶是一回AG

T

AC

TA

A

T

DNA母鏈DNA聚合酶DNA聚合酶TTAGATATCCGACGGTTTAA……………………………………………………AGTACTAATDNADNA聚合酶DNA聚合酶1)只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵1)在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵2)以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵連接成一條互補(bǔ)的DNA鏈2)能將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來(lái)，不需要模板1)只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵形【探規(guī)尋律】幾種酶的作用部位限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶、DNA聚合酶作用于①部位,DNA解旋酶作用于②部位?！咎揭?guī)尋律】幾種酶的作用部位（3）“分子運(yùn)輸車”

——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體⒈載體需要的條件：

⑴有1~多個(gè)限制酶切點(diǎn)

⑵對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害

⑶導(dǎo)入基因能在受體細(xì)胞中復(fù)制、表達(dá)

⑷有某些標(biāo)記基因，便于篩選⒉常用運(yùn)載體：

⑴質(zhì)粒

⑵動(dòng)植物病毒

（3）λ噬菌體的衍生物

⑶假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制或不能轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)基因生物能有預(yù)想的效果嗎？

⑴作為分子運(yùn)輸車——載體，如果沒(méi)有切割位點(diǎn)將會(huì)怎樣？

⑵霍亂菌的質(zhì)粒多個(gè)限制酶切點(diǎn)，你會(huì)用它來(lái)做分子運(yùn)輸車嗎？

⑷目的基因有沒(méi)有進(jìn)入受體細(xì)胞，如何去發(fā)現(xiàn)？

（最常用）（3）“分子運(yùn)輸車”

—

質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，并且有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，并且DNA重組技術(shù)的基本工具概述經(jīng)典課件常用的載體質(zhì)粒：能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有切割位點(diǎn)有標(biāo)記基因的存在，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基鑒別獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外的一種可以自我復(fù)制的小型環(huán)狀的DNA分子常用的載體質(zhì)粒：能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有切割位點(diǎn)1）載體DNA必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點(diǎn)所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。2）載體DNA必需具備自我復(fù)制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。3）載體DNA必需帶有標(biāo)記基因，以便重組后進(jìn)行重組子的篩選。4）載體DNA必需是安全的，不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害，或不能進(jìn)入到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。5）載體DNA分子大小應(yīng)適合，以便提取和在體外進(jìn)行操作，太大就不便操作。實(shí)際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。1）載體DNA必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目的基小結(jié)基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有專一性(識(shí)別序列)切開(kāi)DNA分子的磷酸二酯鍵產(chǎn)生黏末端或平末端DNA連接酶連接磷酸二酯鍵種類E.coliDNA連接酶T4

DNA連接酶運(yùn)載工具具備的條件能在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定存在具一種至多種限制酶切點(diǎn)具標(biāo)記基因質(zhì)粒、λ噬菌體衍生物、動(dòng)植物病毒小結(jié)基因工程限制酶主要存在于原核生物中DNA連連接磷酸二酯基因工程的基本操作程序1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定基因工程的基本操作程序1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)1.限制酶在DNA的任何部位都能將DNA切開(kāi)嗎？以下是四種不同限制酶切割形成的DNA片段:你是否能用DNA連接酶將它們連接起來(lái)？…CTGCA

…G

①…AC…TG②

CG…GC…③…G

…CTTAA

④G…

ACGTC…

⑤…GC…CG⑥GT…

CA…

⑦AATTC…G…⑧②和⑦能連接形成…AC…TGGT…

CA…

④和⑧能連接形成…G

…CTTAA

AATTC…G…

CG…GC…

…GC…CG

③和⑥能連接形成①和⑤能連接形成…CTGCA

…G

G…

ACGTC…

反向?qū)ΨQ思考與探究P71.限制酶在DNA的任何部位都能將DNA切開(kāi)嗎？以下是四種不1.個(gè)人墜落防護(hù)系統(tǒng)是用來(lái)把工作人員與固定掛點(diǎn)連接起來(lái)所必需的一整套產(chǎn)品，可完全防止出現(xiàn)從高處墜落的情況或是能完全地制止這種情況的發(fā)生。2.單獨(dú)使用這些產(chǎn)品不能對(duì)墜落提供防護(hù)。但是，如果這些構(gòu)件能夠良好的組合在一起，那么它們將形成一種對(duì)工作場(chǎng)所的安全和整體的墜落防護(hù)計(jì)劃都極其重要的個(gè)人墜落防護(hù)系統(tǒng)。3.如果安全繩沒(méi)有垂直地固定在工作場(chǎng)所上方，發(fā)生墜落時(shí)將使得工人在空中出現(xiàn)搖擺，并可能撞到其他物體上或撞到地面造成傷害。4.一個(gè)有才能的領(lǐng)導(dǎo)者會(huì)給所在的團(tuán)隊(duì)或組織帶來(lái)成功的希望，使人們對(duì)他產(chǎn)生一種敬佩感。敬佩感是一種心理磁鐵，它會(huì)吸引人們自覺(jué)去接受影響力。5.老虎型給他明確方向的語(yǔ)言、讓他知道做這件事對(duì)他的好處，說(shuō)話中要給他很肯定的感覺(jué)，不要懷疑他或不放心，直接說(shuō)明不要拐彎抹角，請(qǐng)他記錄彼此溝通的內(nèi)容。6.孔雀型先聊輕松的話題再進(jìn)入主題、運(yùn)用圖畫方式進(jìn)行溝通，對(duì)于事情就事論事不責(zé)罵當(dāng)事人，給他贊揚(yáng)及鼓勵(lì)，多運(yùn)用一些肢休語(yǔ)言，可到熱鬧場(chǎng)合進(jìn)行洽談。7.無(wú)尾熊型不要強(qiáng)勢(shì)與他溝通，溝通中運(yùn)用一些溫馨的語(yǔ)言，可聊聊天再進(jìn)入主題，交待任務(wù)不要一次太多，讓他知道你會(huì)協(xié)助他，經(jīng)常尋問(wèn)這事情的進(jìn)展，讓他知道在溝通中不要有所忌諱。8.貓頭鷹型不要強(qiáng)勢(shì)與他溝通，交待任務(wù)最好自行確認(rèn)后再說(shuō)，不講不實(shí)際的事不說(shuō)沒(méi)有憑證的話，說(shuō)話要完整化，任務(wù)分配時(shí)可分解數(shù)項(xiàng)告知，讓他知道事情做完的成敗會(huì)有人負(fù)責(zé)，對(duì)事不對(duì)人，不要批評(píng)他的專業(yè)。演示完畢，感謝聆聽(tīng)！1.個(gè)人墜落防護(hù)系統(tǒng)是用來(lái)把工作人員與固定掛點(diǎn)連接起來(lái)所必需專題一基因工程專題一基因工程

假如你是一位育種專家，你能培育出下面幾種“生物”嗎？請(qǐng)問(wèn)你準(zhǔn)備用什么方法？假如你是一位育種專家，你能培育出下面幾種“生物”嗎？請(qǐng)問(wèn)你這些定向改造基因的設(shè)想能實(shí)現(xiàn)嗎？經(jīng)過(guò)多年的努力，科學(xué)家終于在20世紀(jì)70年代創(chuàng)立了可以定向改造生物的新技術(shù)

——基因工程這些定向改造基因的設(shè)想能實(shí)現(xiàn)嗎？經(jīng)過(guò)多年的努力，科學(xué)家終于在一.基因工程的概念DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平定向改造生物基因重組

基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的。因此又叫做DNA重組技術(shù)。

一.基因工程的概念DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平定1.1DNA重組技術(shù)的基本工具三種基本工具剪刀針線運(yùn)輸車限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶運(yùn)載體1.1DNA重組技術(shù)的基本工具三種基本工具剪刀針線運(yùn)輸車問(wèn)題探討：蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲(chóng)棉問(wèn)題探討：蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲(chóng)棉基因工程培育抗蟲(chóng)棉的簡(jiǎn)要過(guò)程普通棉花(無(wú)抗蟲(chóng)特性)蘇云金芽孢桿菌（有抗蟲(chóng)性狀）提取抗蟲(chóng)基因棉花細(xì)胞(含抗蟲(chóng)基因)棉花植株(有抗蟲(chóng)特性)重組DNA導(dǎo)入形成培育抗蟲(chóng)棉的關(guān)鍵步驟有哪些？基因工程培育抗蟲(chóng)棉的簡(jiǎn)要過(guò)程普通棉花(無(wú)抗蟲(chóng)特性)蘇云金芽孢基因工程培育抗蟲(chóng)棉的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲(chóng)基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來(lái)關(guān)鍵步驟二：抗蟲(chóng)基因與DNA“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲(chóng)基因進(jìn)入棉花細(xì)胞“分子手術(shù)刀”—限制性核酸內(nèi)切酶“分子縫合針”—DNA連接酶“分子運(yùn)輸車”—基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體基因工程培育抗蟲(chóng)棉的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲(chóng)基因從蘇云金芽⒈主要來(lái)源：（1）限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”原核生物限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。簡(jiǎn)稱：限制酶分布：主要在原核生物中你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？二.基因工程的工具⒈主要來(lái)源：（1）限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”原核生物原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來(lái)病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。限制酶在原核生物中的作用原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中T磷酸二酯鍵1234512345A2、作用特點(diǎn)：T磷酸二酯鍵1234512345A2、作用特點(diǎn)：DNA重組技術(shù)的基本工具概述經(jīng)典課件2、作用特點(diǎn)：識(shí)別特定核苷酸序列,切斷兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。具有特異性。一種限制酶一般只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點(diǎn)上切割DNA分子。（1）限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”3、限制酶識(shí)別序列大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由6個(gè)核苷酸組成少數(shù)的識(shí)別序列由4、5或8個(gè)核苷酸組成2、作用特點(diǎn)：識(shí)別特定核苷酸序列,切斷兩個(gè)具有特異性。一種限思考與探究P72、為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？

通過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化，含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開(kāi)。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。思考與探究P72、為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？

限制酶所識(shí)別的序列，無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線（如圖），中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向、對(duì)稱、重復(fù)排列的。想一想限制酶所識(shí)別的序列有什么特點(diǎn)？限制酶所識(shí)別的序列，無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿限制酶所識(shí)別的序列的特點(diǎn)

中心軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。EcoRⅠSmaⅠ3、限制性核酸內(nèi)切酶的作用特點(diǎn)能識(shí)別特定核苷酸序列；（專一性）限制酶所識(shí)別的序列的特點(diǎn)中心軸線兩側(cè)的雙鏈DNA3、限制性核酸內(nèi)切酶的作用特點(diǎn)：②從特定部位的兩

個(gè)核苷酸之間切開(kāi)。（切點(diǎn)：磷酸二酯鍵）T1234512345A（專一性）3、限制性核酸內(nèi)切酶的作用特點(diǎn)：T1234512345DNA重組技術(shù)的基本工具概述經(jīng)典課件SmaⅠ平末端平末端4.限制酶的作用結(jié)果：SmaⅠ平末端平末端4.限制酶的作用結(jié)果：

EcoRⅠ黏性末端黏性末端4.限制酶的作用結(jié)果：EcoRⅠ黏性末端黏性末端4.限制酶的作用結(jié)果：

EcoRⅠ黏性末端黏性末端重復(fù)演示EcoRⅠ黏性末端黏性末端重復(fù)演示

EcoRⅠ黏性末端黏性末端

大腸桿菌(E.coli)的一種限制酶EcoRΙ能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開(kāi)。EcoRⅠ黏性末端黏性末端大腸桿菌什么叫黏性末端？

被限制酶切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。什么叫黏性末端？被限制酶切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切SmaⅠ平末端平末端限制酶SmaΙ能識(shí)別GGGCCC序列，并在G和C之間切開(kāi)。SmaⅠ平末端平末端限制酶SmaΙ能識(shí)別GGGCCC序平末端

當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開(kāi)時(shí)，切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。平末端當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開(kāi)時(shí)，切開(kāi)的……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同來(lái)源的DNA片段混合將不同種來(lái)源的DNA片段連接起來(lái)生物A基因片段生物B基因片段……G

AATTC…………CTTAA

G…………G

AATTC…………CTTAA

G……酶切……GAATTC…………GAATTC……EcoRⅠ……GAA（1）限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”4.作用結(jié)果：產(chǎn)生黏性末端或平末端（1）限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”4.作用結(jié)果：產(chǎn)生黏要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性(平)末端？要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性(平)末端。如果把兩種來(lái)源不同的DNA用同一種限制酶來(lái)切割，會(huì)怎樣呢？

會(huì)產(chǎn)生相同的黏性(平)末端，然后讓兩者的黏性(平)末端黏合起來(lái)，就似乎可以合成重組的DNA分子了。思考?要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾（2）“分子縫合針”——DNA連接酶①作用:

把切下來(lái)的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來(lái).②作用原理：恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵（2）“分子縫合針”——DNA連接酶①作用:

可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，E·co

T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，但效率較低T4DNA連接酶T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，但效③類型：E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來(lái)源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點(diǎn)差別（2）“分子縫合針”——DNA連接酶③類型：E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來(lái)源功能大腸DNA連接酶尋根問(wèn)底P6DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?DNA連接酶尋根問(wèn)底P6DNA連接酶與DNA聚合酶是一回AG

T

AC

TA

A

T

DNA母鏈DNA聚合酶DNA聚合酶TTAGATATCCGACGGTTTAA……………………………………………………AGTACTAATDNADNA聚合酶DNA聚合酶1)只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵1)在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵2)以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵連接成一條互補(bǔ)的DNA鏈2)能將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來(lái)，不需要模板1)只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵形【探規(guī)尋律】幾種酶的作用部位限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶、DNA聚合酶作用于①部位,DNA解旋酶作用于②部位?！咎揭?guī)尋律】幾種酶的作用部位（3）“分子運(yùn)輸車”

——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體⒈載體需要的條件：

⑴有1~多個(gè)限制酶切點(diǎn)

⑵對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害

⑶導(dǎo)入基因能在受體細(xì)胞中復(fù)制、表達(dá)

⑷有某些標(biāo)記基因，便于篩選⒉常用運(yùn)載體：

⑴質(zhì)粒

⑵動(dòng)植物病毒

（3）λ噬菌體的衍生物

⑶假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制或不能轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)基因生物能有預(yù)想的效果嗎？

⑴作為分子運(yùn)輸車——載體，如果沒(méi)有切割位點(diǎn)將會(huì)怎樣？

⑵霍亂菌的質(zhì)粒多個(gè)限制酶切點(diǎn)，你會(huì)用它來(lái)做分子運(yùn)輸車嗎？

⑷目的基因有沒(méi)有進(jìn)入受體細(xì)胞，如何去發(fā)現(xiàn)？

（最常用）（3）“分子運(yùn)輸車”

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質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，并且有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，并且DNA重組技術(shù)的基本工具概述經(jīng)典課件常用的載體質(zhì)粒：能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有切割位點(diǎn)有標(biāo)記基因的存在，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基鑒別獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外的一種可以自我復(fù)制的小型環(huán)狀的DNA分子常用的載體質(zhì)粒：能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有切割位點(diǎn)1）載體DNA必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點(diǎn)所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。2）載體DNA必需具備自我復(fù)制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。3）載體DNA必需帶有標(biāo)記基因，以便重組后進(jìn)行重組子的篩選。4）載體DNA必需是安全的，不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害，或不能進(jìn)入到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。5）載體DNA分子大小應(yīng)適合，以便提取和在體外進(jìn)行操作，太大就不便操作。實(shí)際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。1）載體DNA必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目的基小結(jié)基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有專一性(識(shí)別序列)切開(kāi)DN